Screenable 생체 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석 예쁜 꼬마 선충

다음 실험의 전반적인 목표는 모델 유기체를 사용하여 미토콘드리아 독성 또는 약물의 유익한 효과를 확인하는 것입니다. C 우아함. 이는 녹색 형광 단백질에 융합된 반딧불이 십자화과 효소를 발현하는 형질전환 바다 엘간 균주에서 TP 수준의 생체 내 정량화를 통해 달성됩니다.

융합 유전자는 선충에 두 가지 뚜렷한 특성을 부여합니다. 첫 번째는 기질 루시퍼(Lucifer)가 주어졌을 때, 선충은 세포 A TP 비축량에 비례하여 가시 범위의 빛을 방출한다는 것입니다. 두 번째는 적절한 파장으로 조명되면 강한 녹색 형광을 나타낸다는 것입니다.

형광은 선충의 TP 수준과 무관하며 질량 또는 수에 비례합니다. 따라서 생물 발광 측정을 정규화하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적인 분석 동안, 발달적으로 동기화된 벌레의 개체군은 L 4개의 유충 단계로 성장합니다.

그런 다음 선충은 형광과 생물 발광을 모두 측정하기 전에 일정 기간 동안 테스트 약물 화합물로 처리됩니다. 결과는 잠재적인 약물 독성을 보여줍니다. 생물 발광이 감소하면 향상된 신호는 미토콘드리아 기능에 대한 유익한 효과에 대한 추가 테스트가 필요하다는 것을 나타냅니다.

배양된 세포에 대한 약물 스크리닝과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 스크리닝이 인간에게 거의 50%에 가까운 유전적 안과를 가진 전체 살아있는 다세포 유기체의 생리학적 맥락에서 수행된다는 것입니다. 그리고 인간과 마찬가지로, 우아함은 실제로 성인으로 발달하기 위해 미토콘드리아 산화 인산화를 필요로하며 그 미토콘드리아는 또한 포유류 미토콘드리아와 구조, 기능, 생물 에너지학 측면에서 많은 특성을 공유합니다 프로토콜 내의 중요한 매개 변수에는 노출이 선충에 대한 노출 기간을 시작한 발달 단계가 포함됩니다. 관심의 약물과 각 우물에 비슷한 수의 선충의 파종, 그리고 물론, 오염 회피 첫날에. 무균 상태에서 2밀리리터의 S complete 배지에 있는 6cm 선충 성장 배지 플레이트 1개에서 선충을 리터당 30g의 대장균이 들어 있는 플라스크로 옮깁니다.

OP 50 in S complete medium, 그런 다음 4일째에 흔들면서 플라스크를 배양하고 GR 선충의 배양을 표백하여 알을 수확하고 벌레 개체군을 동기화합니다. 그런 다음 15 밀리리터의 S 완전 배지가 들어있는 유리 플라스크에서 밤새 알을 부화시키고 다음 날, 5 일째에 흔들면 선충은 동일한 성장 단계에있을 것입니다. 매번 깨끗한 팁을 사용하여 부화한 벌레의 수를 확인하려면 100마이크로리터 분취량의 선충 표본 3개를 900마이크로리터의 배지가 들어 있는 별도의 마이크로 튜브로 옮기고 0.01% 트윈 20회 피펫팅을 몇 번 위아래로 하여 팁에 부착된 벌레를 방출합니다.

그런 다음 각 3배 희석 튜브에서 4개의 개별 10마이크로리터 방울에 있는 선충을 세고, 10마이크로리터당 10개의 선충이 있는 2개의 20ml 배양물을 설정하는 데 필요한 선충 현탁액의 부피를 계산하고, 미리 계량된 15밀리리터 원뿔형 튜브 2개에 대략적인 부피를 디캔트합니다. 튜브의 무게를 측정하여 분배된 실제 부피를 확인합니다. 그런 다음 목표 볼륨을 조정하려면 와류를 부드럽게 조정하고 과도한 볼륨을 제거합니다.

이제 총 14 밀리리터의 신선한 S로 선충을 세척하고 튜브 당 완전한 매체 및 resus는 펠릿을 5 밀리리터의 S 완전 매체에 30 그램의 이퀄리로 현탁시킵니다. OP 50. 선충을 15밀리리터의 S가 함유된 원뿔형 유리 플라스크로 옮기고 1리터당 30g의 이퀄리를 완성합니다.

OP 50을 플라스크 당 총 20 밀리리터로 공급하고 공급 시간을 기록합니다. 9개의 10마이크로리터 방울에 있는 선충의 수를 평균하여 배양물이 10마이크로리터당 10개의 선충으로 희석되었는지 확인합니다. 배양물을 42-44시간 동안 배양기에 넣습니다.

7일째에 선충 배양물을 계속해서 부드럽게 소용돌이치면서 하나의 플라스크로 끌어당깁니다. 그런 다음 3, 4 밀리리터의 선충 분취액을 하나의 60 밀리리터 멸균 통으로 옮깁니다. Eloqua에 8채널 피펫을 사용하여 웰당 25마이크로리터의 부유 선충을 96개로 만듭니다.

바닥이 평평하고 투명한 웰 블랙 마이크로타이터 플레이트. 그런 다음 뚜껑을 접시에 다시 넣고 접시를 따로 보관하십시오. 두 개의 플레이트를 파종할 때마다 2.5ml의 선충 분취액을 추가로 2개 더 여유로 옮겨 손실된 부피를 대체합니다.

선충으로 13-14개의 플레이트를 파종한 후 각 웰에 74마이크로리터의 S complete medium을 추가하고 플레이트가 흔들리는 동안 약물 투여가 완료될 때까지 플레이트를 습한 챔버와 진탕 인큐베이터로 옮깁니다. 테스트를 위해 2 96 용접 약물 플레이트를 해동합니다. 그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하고 매번 팁을 교체하십시오.

첫 번째 약물 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 선충 플레이트의 1-5열로 1마이크로리터를 이동합니다. 약물 플레이트의 두 번째 열에서 선충 플레이트의 8-12열로 또 다른 마이크로리터를 옮깁니다. 그런 다음 1마이크로리터의 차량을 선충 플레이트의 6열과 7열에 추가합니다.

약물 플레이트의 나머지 열을 사용하여 나머지 선충 플레이트를 동일한 방식으로 처리하고, 두 개의 모든 차량 처리 플레이트도 포함해야 합니다. 그런 다음 모든 플레이트를 진탕 인큐베이터의 축축한 챔버로 다시 8일째 20-22시간 동안 반환합니다. 형광 판독을 위한 배경 제어 플레이트를 준비하려면 모든 차량 처리된 선충 플레이트의 웰 내용물을 결합하고 선충이 2-3분 동안 침전되도록 합니다.

그런 다음 snat이 포함된 박테리아를 수집하고 바닥이 투명한 검은색 마이크로플레이트의 각 웰에 100마이크로리터 샘플을 로드합니다. 현미경으로 플레이트를 관찰하고, 형광 배경 추정치에서 이러한 우물을 제외할 수 있도록 선충을 볼 수 있는 우물을 주목합니다. 그런 다음 마지막으로 형광을 읽어 각 판의 생물 발광을 측정합니다.

차례로, 갓 준비한 발광 버퍼 50마이크로리터를 각각에 분배하고, 플레이트를 흔들리는 플랫폼에 잘 놓고 3분 후에 타이머를 시작합니다. 측정당 1초에 걸쳐 발광을 읽습니다. 이 첫 번째 대표적인 실험에서, 미토콘드리아 복합체 억제제로 알려진 부패는 농도 범위에서 상대적으로 짧고 긴 노출 후 선충에 의한 광 방출을 감소시켰습니다.

이 실험에서 제초제 파라콰트는 C 균주 PE 2 54의 생물 발광 GFP 형광 및 정규화된 생물 발광을 현저히 감소시키는 것으로 입증되었습니다. 또한, 생물 발광 감소는 형광의 감소보다 컸으며, 이는 미토콘드리아 기능 감소의 알려진 효과와 일치하고 약물에 의해 유도된 TP 생산을 감소시켰습니다. 이 그래프는 선충 생물 발광을 향상시키는 화합물, 즉 8 밀리 몰의 단일 농도에서 구연산 순환 중간 옥살로 아세테이트의 예를 보여줍니다.

이러한 반복 실행 간에 나타나는 실험적 변동성은 Lucifer 기반 실험에서 드문 일이 아닙니다. 여기서, 반딧불이 루시퍼라제 억제 화합물은 DDD 화합물에 의한 활성의 거의 완전한 감쇠와 함께 25마이크로몰 및 100마이크로몰에서 시험관 내 루시퍼 활성에 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다. 1, 4, 3, 4, 직접적으로 비교할 수는 없지만, 생체 내에서 루시퍼 억제 화합물 처리 후에도 생물 발광의 현저한 감소가 관찰되었습니다.

생물 발광의 변화가 in vivo A TP 수준의 변화보다는 루시퍼 효소 억제제의 작용으로 인해 발생할 수 있음을 입증합니다. 이 절차를 수행하는 동안 화합물이 반딧불이의 에너지 상태에 영향을 미치는 것이 아니라 반딧불이 루시페라아제 효소의 활동에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 많은 기술을 사용하여 서브 히트를 검증할 수 있습니다., 예를 들어, 산소 소비량 측정, 활성 산소 종의 미토콘드리아 막 전위 결정 또는 바다의 우아함 균주에서 미토콘드리아의 시각화.

GFP 태그, 미토콘드리아.