Name: Screenable 생체 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석 예쁜 꼬마 선충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 미토콘드리아 기능 조절제 스크리닝 방법입니다. 발광 및 형광 측정으로 ATP 수준을 정량화하여 약물 독성과 유익한 효과를 식별할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 반딧불이 루시페라제 억제 화합물 DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 및 DDD00023047를 친절하게 기부해 준 던디 약물 발견 부서의 David Gray에게 감사를 표합니다. Tibor Harkani (Medical University of Vienna)는 테스트 화합물로 oxaloacetate를 제안했습니다. 일러스트레이션은 Charlie Dear (University of Aberdeen)입니다. 이 연구는 BBSRC Pathfinder 상(BB/FOF/PF/4/11)과 University of Aberdeen의 지원을 받았습니다.

참고 : (126 ° C, 11 분 오토 클레이브에 의해) 멸균 조건 (층류 캐비닛)에서 사전 살균 물질과의 모든 단계를 수행합니다. 아웃 줄무늬 E.와 LB 플레이트 대장균 OP50 매월, 위에 밖으로 행진 신선한 LB 플레이트를 요구하고 restreak 4 ° C로 유지. 1. 세균성 식품 (대장균 OP50) 준비 <ol><li> 주 1. 접종 E.의 단일 식민지 두 보편적 인 병 2 × 5 ㎖의 LB 대장균 OP50 8 시간 동안 37 ° C (220 RPM)에서 인큐베이터를 흔들어에서 장소. </li><li> 8 시간 배양 한 후, E를 2 ㎖를 사용 대장균 OP50 LB 문화는 3 × 200 ml의 (LB)을 각각 접종 인큐베이터를 흔들어에 넣어 플라스크 (220 RPM) O / 37 ° C에서 N (17 시간). </li><li> 20 × 50 ㎖ 원심 분리기 튜브의 무게를 측정 튜브에 무게를 쓰기. </li><li> 날 혈청 학적 피펫을 사용하여 2. 나누어 O의 30 ㎖ / N E. 사전에 대장균 OP50 문화는 원심 분리기 튜브의 무게. 7741 X 원심 분리기G, 10 ° C, 8 분. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다에 뚜껑을 반전 튜브를 유지하고 몇 분 동안 서 둡니다. 피펫을 사용하면 뚜껑에서 수집 한 수 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 달아 펠릿의 중량을 계산한다. </li><li> 30g / L의 현탁액을 제공하고,이 튜브에 볼륨을 표시하는 데 필요한 양을 계산한다. 1~3개월 내에서 또는 사용하기 위해 -20 ° C에서 날짜, 라벨 및 장소 튜브 - 80 ° C 3 개월 이상 저장하는 경우. </li><li> 선충을 성장 세균 현탁액을 준비; , 소용돌이 부드럽게 펠렛을 재현 탁 밖으로 해동 각 튜브에 11, 12 완전한 매체 S의 필요한 볼륨을 추가하는 세균 펠릿을 허용, 다른 관의 풀 내용은 필요한 볼륨을 얻었다. 무균 조건에서 작업 할 수 있습니다. </li></ol> 96 웰 플레이트 형식으로 의약품 표준 2. 준비 참고 : 약물 라이브러리를 사용하는 경우, 약물 플레이트가 하나 설치되어있다DMSO의 화합물의 농도. 차 심사는 하나의 농도로 화합물을 테스트합니다. 설명은 10 μM에서 통계적 유의성 선택한 후, 0-160 사이 μM 농도 범위에서 확증 시험 화합물에 대한 약물 판의 제조에 따른다. 다음 단계는 다른 농도를 테스트하도록 구성 될 수있다. 주의! 약물을 처리하기위한 필요한 예방 조치를 따르십시오 (일반적으로 마스크, 안전 고글에 직면, 장갑이 필요합니다). <ol><li> 확증 검사에 대한 표준 작업과 약물 플레이트를 준비 : 멸균 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 화합물의 필요한 양을 무게 DMSO에 16 밀리미터의 화합물을 제조 (즉, 100 배 노출에 대한 원하는 최고 농도에 상대적으로 집중). </li><li> 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.25 mM의 규격 (멸균 조건)을 얻었다 DMSO 2 : 직렬 16 mM의 스톡 1 희석. 이들은, 100X 농축하고 0 (비히클 만)의 최종 농도까지 희석된다약물 노광시 (1 % DMSO에서) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160 μM. </li><li> 층류 캐비닛 예 플레이트 위치 A1을 위해, 96- 웰 플레이트의 칼럼 내의 화합물 표준 웰 당 20 내지 50 μL를 배치 : 16 mm의 B1 : 8 mm의 C1 : 4 mm의 D1 : 2 mm의 E1 : 1 밀리미터, F1 : 0.5 mm의 G1 : 0.25 mM의 약물 및 H1 : DMSO. 다른 약물의 희석 시리즈에 대해 서로 다른 열을 사용합니다. </li><li> 약물 플레이트에 열 (12)의 우물에 나누어지는 차량. 참고 :이 그 차량이 전체 판의 위치 대리점에서 테스트 보장, 차량 제어 아래 행 (H)에 따라 시험에 추가하여 열 테스트를 용이하게 할 것이다. 주 : 확증 각 약물 스크리닝 플레이트 테스트 될 11 개의 약물의 최대 플러스 차량 제어를위한 일련의 희석을 보유하고있다. </li><li> 필요한 때까지 레이블 및 도장 판은 -20 ° C에서 호일과 장소 커버. </li></ol> 3. 선충 실험 참고 : 모든 단계 U을 수행파인더 무균 조건, 무균 및 사전 살균 물질 및 시약. C를 유지 엘레은 E.와 NGM 판에 정기적으로 균주 다른 프로토콜 단계에 대한 대장균 OP50. (12)하기 권장 타이밍은 표 1에 제공된다. <ol><li> 1 일 작업 : 다음 동기화를위한 바이오 센서 균주의 액체 배양을 설정합니다. <ol><li> 2 ML의 S 완료에 (음식을 그냥 실행 한 어린 유충을 많이) 하나 6cm의 NGM 판에서 선충을 가지고 30g / L E. 플라스크로 전송 S 전체 (전체 부피 250 mL의 용량 원추형 유리 플라스크에서 30 mL) 중의 대장균 OP50. 20 ° C, 160 rpm으로 3 일 품어. </li></ol></li><li> 4 일 작업 (약 30 ~ 35 분을 허용) : 표백제 문화는 알을 수확 및 웜 인구를 동기화합니다. 1 분, 600 × g으로 원심 분리에 대한 모든 단계를 수행한다. <ol><li> 사용 직전 표백제 솔루션을 준비 : 0.156 M KOH / NaOH를 각각 16 ml의 4 ml의 표백제를 추가합니다. </li><li> 2 × 14 ml에 붓고15 ML 원뿔 원심 분리 튜브에 웜 문화. 벌레는 중력 (3 분)에 의해 해결하도록 허용합니다. 제거하고 액체 위의 정착 선충을 폐기합니다. 각각의 튜브에 표백제 용액 5 mL를 추가하고 타이머를 시작합니다. 하나의 튜브에 볼륨을 결합합니다. </li><li> 2 분 동안 부드럽게 튜브를 반전 벌레의 파괴 및 현탁액에 계란의 석방을 입체경에서 확인합니다. 때 대부분의 계란이 해제되거나 표백제 용액에서 2 분, 원심 분리기의 최대 시간. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 14 ML의 S 완전하고 원심 분리기와 펠렛 1 배를 씻으십시오. </li><li> , 상층 액을 버리고 10 ml의 표백제 솔루션을 추가하고 타이머를 시작 (이 두 번째 표백 단계는 웜 시체의 대부분이 분해되어 더 이상 입체경에서 볼 수 있습니다 보장). 2 분간 원심 표백제 용액에 최대 시간 후. </li><li> 워시 펠릿 배는 S 전체에 부드럽게 각각의 원심 분리 후 전체 14 ML의 S에 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. 14 ML의 S C가 최종 세척 후, 재현 탁 달걀 펠릿omplete. </li><li> 원뿔 유리 플라스크에 볼륨을 전송합니다. 20 ° C, 160 rpm에서 18 ~ 24 시간을 품어. 참고 : 수확 계란 O / N을 부화 및 제 애벌레 령 (L1)에서 개발을 체포 인해 음식의 부족, 따라서 그들은 모두 성장의 같은 단계에있을 것입니다 것입니다. </li></ol></li><li> 5 일 작업 : 약물 분석에 대한 동기 웜 문화를 설정합니다. 참고 : 기아 매체에 현탁 웜은 피펫 팁 및 튜브 등의 소수성 플라스틱 표면에 부착하는 경향이있다. 0.01 % 트윈 20은 플라스틱 표면 친수성을보다 렌더링 계수에 큰 정확도 (0.01 % 트리톤 X100가 또한 사용될 수있다)을 사용할 수 있도록 여기에 계면 활성제이다. 선충은 박테리아 보충 매체에있을 때, 그들은 플라스틱에 집중하는 경향이 없습니다. <ol><li> 플랫폼 (160 RPM)를 흔들어에 플라스크를 유지, 플라스크에 부화 L1 년대의 번호를 확인합니다. <ol><li> 플라스크에서 100 μL 샘플을 3 배 타고 900 μL 액체 M과 별도의 1.7 ML의 마이크로 튜브로 (깨끗한 팁 때마다 사용)edium 0.01 % 트윈 -20. 참고 : 한 번만 청소 팁으로 갈망 100 μL 샘플. 분배 할 때 그런 다음, 트윈 보충 매체에 피펫 위로 몇 번 다운 팁을 준수하는 모든 벌레를 분리합니다. </li><li> 각 세중 희석 관에서 4 배 10 μL 방울의 선충을 계산합니다. 평균 값을 계산하고 원뿔 유리 플라스크에 존재하는 웜의 수를 추정하고있다. </li></ol></li><li> 10 μL 당 10 선충과 2 × 20 ​​ml의 문화를 설정하는 데 필요한 부화 선충 서스펜션의 볼륨을 계산합니다. 원심 분리 단계에서 일부 이후 선충 손실을 고려하여 10 %로 계산 된 볼륨을 높입니다. </li><li> 가만히 따르다 볼륨이 2 × 15 ML의 원심 분리 튜브에 요구 (미리 무게). 부드럽게 실제 분배 볼륨, 소용돌이를 얻어 5 mL를 피펫 (만 멸균 끝이 튜브를 입력해야합니다)를 초과 볼륨을 제거하여 볼륨을 대상으로 조정 튜브의 무게. </li><li> 이었다 완전한 신선한 S를 14 ml의 볼륨을 확인시간 선충. 원심 분리기 (1 분간 600g). 제거하고 선충 펠렛을 방해하지 않도록주의하여 상층 액을 버린다. </li><li> 30g / L (E)와 완벽한 S 5 mL를 추가 펠렛 선충에 대장균 OP50. 30g / L E. 완료 15 ML의 S를 함유 원추형 유리 플라스크로 각 튜브에 5 mL를 전송할 대장균 OP50. 아래 참고 시간 선충 먼저 음식을 제공했다. </li><li> 현미경 슬라이드 선충을 계산 (신선한 팁 때마다 사용) 약 10 (± 2) 당 10 μL의 평균을 확인에 조심스럽게 플라스크 (160 RPM)를 흔들어, 9 × 10 μL 방울을. </li><li> 20 ° C, 42 ~ 44 시간 동안 160 rpm으로 인큐베이터를 흔들어에서 선충 플라스크를 놓습니다. </li></ol></li><li> 7 일 작업 : 전사 96 웰 플레이트에 선충 및 약물 노출을 시작합니다. <ol><li> 하나의 플라스크에 선충 문화를 결합 부드럽게 플라스크를 소용돌이 유지하고 60 ml의 멸균 통에서 선충 문화의 3 × 4 ml에 배치합니다. 흔들리는 플랫폼 (160 RPM)에 저점을 놓습니다. </li><li> 사용 8 짱에서 채널 피펫은 투명 평면 바닥과 96 웰 블랙 마이크로 타이 터 플레이트의 웰 당 25 μL 중단 선충 나누어지는합니다 (모두 발광 및 형광 측정을 촬영하거나에만 발광 흰색 번호판). 접시 뚜껑을 덮고 옆으로 설정합니다. <ol><li> 후 매 2 판의 설정, 손실 된 볼륨을 대체하는 통에 다른 2 × 2.5 ㎖의 선충을 배치 (약 7 ㎖를 저점으로 &#39;죽은 볼륨을&#39;유지). </li><li> 선충과 13/14 플레이트를 설정합니다. 11 선충 플레이트는 두 개의 96- 웰 플레이트 약물을 시험해야한다. 12 일 선충 판은 독점적으로 제어 등의 차량으로로드됩니다. 13 일 판은 8 일에 배경 형광 (아래 참조)을 설정하는 데 사용됩니다. 실수 셋업 중에 발생한다 여분의 판을 사용하기 위해 제조 할 수있다. </li></ol></li><li> 진탕 배양기에 젖은 실에서 각 웰과 장소 플레이트에 완벽한 S의 나누어지는 74 μL (자료 목록 참조) (20 ° C, 160 RPM) UNTIL (음식이 제공 한 후 예를 들어, 45 시간 30 분) 미리 선택된 발달 한 번에 나누어 테스트 화합물 준비. [잘 당 볼륨은 이제 99 μL입니다]. </li><li> 시험 약물 판 (들)을 해동. </li><li> 팁 각 시간을 변경, 약물 선충 판을 설정하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 약물을 분취 96 웰 플레이트 당 5 분을 허용합니다. <ol><li> 약물 판의 1 일 열에서 1 μL를 가지고 열 선충을 포함하는 판의 1-5에 추가; 열 선충을 포함하는 판의 8-12로 약물 플레이트에서 2 번째 열에서 반복합니다. 열 (6)과 선충 판의 7 차량의 1 μl를 추가합니다. 참고 : 화합물 / 차량 100 희석 : 선충 플레이트에 웰 당 총 볼륨 1의 결과로 100 μL 될 것입니다. </li><li> 열에 약 판의 3 번째 / 4 번째 컬럼의 1 μl를 추가하여 반복 과정 제 선충 판의 1-5 / 8-12; 열 (6)과 선충 판 7에 차량을 추가 할 수 있습니다.</li><li> 남은 약물 플레이트 열을 테스트하기 위해 계속합니다. 약물 판의 열 (12)로부터 샘플링하여 모든 우물에서 차량 한 선충 판의 최소를 설정합니다. 다시 인큐베이터 20 ~ 22 시간 동안 20 ° C (160 RPM)을 떨고에 습기 챔버에 넣어 판 (8 일 참고 사항을 참조하십시오). </li></ol></li><li> 다음날 발광 버퍼를 파트 준비 : 1 % DMSO 0.15 % 트리톤 X-100을 얻기 위해 완벽한 S의 필요한 볼륨 DMSO 10 % 트리톤 X-100을 추가합니다. 발광 용 플레이트 읽기 당 5 ml를, 플러스 루미 인젝터를 프라이밍 1 ml의 허용. </li></ol></li><li> 8 일 작업 : 실험 엔드 포인트를 읽기 - 형광 및 생물 발광을. (GFP의 형광 판독은 생물 발광 데이터를 정상화하기위한 수단으로 권장합니다.) 주 : 음식 기재된 실험 조건 하에서 상당한 자손 생산을 방지하기 위하여 선충에 제공 한 후 66 ~ 67 시간에서 엔드 포인트를 판독하고자합니다. <ol><li> 설정 판은 GFP 판독에 대한 배경 컨트롤로 사용할 수 있습니다. C15 ML 튜브에 13 번째 판에서 ombine 아니라 내용. 선충은 (2-3 분) 정착하도록 허용합니다. 물론 당 100 μL 세균 현탁액으로 마이크로 (투명 하단에 검은 색)을로드하는 상층 액을 사용합니다. <ol><li> 선충을 볼 수있는 우물 아래로 지적 현미경 배경 제어 판을 준수하십시오. 후속 데이터 분석에 사용되는 배경이 추정치로부터 제외. </li></ol></li><li> 배경 컨트롤을 포함하여 각 96 웰 플레이트의 형광을 읽어보십시오. (설정 : 판의 바닥에서 광학, 20분의 485 여기 필터, 20분의 528 방출.) </li><li> 발광 측정을위한 버퍼를 준비합니다 루시페​​린 (20 mM)을 부품을 제조하는 버퍼 (전날)를 추가, 1 %로 DMSO (1 배), 0.15 % 트리톤 - X100 (3 배) 0.3 MM의 루시페린 (배를 발광 버퍼를 얻기 위해 ). 150 μL 발광 버퍼 프라임 루미 인젝터의 6 배. <ol><li> 이전 단계는 약물 노출시 차량으로 1 % DMSO를 가정합니다. 차량이 물이있는 경우, CO를 조정3 %에 발광 버퍼에 DMSO의 ncentration (즉, 배). </li></ol></li><li> 한 번에 하나의 판으로 작업 할 수 있습니다. 웰 당 50 μL 발광 버퍼를 분배. (물론 150 μl의 최종 부피, 발광 버퍼의 3 배 희석 : 1 % DMSO, 0.05 % 트리톤 - X100 0.1 mM의 루시페린 최종 농도.) 장소 바로 플랫폼을 흔들어 타이머를 시작합니다. <ol><li> 플랫폼 (160 RPM)을 흔들어 3 분 후, 발광 (측정 당 1 초)를 참조하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 형광 결과에서 읽기 평균 GFP 배경을 뺍니다. 각각의 GFP 읽기에 의해 생물 발광을 나눕니다. <ol><li> 높은 GFP 값은 화합물에 노출 선충에 대해 검출되는 경우, 임의의 화합물의 형광을 고려하여 그 자체 화합물의 형광을 측정한다. 평균보다 높은 경우, 대신에 배경으로 사용합니다. </li></ol></li><li> 익스프레스 생물 발광, GFP 정규화 된 생물 발광의각 플레이트에서의 차량 제어에 대한 평균 값의 비율로 ND GFP 형광 데이터. </li><li> 각각의 농도 평균값과 오차 막대 플롯. </li><li> &#39;농도&#39;, &#39;실험&#39;과의 상호 작용의 효과와 2 웨이에게 분산 (ANOVA)의 분석을 이용하여 유의성에 대한 시험 (각 데이터 포인트는 하나의 웰을 말한다)와 대 (사후 시험으로서 듄 네트의 시험을 사용하여 . 차량 제어). 주 : &quot;실험&quot;또는 &quot;상호 작용&quot;용어가 중요한 경우, 추가 실험이 응답을 확인해야한다. 실험 사이의 변동이 데이터 그림의 관찰로부터 명백한없는 경우, 일방향 ANOVA는 독립적 인 실험으로부터 풀링 된 데이터에 대해 수행 될 수있다. <ol><li> 단 차량 판 (들)의 통계적인 분석을 위해, 컬럼 (6) -7에서 모든 웰과 대조군으로 행 H의 모든 웰을 선택 (이 화합물은 일상적으로 테스트하는 동안 차량에 할당 된 위치에있다). </lI&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+phenotypic+gap%3A+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7(2008).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%2C+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li>
<li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503(2012).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobacco-specific+nitrosamine+4-%28methylnitrosamino%29-1-%283-pyridyl%29-1-butanone+%28NNK%29+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content%2C+transcription%2C+ATP+production%2C+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9(2013).</li>
<li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li>
<li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li>
<li>Lagido, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLagido%2C+C+%22Nematodes+as+environmental+indicators%22">Nematodes as environmental indicators</a>. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).</li>
<li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+in+chemical+biology%3A+a+compendium+of+inhibitors%2C+mechanistic+evaluation+of+chemotypes%2C+and+suggested+use+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li>
<li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li>
<li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li>
<li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877(2013).</li>
<li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7%2C+two+major+components+of+the+hypodermis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress%3A+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Grow+or+Not+to+Grow%3A+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li>
<li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li>
<li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Test+Mater%22%5BJournal%5D)">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li>
<li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH%2C+salinity%2C+and+hardness+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Con+Tox%22%5BJournal%5D)">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li>
<li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li>
<li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어

모델 생물 C. 엘레은 강력한 실험 시스템을 제공합니다. 그것은 문화가 용이하고 (L4까지 청소년 애벌레 단계 (L1)을 통해) 성인의 재생에 계란에서 3.5 일 라이프 사이클과 풍부한 유 전적으로 동일한 자손을 생산하고 있습니다. 그것의 작은 크기 때문에, 이것은 편리 화합물 스크리닝을 용이하게, 96- 웰 플레이트에서 성장 될 수있다. 우리는 C의 변종에 따라 표현형 검사 프로토콜을 제시 96 웰 플레이트 루미 및 멸균 캐비넷이 요구되지만 에너지 수준의 생체 센서로서 작용 간스. 14 프로토콜은, 모든 실험에 적용 할 수있다. 이 우수 실험실 기술을 이용하여 분석에서 오염을 방지하는 것이 중요하다. 수동으로 작동하는 경우, 달성 가능한 선충 플레이트의 최대 수는 2 × 96- 웰 플레이트의 약물 검사를 허용하고 두 차량 번호판을 포함한 실험 당 13이다. 대표 결과는 내가 rotenon 억제제 미토콘드리아 복잡한 제시된다즉, 슈퍼 옥사이드 발생 파라콰트, 시트르산 회로 중간 옥 살로 아세테이트와 공지 반딧불이 루시퍼 라제 저해 활성을 갖는 화합물 네. 옥 살로 아세테이트는 향상에 ATP의 더 큰 발전에 기인 할 가능성이 주도하는 반면 예측으로 처음 두 화합물은 생물 발광의 감소되었다. 옥 살로 아세테이트 데이터 세트는 또한 리포터로서 개똥 벌레 루시퍼 라제에 기초 실험에서 고유 변화를 보여준다. 3 개의 독립적 인 실험의 최소 알 수없는 화합물에 대한 응답의 안정성을 확인하는 것이 바람직하다. 개똥 벌레 루시퍼 라제 활성의 억제는 시험 관내 분석 상업용 키트를 사용으로 식별 하였다. (3) 화합물 중 하나의 수준을 증가 억제와 일치 GFP 형광의 실질적인 증가를 초래 GFP 표지 된 루시퍼 라제 효소의 활성에 결합함으로써 반딧불 루시퍼 사이트하고 렌더링 더 안정적이다. 어떤 경우에는 15억제제 과량 기판에 의해 변위되면 (되지 특히이 경우) 이는 생물 발광 수준 증가로 이어질 수있다. 15 그것은 것이 중요 반딧불 효소와 상호 작용하는 화합물로부터 잘못하여 결과를 해석되지 ATP 수준을 감소 또는 증가함에 / 미토콘드리아 기능. 발광 신호의 변화는 매우 자주 운동, 발전과 성장으로 건강의 추가 측정과 상관 관계. 생물 발광 신호의 급격한 감소가 검출되지만 웜 현미경 관찰에 의해 대조군과 구별되는 경우 예를 들어, 화합물은 용의자 루시퍼 라제 억제제이다. 하지 성장 또는 자기 형광 화합물에 의해 설명 GFP 형광의 증가는 또한 억제제를 가리킬 수있다. 루시퍼 라제 억제제 (15)의 개수는 알려져 있고 PubChem에 입력되었다. 따라서 첫 번째 인스턴스에서, 그것은 PubChem 보유 루시퍼 라제 억제제에 대한 정보를 참조하는 것이 좋습니다이다; T 다음추가에 의해 미토콘드리아 기능에 대한 효과의 정제 된 효소 3 및 / 또는 확인과 시험 관내 시험 법의 복합 효과 esting. (16, 17) GFP 형광 측정 가능한 생물 발광과 함께이 엔드 포인트를 측정하기위한 강한 케이스를 만들기 반딧불이 루시퍼 라제의 레벨을 검출 (및 전술 한 바와 같이 일부 루시페라아제 효소 저해제의 전위 검출)을 가능하게한다. GFP에 생물 발광 수치의 정상화는 (이 여러 기술의 복제를 포함함으로써 달성 될 수 있지만) 웰 사이 웜 번호의 변화를 차지하기위한 수단이다. 민감도를 들어, 측정에서 배경 형광을 빼는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 그러나 선충의 형광도가 현재 분석의 (제한, 어떤 노화 스투에 특히 중요한 회계 처리하지 않은 배경 형광에 세균 현탁액의 공헌을 평가) 나이가 선충의 형광도 증가 주어진 죽는다. 시험 화합물의 자기 형광도 병렬로 평가되어야한다. 연구원 생물 발광 유전자의 발현 수준에서 어떤 변형 차이를 제어하기 위해, 서로 다른 유전 적 돌연변이 또는 다른 유전자의 침묵 후 세포 ATP 풀을 비교하는 프로토콜을 적용하도록 할 때 GFP 정규화 불가결 보인다. 프로토콜 내에서 중요한 매개 변수는 노출이 시작되는 발달 단계, 노출의 길이, 다른 우물에서 선충의 비슷한 번호를 얻기를 포함한다. 노출하지만, 선충의 발달의 모든 단계에서 L3 단계를 시작할 수 이상이 바람직하다. 미토콘드리아 DNA 콘텐츠, 산소 소비와 ATP 수준에서 매우 유의 한 증가에 의해 입증에이 단계에서, 선충은 성인으로 개발을위한 산화 적 인산화에 따라 달라집니다. 18,19,20 본 프로토콜은 박람회를 시작합니다L4 단계에서 URE. (오히려 먼저 L1 단계에서 음식을 구비 한 경우보다) 만이 단계에서 96 웰 플레이트에 선충을 분취하는 이유는, 판이 증발을 최소화하기 위해 습한 챔버에 배치되어 있지만, 증발의 정도가 여전히 발생한다는 것이다 뚜껑에 형성 아주 작은 방울로 볼 우리의 진동 인큐베이터, (이것은 다른 떨고 인큐베이터에 문제가되지 않을 수 있습니다). 단지 표준 약물의 첨가 전에 플레이트에 선충을 분취하여, 실제 약물의 농도로 인해 증발 부피의 임의의 작은 변화에 의해 영향을받지 않는다. 차량 선충 판 넣기 만 선충이 고르게 우물 사이에 분포되어 있는지 확인하는 데 유용합니다. 차량 만 판을 위해 발견 된 유의 한 차이가 우물에 선충을 분배 가난한 기술을 나타내는 것입니다. 노광 길이는 고려해야 할 중요한 요소이다. 독립적으로 성장의 에너지 상태에 대한 효과는 관심, 프로 경우로토콜은 (예를 들면, 거의 즉시 반응에서, 2 시간)보다 짧은 노광을 수용하도록 변경 될 수있다. C.으로 화합물 한편, 엔트리 엘레 조직은 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다. 예를 들어 12 ~ 24 시간이 레스베라트롤 및 5- 플루오로 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 (FuDR)의 최대 내부의 농도를 달성하기 위해 요구된다. (21) 따라서, 긴 노출 (18 시간 내지 24)는 노출 레벨을 최대화하기 위해 정당화 될 수있다. 노출 시간은 상당한 수준의 재생이 잘 일어날 수 있도록하지 않는 시간으로 제한되어야한다. 우리는 선충의 총 개발 시간이 66 ~ 67 시간에서 유지하는 것이 좋습니다. 편리하지만, 선충은 그때까지 임신하는하고 egglaying을 시작했다. 그럼에도 불구하고, 우리는 무시할 수 달걀 제제에서 생물 발광 측정하는 결과 (도시 생략). 쉬르 5 프로모터 구동 트랜스 진 발현은 먼저 전용 1시 58분 시간 반 100 세포 단계 22 ℃에서 수정 후 검출hitinous 달걀 껍질은 루시페린의 항목을 제한 할 가능성이있다. 다른 사람은 유정란이 임신하는 성인의 대사에 크게 기여하지 않은 것으로 나타났습니다. (23) 그러나, 중요한 자손의 생산을 가능하게 조건을 피할 수 있습니다. 선호하는 경우, 실험 시간 척도 다시 이동 할 수 있습니다 : 우리는 이전에 늦게 L3 애벌레 단계 (36 시간)에서 환경 독소에 노출을 시작하고 55 시간에서 생물 발광 및 GFP 측정을 수행 한 조건부 멸균 2 또는 유전 적 배경. 예 FER-15 (B16) II에 관해서는, 자손의 생산을 방지하기 위해 사용될 수있다; 15 ℃로 유지 될 수있다 (hc17) IV 이중 돌연변이-1 FEM하지만, 25 ℃에서 멸균한다. (24) 불임을 유도하는 FuDR를 사용하는 것은 그 자체로 선충의 신진 대사에 영향을 미칠 수있는이 권장되지 않는다. (25) 분석 할 수 또한 부분 상실 (SECURITY) 기능을 비활성화로 더 투과 손톱과 균주에서 수행 될 수약제에 민감한 약물의 투과성을 증가 할 예정. (26)이다 이온 버스 8 돌연변이이 짧은 노출과 낮은 화합물 농도를 촉진 할 것이다. 이 선충 루시페린을 추가하는 조건은 또한 발광 버퍼에 1 % DMSO 및 0.05 % 트리톤 X100은 루시페린 가용성을 향상시키기 위해 필요하지 않을 수있다, 즉, 조정 필요가있다. 이 프로토콜은 화합물 배달을위한 차량으로 1 % DMSO를 사용합니다. 우리가 이전 책에서 논의 된 것처럼 치명적인 것은 아니지만, DMSO의 농도는 약간의 생물학적 효과가 있습니다. 가능한 약물 라이브러리의 많은 3 차량의 희석 후 세포 기반 분석에 적합 할 것 농도에서, DMSO 100 % 준비되어있다 0.1 %이다. 높은 화합물 농도에서 C. 반응을 유도하는 데 필요한 엘레가 1 % 미만인 DMSO에서 분석을 수행하는 것이 불가능하도록 인간 세포와 비교할 때. 다시 말하지만, 균주의 사용과더 투과성 손톱은 차량의 낮은 농도로 시험 발생할 수 있습니다. DMSO보다 높은 1 %의 농도는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이전 수치에 루시페린과 세트 배양 시간을 준수해야합니다. 이전에 나타낸 바와 같이, 발광이 다음 30 분에 1 이상의 발광 느린 점진적인 감소이어서, 루시페린 첨가 처음 5 분 동안 비교적 안정 남은 초 후에 분 이내에 최대 농도에 도달한다. 특정 화학 물질에 대한 운동 반응은 루시페린의 초기 분배 후 30 분의 초기 단계에서 수행 할 수있다. 프로토콜 선충 인구의 동기화를 달성하기 위해 계란을 수집 기아 다음 단계를 포함한다. 다른 발달 단계는 세포의 ATP 수준에 차이 및 시험 화합물에 다르게 반응 할 수 있기 때문에 우리는 선충 테스트 인구의 동기화를 권장합니다. S의 전체의 굶주림을 수행함으로써M9에 ​​반대하는 매체로, 부화 선충은 그 애벌레 개발하지 않도록, 탄소원 (에탄올)와 함께 제공되지만 완전히 고갈되지 않습니다. (27, 28) 또한 L1 체포의이 음식에 대한 신속한 대응을위한 준비가 끝났다하고 그 표시되었습니다 정상 L1 증가율 음식 사용할 수있게 한 후 3 시간 내에 달성된다. (29) 그러나, 그것을 가능성 기아 단계 C.의 신진 대사를 변경시킬 수 있음 엘레 배제 할 수 없다. 기아의 길이가 24 시간을 초과하지 않아야이 때문에 30 (18 시간 동기화에 충분하다). 특정 실험실 완전히 고갈 단계를 우회 나이 동기화 COPAS Biosorter를 사용할 수있는 가능성을 가지고있다. 다른 실험실 전에 표백에 (OP50와 NGM 플레이트) 고체 배지에 (단계 3.1) 선충 인구 확대를위한 환경 설정을 가질 수 있으며,이 너무 잘 작동합니다. 우리는 선충의 배양을위한 표준 매체 등의 화합물에 노출시 S 매체를 사용 howeveR 다른 매체 예를 K 매체 또는 EPA 적당히 하드 물, 선택할 수는 종종 생태 독성 연구에 사용됩니다. (31, 32) 프로토콜은 수단 선별하고 미토콘드리아의 기능에 미치는 영향의 측면에서 더 테스트를 위해 후보를 식별 할 수를 제공합니다. 차 심사의 단계에서 그것은 몇 가지 화합물 따라서 약물 화면은 철저한 간주되어서는 안됩니다 때문에 하나의 농도를 테스트 할에 누락 된 가능성이 높습니다. 히트 예컨대 산소 소비 C. 위해 미토콘드리아 기능의 다른 양태를 평가하는 기법의 사용에 의해 확인 될 수있다 엘레는 GFP 표현 미토콘드리아와 균주, 미토콘드리아 막 잠재력 및 / 또는 ROS 측정을위한 얼룩. 16,33,34 방법론의 가장 큰 의미는 다세포 유기체 수준에서 화합물 및 / 또는 조건의 많은 수를 스크리닝하는 방법을 가지고있다, 그리고 중요한 일을 활용 할 수 있도록C의 전자 유전 취급 용이성 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 엘레 간스. 이 기술은 가속화하고 흥미로운 화합물 및 대상의 발견에 새로운 경로를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 질병 관련 맥락에서 화합물 라이브러리의 심사에 대한 인간의 질병과 관련된 유전 적 배경을 가진 센서의 조합이 제공하는 많은있을 것이라는 점을 예상한다.

이 절차의 목적은 전반적인 C.의 에너지 상태의 신속한 계량화 화합물 스크리닝에서 엔드 포인트로 이것을 사용하여 볼 수있는 생체 내에서 간스. 이론적 근거는 선충 C에서 반딧불 루시 페라 제의 유전자 발현을 기반으로 플라스미드 pSLGCV (1 통해 엘레 1-3 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862</a> ). 루시퍼 라제 효소 (신호를 표적 루시퍼 페 록시 제거한) 녹색 형광 단백질 GFP 융합되고 세포질에서 구조적 및 보편적으로 발현된다. 루시페린 기질을 외생 제공되는 경우 이는 발광 리드​​. 웜이 투명하기 때문에, 광은 상대적 광 단위 (RLU)로서 루미 측정 될 수있다. 생물 발광 반응과 가용성 셀룰러 ATP 연료 생산 빛 수준을 결정합니다. 따라서, luminometry은 모든 편의를 제공합니다ATP를 생산하는 미토콘드리아에서 주로 일어나기 때문에 t는 상대적 ATP 수준을 평가 및 미토콘드리아 기능에 의해 확장을 의미한다. 미토콘드리아 기능 및 생물 발광 레벨 사이의 링크는 미토콘드리아 전자 전달계 유전자 및 수반 광 출력의 감소를 통해 이전 사일런 입증되었다. 1 PE254 (feIs4)를 지정하고 생성 된 생물 발광 균주 및 PE255 (feIs5) 1 (자료 목록 참조) 3. 상호 교환 사용할 수있는 다수의 연구는 아 지드 화 나트륨 (1), 카드뮴 (2), 하수 등의 다양한 생체 이물 화학 물질에 노출 된 후 생체 내에서 세포의 ATP 수준에보고 이러한 센서 균주를 활용 한 슬러지 추출물 3, 5&#39;- 플루오로 -2- 데 옥시 우리 딘 (6), 및 담배 특이 니트로사민 7. 균주는 또한 C 자외선 방사선에 대한 노출의 효과를 모니터링하는 데 유용했을 <s업&gt; (8)과 미토콘드리아의 호흡 쇄 기능을 방해의 효과. 1,9-는 GFP 융합 (PE39)없이 루시퍼 라제 유전자를 발현 발광 센서의 초기 버전은 또한 중금속 효과 조사 및 호흡기 사용되고 . uncoupler 10 균주 PE254과 PE255은 루시 페라 제를 수행 : GFP 융합 GFP의 형광 발광 값의 정상화를위한 편리한 수단을 제공하고, 선충 질량에 비례하여 증가 할 것으로 나타났다 6,9 잘 당 벌레의 차동 양의 효과도 될 수 있습니다. 분석 (조건 당 5 우물의 최소)에서 여러 기술 복제를 포함하여 고려. (3) 프로토콜은 에너지 수준의 생체 모니터링의 가능성을 제공한다 (반대로 더 기술적 힘드는 체외 ATP의 결정) 화합물의 스크리닝을 가능하게하고 전체 MU의 생리적 환경에서 재배치lticellular 유기체. 절차 및 / 또는 RNA 간섭에 의한 유전자 사일런 하시어 변이주에 형질 전환 유전자를 염색체에 통합 건너 유전 다양한 배경으로 확장 될 수있다; 따라서, C의 최대한 활용 모델 생물로 간스. 이 방법에 의한 미토콘드리아 독성 약물 후보의 후기 실패를 줄이고 더 높은 동물 실험의 감소를 향해 기여를 할 수 있도록해야한다.

<table><tbody><tr><td>주입기 및 Simplicity 4.2 소프트웨어가 있는</td> <td>Orion II Microplate Luminometer</td><td>Berthold 감지 시스템</td><td></td>; 플레이트 측정</tr><tr><td>FLx800 형광계</td>의 끝에서 Excel로 데이터를 전송합니다.<td>Biotek</td><td></td><td>은 Gen5 소프트웨어를 사용하며; 플레이트 측정 종료 시 Excel로 데이터를 전송합니다.</td></tr><tr><td>Ks 130 기본 쉐이킹 플랫폼</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>냉장 인큐베이터 쉐이커</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>with eppendorf rotor A-4-44&nbsp; (50/15&#160용; Stripette</td></tr><tr><td>, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Serological pipette</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 mm 조직 배양 플레이트&nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주걱</td><td>Corning</td><td>#3007; 화학</td><td>물질 계량용</td>#3004</tr><tr><td>0.22 mM Millex GP 필터</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf 튜브 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 웰 분석 플레이트</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>뚜껑이 있는 검은색 플레이트 투명 바닥</td></tr><tr><td>Nunc 96 웰 분석 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>뚜껑이 있는 흰색 플레이트</td></tr><tr><td>저장소 시약 60ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>프로토콜 섹션 4.4.1에서 선충의 홈통으로 사용됨</td></tr><tr><td>보관 상자/습기 챔버</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56.6mm, 젖은 종이 타월로 습기 찬 챔버로 사용; 뚜껑이 있는 2x 96웰 플레이트는 하나에 들어갈 수 있으며, 하단은 마이크로플레이트 뚜껑 위에 있습니다</td></tr><tr><td>표백제: 차아염소산나트륨 용액 4-4.99% 염소 함량</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>분취량에 4&#160에 보관; &데그; 씨,&nbsp; 염소 손실을 방지하기 위해 Parafilm으로 밀봉하고 호일</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potassium salt</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Molecular Probes도 공급 업체로 사용할 수 있습니다. ddH2O에 20 mM 재고를 준비하고 -20 &deg로 유지하십시오. C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>순도 99.99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914<</td><td></td></tr><tr><td>em>C. elegans bioluminescent strains에서 emC. elegans/em bioluminescent strains</td><td>저자 자신의 실험실</td><td>PE254, PE255</td><td>는 염색체 V 및 X에 각각 통합 어레이 feIs4>< 및 feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)]를 포함하고 있으며, 형광 현미경 검사(><예: 15 웜)에 의한 luc::GFP의 균일하고 강력한 발현을 위해 때때로 선택합니다.</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 화학 물질</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

다세포 모델 유기체인 Caenorhabditis elegans는 성체가 되었을 때 약 1mm 크기의 작은 선충으로 유전적으로 그리고 실험적으로 다루기 쉽습니다. 경제적이고 액체 매체에서 배양 및 분배가 용이하여 중간 처리량 스크리닝에 매우 적합합니다. 당사는 이전에 선충의 ATP 수준에 대한 신속한 생체 내 평가를 제공하기 위해 C. elegans 균주를 발현하는 형질전환 루시퍼라제의 사용을 검증했습니다. 1-3 여기에서는 생물 발광 C. elegans 균주 PE254 또는 PE255(또는 그 파생 균주)를 사용하여 생물 검정을 수행하는 데 필요한 재료와 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 독성을 식별할 수 있는 약물의 치사적 영향에 대한 생체 내 검출뿐만 아니라 잠재적인 유익한 약물 효과의 생체 내 검출을 가능하게 합니다. 파라콰트, 로테논, 옥살로아세테이트 및 4가지 반딧불이 루시퍼라제 억제 화합물에 대한 대표적인 결과가 제공됩니다. 이 방법론은 미토콘드리아 기능을 조절할 수 있는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 플랫폼을 제공하기 위해 확장될 수 있습니다. 약물 독성에 대한 전임상 평가는 대부분 해당작용에서 ATP를 파생하고 종종 미토콘드리아 독성 물질에 내성이 있는 불멸화된 암 인간 세포주에서 수행되는 경우가 많습니다. 4,5 이와는 대조적으로, 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 성인기까지 발달을 지속하기 위해 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)에 의존하며, 인간과 유사점을 그리며 살아있는 다세포 유기체 전체의 생리학적 맥락에서 화합물 평가를 위한 독특한 기회를 제공합니다.

방법을 설명하는 대표 결과 로테 논 (도 1), 파라콰트 (도 2), 옥 살로 아세테이트 (도 3), 및 약물 라이브러리 (13) (도 4)의 선별 과정으로서 반딧불 루시퍼 라제 억제제로 선택하고 4 화합물에 대해 수득 하였다. 약물 노출은 모든 경우에 L4 단계에서 시작하고, 음식이 제하지만 다른 화합물에 비하여 45 ~ 46 시간에 제공 한 후 선충 파라콰트 노출 실험은 41 시간에 시작 하였다. 프로토콜은 약물 노출의 개시 및 노광 시간 길이를 선택하는 데있어서 유연성의 정도 허용한다. 그러나, 검사 목적, 설정 시간은 한 번 실험 사이의 재현성을 위해 선택하는 준수해야합니다. 엔드 포인트는 넓은 달걀 누워 우물에서 자손의 부화를 방지하기 위해 66 ~ 67 시간 개발 시간으로 측정해야한다. 타이밍에 대한 지침은 T에서 제공됩니다(1) 수. 로테 논, 내가 억제제 미토콘드리아 복합체는, 농도 범위에 모두 비교적 짧은 (2 시간)과 더 이상 노출 (24 시간) (그림 1) 이후 생물 발광을 감소시켰다. 이때, 어떠한 GFP 측정치가 수행되지 않았지만 기술적 복제 수가 사용 (N = 6)에 웰 (3) 사이에 웜 번호 차이를 고르게하기에 충분하다. 24 시간 노출이 생물 발광의 감소에 기여할 것으로 기대되었다 복잡한 I 억제의 결과로서 선충이 성장하는 동안의 시간 윈도우와 느린 개발이다. 이는 특히 상기와 20 μM의 농도에서, 본 발달 지연과 입체경 하에서 육안으로 확인 하였다; 또한 일부 치사율은 (질적 관찰 정량화되지 않음) 40 μM에서 발견되었다. 어떤 치사율은 2 시간 노출 후 관찰되지 않았다하지만 웜 운동에 효과가 관찰되었다. 제어 occu에 생물 발광 상대적으로 급락로테의 가장 낮은 농도로 rred 효과가 쉽게 2 시간 노출에 빠른 육안으로 검출되지 않았다하는 2.5 μm의를 테스트했다. 생물 발광에있는이 감소는 감소 된 세포의 ATP와 일치한다. 최대 억제가 특이 로테 타겟팅 후속 실험은 0, 5 μM [농도 범위 0-160 μM 사이에 수행되는 것을 나타내는 사용 로테의 최저 농도 (2.5 μM)에 의해 달성 된 다른 약물과 비교의 대상으로 선정 처음에 10 μm의에 심각한 영향이있는 것으로 확인 된 (다른 곳에 게시 할). 제초제 파라콰트는 활성 산소 종의 증가를 통해 미토콘드리아의 기능에 영향을 미친다. 여기, 우리는 C의 생물 발광에 미치는 영향을 보여 24 시간 (그림 2)에 대한 농도의 범위에 노출 된 후 간스 변형 PE254. 변형 루크 :: GFP 융합을 수행으로, GFP의 형광은 루게릭 병이었다O 정규화하는 수단으로 측정 하였다. 6,9- 파라콰트 크게 생물 발광, GFP 형광 정규화 생물 발광을 감소시켰다. 둔넷 (Dunnet) 사후 시험 차량 제어와 관련하여 상당한 차이 파라콰트의 농도를 생물 발광과 정규화 생물 발광 4 및 8 mm로했다뿐만 아니라 정규화 생물 발광 2 mM의 것으로 나타났다. 크게 GFP의 형광을 줄일 수있는 유일한 농도는 mM의 성장 효과와 가끔 죽은 웜 (질적 관찰) 관찰되었다되는 농도 (8)이었다. 생물 발광 (정규화 생물 발광)의 감소, 미토콘드리아의 기능과 ATP 생산에 대한 영향 감소와 일치 형광보다 더 컸다. C. 테스트 시트르산 회로 중간 옥 살로 아세테이트 8 mm의 단일 농도 간스 변형 PE254은 생물 발광의 증가 (그림 3)되었다. 아니 GFP의 형광 없습니다NCE 측정치가 얻어 또는 추가 육안 관찰을 행 하였다; 그러나 하나의 농도에 이러한 반응은 더 농도 범위에 확증 노출 효과의 자세한 관찰을받을만한 것이다. 그것은 그럼에도 그것이 GFP 형광을 평가하여 루시페라아제 수준에 어떤 효과를 제어하는​​ 것이 바람직 할 것이다 ATP (궁극적으로 더 생산, 시트르산 사이클의 더 큰 활성을 이끌어 가정 될 수있는이 화합물에 의한 생물 발광의 향상은 놀라운 일이 아니다 후속 실험에서). 옥 살로 아세테이트 데이터 세트는 루시퍼 기초 실험에서 본 응답 변동의 정도를 나타내 도시. 경험상 이러한 가변성은 특히 덜 해로운 노광 조건에 대한 테스트 시스템의 기능이다. 반딧불이 루시퍼 라제 저해 화합물 DDD00001434는 DDD0001477, DDD00000635과 DDD00023047는 폴리 우레탄에 효과를보고 시험관 모두를 시험 하였다rified 및 생체 내에서 효소를 사용하여 C. 엘레의 루크 : GFP 변형을 표현. 시험 화합물 중 노광 조건 하에서 선충 사멸을 초래한다는 증거는 없었다. 모든 4 화합물 (25) 및 100 μM (도 4a)를 테스트 2 농도에서 시험 관내에서 루시페라아제 활성에 영향을 미쳤다. DDD00001434는 생체 내 생물 발광 (그림 4B)의 큰 감소를위한 신뢰할 수있는 명분을 제공하는, 거의 완전히 정제 된 루시 페라 제의 활성을 죽였다. 직접 비교하지 않지만, 시험 관내 및 생체 내 분석에서 DDD00023047에 응답하여 두 분석에서 유사했다. DDD0001477과 DDD00000635는 체외보다 생체 내에서 더 큰 감소를 일으키는 원인이되었다. 이들 화합물은 22 시간 전에 루시페린 기판 라이브 웜에 제공하고, 결과 루시페린이되었을 때 그들이 쉽게 루시퍼 라제 활성 부위에서 변위되지 않은 것을 반영 available가. 또한, DDD0001477 및 DDD00000635 셀룰러 ATP 수준에 추가적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 반딧불 루시 페라 제를 포함하지 않는 방법에 의해 평가되어야 할 것이다. 참고로 DDD00000635을 화합물에 노출 라이브 웜에 GFP 신호의 강한 강화했다. 이는 이하에서 논의 될 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> 미토콘드리아 복합체 I은도 1은 C. 로테의 에너지 상태를 감소 억제제 엘레 스트레인 PE254의 생물 발광에 의해 측정. 동기화 L4 스테이지 웜 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 2, 1 % DMSO 내의 160 μM 로테 노출 (45-46 시간 L1 유충에 제공 음식 후) 시간 (짧은) 또는 각각 48에서 24 시간 (긴 노출) 생물 발광의 사전 판독 및 웜 개발의 69 시간 음식을 제공 한 후. 생물 발광 단위 (상대 라이트 유니트, RLU)을 차량 (1 % DMS의 백분율로 나타내었다O) 값. 오차 막대는 각각의 농도에서 로테 복제 기술의 SEM을 도시한다 (N = 6). 테스트 한 모든 농도는 비히클 대조군 (p &lt;0.001)에 관하여 매우 유의 한 차이의 결과. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> 산화 적 스트레스에 파라쿼트도 2는 C.의 에너지 상태를 감소 (생물 발광 측정) 농도 의존적으로 간스 스트레인 PE254. (L1 유충에 제공 음식 후 41 시간에서이 경우에 편리) 동기화 L4 스테이지 웜은 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 또는 8로 노출시켰다 24 시간 동안 MM의 파라쿼트. GFP의 형광 (단위 상대 형광 단위, RFU)는 생물 발광 데이터 (단위 RLU), 65 시간 개발에서 얻은 두 엔드 포인트를 정상화하는 데 사용되었다. 컨트롤 데이터의 비율 (1 % DMSO)로 표현된다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사(N = 서로 다른 농도 5, N = 18 컨트롤). 일원 분산 분석 : *** P &lt;차량 제어 0.001 상대. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> 그림 3. TCA 회로의 중간 옥 살로 아세테이트 (8 mM)을 C의 생물 발광을 강화 엘레 변형 PE254. 동기화 L4 무대 웜 (L1 유충에 제공 음식 후 45 ~ 46 시간)을 갓 30 분 ± 18 시간 동안 8 MM의 옥 살로 아세테이트 준비에 노출되었다. 생물 발광도 (RLU)을 ± 63.5 시간 1 시간의 발달시 판독하고, 차량 제어의 백분율로 표현 하였다 (DDH 2 O). 다른 열은 동일한 실험에서 서로 다른 96 웰 플레이트에 분배 8 기술 복제의 다른 데이터 세트를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 8). 이 방법-ANOVA &#39;설정&#39;과 &#39;집중&#39;요소로와 : ̵6; 설정 &#39;P&gt; 0.05,&#39;농도 &#39;P &lt;0.001과 상호 작용 용어 P&gt; 0.05. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> (B) <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> 반딧불 루시 페라 제 발광에 알려진 억제 활성 (DDD00023047 : DDD00001434, C2 : DDD0001477, C3 : DDD00000635 및 C4 C1) 던디 신약 화합물 라이브러리 (13) 4 화합물에 대한 응답 그림 4. 테스트. 정제 된 반딧불 루시퍼 라제의 활성에 대한 화합물 (A) 효과, (빛 단위로 측정 RLU) 비히클 대조군에 대한 백분율로 나타냈다. ATP 생물 발광 CLSII 키트 (로슈, 만하임, 독일)의 웰 (96-w 백색에 분주 루시퍼 라제 효소의 동일한 양의 지시에 따라 사용 하였다엘 마이크로 타이 터 플레이트). 10 μM ATP 및 화합물 1 μL의 최종 농도를 제공 하였다 (최종 농도를 나타냄) 또는 DMSO (1 %)를 첨가 하였다. 발광 신호는 10 초 동안 통합되었습니다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 4). 분석 : 일원 분산 분석; * p &lt;0.05 *** p &lt;차량 제어에 대하여 0.001. 및 C2와 C3 상당한 (각각 DDD0001477 및 DDD00000635; P &lt;0.05). GFP의 형광에 (B) 생물 발광의 생체 측정, 표준화 된 생물 발광하고, C1 (P &lt;0.001 DDD00001434)에 매우 중요한 25과 100 μm의 차이점 C.의 GFP 형광 22 시간 동안 시험 화합물에 노출 된 후 67 시간 개발시 엘레 변형 PE254. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 8). 통계 분석 (편도-ANOVA)는 3 데이터 세트 (3 XN = 8)에서 풀링 된 데이터에 대해 수행. * p &lt;0.05 *** p &lt;각 차량 제어에 대하여 0.001. DifferenC4 (DDD00023047)에 노출 된 다음 정규화 된 생물 발광에 대한 25 100 μM 만 통계적으로 유의 한 (P &lt;0.05) CES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 하루의 시간 </td><td> 1 일 </td><td> 2 일 </td><td> 3 일 </td><td> 4 일 </td><td> 5 일 </td><td> 6 일 </td><td> 7 일 </td><td> 8 일 </td></tr><tr><td> 9 ~ 10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 5 단계 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 5 단계 </td></tr><tr><td> 11 ~ 12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 단계 </td><td> 5 단계 </td></tr><tr><td> 12 ~ 13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 단계 </td><td></td></tr><tr><td> 13 ~ 14 </td><tD&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 ~ 15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ~ 16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> 1 단계 </td><td></td><td></td><td></td><td> 3 단계 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (17 ~ 18) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> 2 단계 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 프로토콜 단계 표 1. 개요 선충 실험의 각 날에 (3 절)을 수행하고 타이밍을 제안한다.

모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에서 미토콘드리아 억제제의 효과를 생체 내에서 검출하고 잠재적인 강화 화합물을 식별하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능을 조절하는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

다음 실험의 전반적인 목표는 모델 생물인 C. elegans를 사용하여 약물의 미토콘드리아 독성 또는 유익한 효과를 확인하는 것입니다. 이는 녹색 형광 단백질과 융합된 반딧불이 루시페레이스 효소를 발현하는 형질전환 예쁜꼬마선충 균주에서 ATP 수치를 in vivo로 정량화함으로써 달성됩니다.이 융합 유전자는 선충에게 두 가지 뚜렷한 특성을 부여합니다. 첫째는 기질인 Lucifer가 제공되었을 때, 선충이 세포 내 ATP 저장량에 비례하여 가시광선 범위의 빛을 방출한다는 것입니다. 둘째는 적절한 파장의 빛을 조사했을 때, 강한 녹색 형광을 나타낸다는 점입니다.형광은 선충의 TP 수준과 무관하며, 질량 또는 개체 수에 비례합니다. 따라서 이를 생물 발광 측정값을 정규화하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적인 분석 과정 동안, 발달 단계가 동기화된 벌레 집단을 L4 유충 단계까지 배양합니다.그 후 선충을 시험 약물 화합물로 일정 기간 처리한 다음, 형광과 생물 발광을 모두 측정합니다. 결과는 잠재적인 약물 독성을 나타냅니다. 생물 발광이 감소했을 때 신호가 강화되면, 이는 미토콘드리아 기능에 유익한 효과가 있는지 추가 테스트를 진행할 적격 후보(hit)임을 나타냅니다.배양 세포를 이용한 약물 스크리닝과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 인간과 유전학적 상동성이 50%에 가까운 살아있는 다세포 생물 전체의 생리학적 맥락에서 스크리닝이 수행된다는 점입니다. 또한 인간과 마찬가지로, 이 우아한 생물은 성체로 성장하기 위해 미토콘드리아 산화적 인산화가 필요하며, 그 미토콘드리아는 구조, 기능, 생체 에너지학 측면에서 포유류의 미토콘드리아와 많은 특성을 공유합니다. 프로토콜 내의 핵심 매개변수에는 노출이 시작되는 발달 단계, 해당 약물에 대한 선충의 노출 시간, 각 웰에 유사한 수의 선충을 분주하는 것, 그리고 당연히 오염 방지가 포함됩니다. 1일 차에 멸균 조건 하에서 2 mL의 S 완전 배지가 담긴 6 cm 선충 성장 배지 플레이트로부터 선충을 30 g/L의 E. coli가 포함된 플라스크로 옮깁니다.S 완전 배지에서 OP 50을 배양하고, 4일째에 플라스크를 흔들어 배양합니다. GR 선충 배양액을 표백 처리하여 알을 수확하고 벌레 개체군을 동기화합니다. 그 후, 15 mL의 S 완전 배지가 담긴 유리 플라스크에 알을 넣고 밤새 흔들어 배양하면, 다음 날인 5일째에 선충들이 동일한 성장 단계에 이르게 됩니다. 부화한 벌레의 수를 결정하기 위해, 매번 깨끗한 팁을 사용하여 선충액 100 µL씩 3회 분주하여 0.01% tween 20이 첨가된 배지 900 µL가 들어 있는 각각의 마이크로 튜브로 옮깁니다. 이때 팁에 붙어 있는 벌레들을 떼어내기 위해 피펫팅을 여러 번 반복합니다.그 다음, 세 개의 희석 튜브 각각에서 10 µL 방울 네 개를 따로 취해 선충의 수를 세고, 10 µL당 선충 10마리가 포함된 20 mL 배양액 두 개를 조제하는 데 필요한 선충 현탁액의 부피를 계산한 뒤, 대략적인 부피를 미리 무게를 잰 15 mL 원뿔형 튜브 두 개에 분주합니다. 튜브의 무게를 측정하여 실제 분주된 부피를 결정합니다. 이후 목표 부피를 맞추기 위해 가볍게 볼텍싱하고 초과 부피를 제거합니다.이제, 튜브당 총 14 mL의 신선한 S 완전 배지로 선충을 세척하고, 30 g/L의 OP 50이 포함된 S 완전 배지 5 mL에 펠렛을 다시 현탁합니다. 이후 선충을 30 g/L의 OP 50이 포함된 S 완전 배지 15 mL가 들어 있는 원추형 유리 플라스크로 옮깁니다.플라스크당 총 부피가 20 milliliters가 되도록 OP 50을 넣고 급여 시간을 기록합니다. 10 microliter 방울 9개의 선충 수를 평균 내어 배양액이 10 microliters당 10마리의 선충이 되도록 희석되었는지 확인합니다. 배양액을 인큐베이터에 넣고 42~44시간 동안 배양합니다.7일째에, 지속적으로 부드럽게 흔들어주며 선충 배양액을 하나의 플라스크에 모읍니다. 그런 다음, 3~4 mL의 선충 분취액을 하나의 60 mL 멸균 트로프(trough)로 옮깁니다. 8채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 부유된 선충 25 µL씩을 분주합니다.바닥이 평평하고 투명한 검은색 마이크로타이터 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 플레이트의 뚜껑을 다시 닫고 따로 둡니다. 플레이트 두 개에 파종을 마칠 때마다, 소실된 부피를 보충하기 위해 선충 2.5 milliliter 분주액 두 개를 다시 트로프(trough)로 옮깁니다.13~14개의 플레이트에 선충을 분주한 후, 각 웰에 S 완전 배지 74 µL를 첨가하고 약물을 투여할 때까지 습윤 챔버와 진탕 배양기에 옮겨 진탕 배양합니다. 테스트용 96 웰 약물 플레이트 2개를 해동합니다. 그 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 팁을 매번 교체하며 분주합니다.첫 번째 약물 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 1 µL를 취해 선충 플레이트의 1~5번 컬럼으로 옮깁니다. 약물 플레이트의 두 번째 컬럼에서 다시 1 µL를 취해 선충 플레이트의 8~12번 컬럼으로 옮깁니다. 그 다음, 선충 플레이트의 6번과 7번 컬럼에 용매 1 µL를 첨가합니다.약물 플레이트의 나머지 컬럼을 사용하여 동일한 방식으로 나머지 선충 플레이트를 처리하며, 이때 모든 플레이트를 vehicle로만 처리한 대조군 플레이트 두 개를 반드시 포함하십시오. 그런 다음 8일 차에 모든 플레이트를 진탕 배양기의 습윤 챔버로 되돌려 20~22시간 동안 더 배양합니다. 형광 측정을 위한 배경 대조군 플레이트를 준비하려면, 모든 플레이트를 vehicle로만 처리한 선충 플레이트의 웰 내용을 합친 후 선충이 가라앉을 때까지 2~3분 동안 기다립니다.그 후 snat를 포함하는 박테리아를 수집하고, 투명한 바닥이 있는 검은색 마이크로플레이트의 각 웰에 100 µL 샘플을 분주합니다. 현미경으로 플레이트를 관찰하여 선충이 보이는 웰을 확인하고, 형광 배경 추정치 계산에서 해당 웰들을 제외합니다. 마지막으로 형광을 측정하여 각 플레이트의 생물 발광을 측정합니다.그 다음, 각 웰에 갓 조제한 발광 버퍼 50 µL를 분주하고, 플레이트를 진탕 플랫폼 위에 올린 후 3분 뒤에 타이머를 시작합니다. 측정당 1초 간격으로 발광도를 측정합니다. 이 첫 번째 대표 실험에서, 미토콘드리아 복합체 I 억제제인 rotenone은 다양한 농도 범위에서 비교적 짧은 노출과 긴 노출 모두 이후 선충의 빛 출력을 감소시켰습니다.본 실험에서는 제초제 파라콰트(paraquat)가 C strain PE 2 54의 생물 발광 GFP 형광 및 정규화된 생물 발광을 유의하게 감소시키는 것이 입증되었습니다. 또한, 생물 발광의 감소 폭이 형광의 감소 폭보다 더 컸으며, 이는 해당 약물에 의해 유도된 미토콘드리아 기능 저하 및 ATP 생성 감소라는 알려진 효과와 일치합니다. 이 그래프는 8 mM의 단일 농도에서 선충의 생물 발광을 강화하는 화합물인 시트르산 회로 중간체 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 예를 보여줍니다.이러한 반복 실험 간에 나타나는 실험적 변동성은 Luciferase 기반 실험에서 일반적인 현상임을 유의하십시오. 본 실험에서는 Firefly luciferase 억제 화합물이 25 micromolar 및 100 micromolar 농도에서 in vitro luciferase 활성에 영향을 미치는 것이 관찰되었으며, DDD 화합물에 의해 활성이 거의 완전히 감쇠되었습니다. 1, 4 3 4, 직접적인 비교는 어려우나, in vivo에서도 Luciferase 억제 화합물 처리 후 생물 발광이 유의하게 감소하는 것이 관찰되었습니다.생물 발광의 변화가 생체 내 ATP 수치의 변화가 아니라 루시퍼라아제 효소 억제제의 작용으로 인해 발생할 수 있음을 입증하는 과정입니다. 이 절차를 수행할 때는 화합물이 벌레의 에너지 상태에 영향을 주기보다 반딧불이 루시퍼라아제 효소의 활성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 산소 소비량 측정, 미토콘드리아 막 전위 측정, 활성 산소종 결정 또는 *C. elegans* 균주 내 미토콘드리아 시각화와 같이 미토콘드리아 기능을 평가하는 다양한 기술을 사용하여 하위 가열(sub heats)을 검증할 수 있습니다.GFP 태그가 부착된 미토콘드리아.

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

출처: Anderson, Q. L. et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 숙주-병원체 상호 작용 중 유전자 녹다운을 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 고처리량 스크리닝 방법을 보여줍니다. 녹다운 웜을 준비하고 이를 분석 플레이트로 옮겨 병원체 유발 웜 사멸의 효과를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다.

C. elegans 녹다운 스크리닝을 위한 멀티웰 액체 기반 분석

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 미토파지를 연구하기 위한 생체 내 분석을 보여줍니다. 선충을 미토파지 유도 약물에 노출시키면 손상된 미토콘드리아의 미토파지 수용체인 DCT-1과 자가포식체막 단백질 LGG-1 사이의 공동 국소화에 의해 미토파지의 발생을 평가합니다.

형질전환 선충에서 Mitophagy를 검출하기 위한 In Vivo 분석

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

유전자 인코딩 히스톤 - miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

학습하세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 미토콘드리아 기능 조절제 스크리닝 방법입니다. 발광 및 형광 측정으로 ATP 수준을 정량화하여 약물 독성과 유익한 효과를 식별할 수 있습니다.

Screenable

더 많은 동영상 탐색