Abstract
许多革兰氏阴性细菌包括致病耶尔森菌属使用III型分泌系统，转运的效应蛋白到真核靶细胞。在宿主细胞内的效应蛋白操纵细胞功能的细菌的益处。为了更好地理解III型分泌宿主细胞相互作用，灵敏，准确的检测过程中控制测量易位是必需的。我们在这里描述了基于一小肠结肠炎耶尔森效应蛋白片段的融合的测定法（耶尔森外蛋白; YopE）的应用程序。用TEM-1β-内酰胺酶的易位的定量分析的测定法，依赖于细胞裂解渗透剂FRET染料（CCF4 / AM）通过易位β-内酰胺酶的融合。 CCF4的由β-内酰胺酶的头孢菌素核的裂解之后，从香豆素FRET荧光素被破坏，香豆素结构部分的激励导致的蓝色荧光发射。该方法的不同应用在文献中突出了其通用性已被描述。该方法允许易位体外的分析以及在体内，例如，在小鼠模型。可以用酶标仪，流式细胞仪或荧光显微镜进行检测荧光信号。在由不同耶尔森突变这里描述的，在效应子融合的体外易位至HeLa细胞中设置由激光扫描显微镜监测。通过实时β-内酰胺酶的效应融合录制FRET记者细胞内转化提供了可靠的定量结果。我们在这里展示示范性数据，由Y.展示增加易位菌 YopE突变体比野生型菌株。
Introduction
III型分泌系统，它们由不同的属的革兰氏阴性菌，直接递送细菌编码的效应蛋白到真核靶细胞利用专门蛋白出口的机器。而分泌机制本身是高度保守的，专门集效应蛋白进化的不同细菌种类中，以操纵细胞信号途径和促进特定细菌的毒力的策略1。万一耶尔森氏菌，最多七个效应蛋白，所谓Yops（ 耶尔森氏菌外蛋白），被易位在宿主细胞接触并一起行动颠覆免疫细胞反应，如吞噬作用和细胞因子产生， 即，以允许细菌的胞外生存2-4。易位的处理严格控制在不同阶段5。它被确定，T3SS初级活化通过它的接触到目标策触发LL 6。然而，这种引发的精确机制仍有待阐明。在耶尔森所谓微调易位的第二电平由上调或下调细胞的Rho GTP结合蛋白的Rac1或RhoA的活性实现的。 Rac1的激活例如通过侵袭素或细胞毒性坏死因子Y（CNF-Y）导致增加的易位7-9，而GAP（GTP酶活化蛋白质）易位YopE的功能下调Rac1的活性，因此通过一个负反馈型降低易位机制10,11。
有效和精确的方法是前提，以研究如何易位是在小肠结肠炎耶尔森氏宿主细胞相互作用调控。许多不同的系统已被用于这个目的，每个具有特定的优点和缺点。一些方法依赖于裂解感染的细胞，但不细菌由不同的去污剂随后免疫印迹分析。钍这些方法Ë共同的缺点是次要的，但不可避免的细菌裂解潜在污染的细胞裂解液与细菌相关的效应蛋白。然而，提出了治疗细胞用蛋白酶K以降解细胞外的效应蛋白和后续使用毛地黄皂苷为真核细胞的选择性裂解，以尽量减少此问题12。重要的是，这些检测主要依赖于高品质抗效应的抗体，其中大多是尚未投放市场。企图利用效应蛋白翻译融合和荧光蛋白GFP的像并监控易位没有成功可能是由于该荧光蛋白的球状三级结构和分泌装置的无法分泌13之前展开它们。 百日咳毒素然而，有几个不同的记者的标签，如CYA（钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶）域cyclolysin 14或闪存标签被成功用于分析易位。在前者的测定CYA的酶活性被用于扩增胞内融合蛋白的信号，而闪光标签，在很短的四半胱氨酸（4Cys）基序标签，允许与biarsenical染料的Flash标签，而不会干扰分泌的过程中15。
这里所应用的方法是由夏邦杰等人报道首次并基于对细胞内的荧光共振能量转移（FRET）染料CCF4通过易位效应TEM-1β-内酰胺酶融合体16（图1A）的转换。 CCF4 / AM是其中香豆素衍生物（供体）和荧光素部分（受体）由头孢菌素核连接的细胞穿透物化合物。在被动进入真核细胞，所述非荧光酯化CCF4 / AM化合物由蜂窝酯酶处理以带电和荧光CCF4从而被困内的小区。激发香豆素结构部分在405nm处的结果的FRET的荧光素部分，其在530nm发射的绿色荧光信号。头孢菌素核的β-内酰胺酶的FRET的裂解之后被破坏，香豆素结构部分的激励导致的蓝色荧光发射at460纳米。该方法的不同应用在文献中突出了其通用性已被描述。该方法允许易位体外的分析以及在体内，例如，该技术被用来在小鼠感染模型来识别体内 17-19针对易位的白细胞群。信号读出可使用酶标仪，流式细胞仪或荧光显微镜进行。值得注意的是，该方法还提供了感染过程20,21期间监视易位实时由活细胞显微术的可能性。这里激光扫描荧光显微镜涂敷了用于readou荧光信号吨，因为它提供最高的灵敏度和精确度。特别是，能力调整与纳米精度与高敏感检测器组合的发射窗有助于优化荧光检测和最小化串扰。此外，该显微镜的设置可适于易位实时监测和有可能允许对宿主 - 病原体相互作用的在细胞水平上同时分析。
在这项研究中易位Y.率菌野生型菌株和YopE缺失突变体表现出hypertranslocator型10,11示范性地进行了分析。
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Protocol
1.峰值发射和串扰测定（参见图2）
- 为了确定该发射峰和施主之间的串扰（香豆素衍生物V450）和受体（荧光素）的染料量，执行标记的细胞都在405nm激发个体荧光团的光谱扫描。
- 确定每种染料的将被用于供体和受体通道（这里455-465纳米和525-535纳米）的峰在10纳米的带宽。积归一化强度在波长，并计算在受体通道，反之亦然（图2）的串扰供体染料的平均百分比。
2.准备Y的菌菌株用于细胞培养的感染
- 使用下面的毒株：WA-314 PMK-OVA（WA-314转化的质粒PMK-BLA 17和PMK-OVA 17，分别）和WA-314ΔYopEPMK-BLA（WA-314ΔYopE用该质粒转化PMK-BLA 17）
- 感染连胜Y.前至少两天菌菌株WA-314 PMK-OVA，WA-314 PMK-BLA和WA-314ΔEPMK-BLA从包含所需的抗生素（卡那霉素WA-314 PMK-BLA和WA-314 PMK-OVA LB琼脂平板冷冻库存;卡那霉素和四环素WA-314ΔEPMK-BLA）和成长O / N在27℃。此后保持板长达一个星期4℃。
- 感染前一天接种含有所需抗生素3 ml的LB培养基的与各自的菌株的一个菌落，并培育O / N在27℃在摇床以180rpm。
- 关于感染当天接种2毫升的O / N培养的成40毫升的新鲜LB培养基无抗生素并在摇床孵育90分钟，在37℃下以180rpm以引起III型分泌系统的表达。
- 转移培养物到合适的管中，保持培养物在冰上或在4℃下今后。离心培养物10分钟，在5000×g离心和4℃。
- 重悬细菌沉淀在2-3毫升冰冷的PBS。通过使用分光光度计稀释细菌悬浮液，以8×10 8 CFU / ml的浓度。分别确定相应的光密度。保持这个悬挂在冰上，直到感染的HeLa细胞。
3.电镀HeLa细胞
- 一天感染种子前1.5×10 4个细胞的HeLa细胞中含有在96孔板的孔中的10％热灭活胎牛血清（FCS），在37℃下培养在5％CO 2培养箱200μl的DMEM中。种子三眼井每一株（三个不同的培养时间）。
4.感染HeLa细胞与CCF4加载
- 感染HeLa细胞通过加入3.5微升细菌悬浮于培养基中，并轻轻吹打培养基两次混合。让细菌沉积物上到细胞中，以每细胞约100细菌的MOI（感染部分）。对于时间过程开始感染在-90分钟，-60分钟，-30分钟，并在37℃下在5％CO 2培养箱直到0分钟以实现共同的终点。
- 当孵化完成后，小心吸媒体不去除HeLa细胞，并加入50微升PBS含20微克/毫升氯霉素停止效应和2.5mM丙磺舒的表达，减少CCF4出口。
- 在这一点上96孔板转移到显微镜载物台，并定义合适的斑点在每个以后的分析孔。在10分钟内完成这个步骤（对收购事项之详情参见5.1节）。
- 每孔中，加70微升CCF4 / AM加载溶液（0.24微升溶液A，1.2微升B溶液，18.56微升溶液C（溶液A，B和C提供的范围内CCF4 / AM装载套件）和50微升的PBS（含20微克/ ml氯霉素和2.5mM丙磺舒）使用多pipette孵育5分钟，在室温。从现在开始，工作不中断。
- 吸加载溶液，并添加含有20微克/ ml氯霉素和2.5mM丙磺舒的使用多移液管将100μlPBS中。然后迅速在96孔板转移到显微镜载物台，并从加载溶液的吸液在10分钟内开始采集。
5.激光扫描显微镜和数据分析
- 图像采集
- 设定成像条件的方式以最大化总光子计数和最小化光毒性，漂白和交叉激发。
- 在现代激光共聚焦显微镜，使用20X高数值孔径浸泡的目的，打开探测器针孔2.5艾里单位（ 即宽光学切片），选择高灵敏度的GaAsP探测器同时与主动供体和受体通道，8位深度，〜750nm的像素大小，3倍帧平均和EXCITe为405nm的二极管激光器的10％。
- 为了确保正确的量化设置两个通道的检测器增益为相同的值，并避免任何饱和的像素。
注意：在此，增益被设定为150％。
- 保证连续浸没用1ml注射器扩频浸没介质到孔的底部，例如，避免任何气泡的俘获。
- 激活的透射光，并找到在每个井的视图的代表字段。使用正确校准自动阶段，标志着该软件的位置。
- 去除板染色后（参见4.3节），重新插入板和顶部增加的重量，以避免焦点漂移。回顾与激光扫描方式保存的位置，并适当调整的重点和侧卧位。
- 设置的时间间隔为2分钟，持续时间为2小时，并开始收购。
- 设定成像条件的方式以最大化总光子计数和最小化光毒性，漂白和交叉激发。
- 图像量化（例子是位平面软件选装定是诸如了Imaris）
- 导入数据集到软件，使像素矩阵的算术运算。通过拖放含有供体和软件图标受体通道的源文件执行此操作。
- 使用相同的偏移减去在这两个信道的背景。要做到这一点，请单击菜单，然后单击图像>处理>基线扣除。选择每个通道和输入基准值。
- 纠正渗出通过供给方信道（CH1）到受体通道（CH2）用的预先确定的校正系数f（参见1.1）的，创建一个新的信道：
CH2 = CH 2 - 通道1 *˚F
注：渗出通过受体进入施主信道的则没有检测到过度的噪音水平。- 点击菜单>图像处理>通道运算在和进入ABS（CH 2 - （CH1 * 0.33））。随后删除频道2通过单击菜单>编辑>删除频道。确保渗出通过修正受体通道保持作为新的渠道2.可选：通过进入菜单>编辑>图像属性更改从灰色渠道颜色与原来的颜色。选择4频道>映射颜色>基础颜色和改变它，例如，绿色环保。
- 创建具有以下操作来确定相对FRET系数的新渠道：
CH 3 = CH 2'/（CH1 + CH2“）- 进入菜单>图像处理>通道运算在和输入CH2 ./（CH1 + CH2）
- 对于一个8位图像的FRET通道进行适当的可视化，创建第四个通道：
CH4 = 255 * CH3- 进入菜单>图像处理>通道运算在并输入255 * CH 3。通过进入菜单>编辑>图像属性改变通道的颜色。选择4频道>映射颜色>颜色表文件>喷射。
- 应用一个3x3的中值滤波通道CH3和CH4塔吨将减少图像中的噪声。要做到这一点，请单击菜单>图像处理>平滑>中值滤波器。选择这两个渠道，应用过滤器大小“3x3x1”。
- 对于蜂窝信号定量，检测的细胞在通道4通过适当地设置偏移和过滤结构由尺寸排除太小的结构。
- 选择超越查看并点击图标“ 添加新的表面 ”上。限定在表面窗口的检测算法参数。为了更快的处理，激活两个复选框“段利息只有一个区域”和“处理整个图像最后”。通过编辑其尺寸限定感兴趣的区域。
- 选择通道4作为信源通道和阈值>背景减法（局部对比度）设置的阈值，并设置直径10微米。设置最小强度阈手动0和最大阈值的最大的IntensiTY。过滤结构由区，并设置最小值例如，187平方微米。完成表面检测。
- 提取的平均值为供体荧光强度（CH1）和相对的FRET系数（CH3）和在蜂窝实体它们的标准偏差。要做到这一点，去表面性能。通过选择面风格/质量>表面改变结构的外观。通过单击过滤器选项卡上选择的所有结构。通过将流程选择>统一统一的检测机构。导出通过点击统计标签表面的统计数据为MS Excel>导出所有统计到文件。
- 随着时间的推移绘制这些值。确定的信道供体荧光增加为每个条件的合理参数来表示易位效应物的量最大斜率的10分钟时间间隔。计算斜率为m =Δ供体荧光强度/Δ时间（分钟）。
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Representative Results
为了证明所描述的方法的能力进行定量分析的效应易位至靶细胞，二耶尔森株不同易位动力学进行了研究：Y。菌野生型菌株WA-314（血清型O8，窝藏的毒力质粒pYVO8 22）及其衍生物WA-314ΔYopE（WA-314窝藏pYVO8ΔYopE23）。此前的研究显示，Y.菌突变体缺乏功能YopE表现出显著高于烨转率10。两个菌株用为YopE和TEM-1β-内酰胺酶（PMK-BLA）17的 n-末端分泌信号的融合载体编码。 WA-314被加转化为相应YopE卵白蛋白融合（PMK-OVA 17），作为阴性对照的载体编码。 30，60和90分钟的培养时间进行，以进一步评估method`s有效范围内的施加第二适合定量。两个不同的读数被用于数据分析：供体荧光（CH1）和相对的FRET系数（CH 3 = CH 2'/（CH1 + CH2'））（图1B和1C）。
为阴性对照菌株的供体通道强度（CH1）WA-314-PMK-OVA绘制随时间没有显示出上升的荧光发射无关的温育时间（图1B）。与此相反，在WA-314-PMK-BLA感染的细胞中检测到的增加的荧光强度随时间指示YopEβ-内酰胺酶的融合在靶细胞的细胞质的存在。正如预期的荧光强度的最大斜率是积极与感染（：0.10 /分钟，60分钟感染：0.33 /分，90分钟感染：感染的30分钟0.76 /分）的长度相关，表示不同浓度的β-易位的酰胺酶可以区分。根据以往的研究WA-314ΔYopE-PMK-BLA感染的细胞表现出的荧光强度的更快速增加相比野生型菌株（感染30分钟：1.28 /分钟，60分钟感染：1.53 /分，90分钟感染：1.41 /分）。有趣的是，扩大感染至90分钟没有进一步加快供体荧光的上升相比感染的60分钟（ 图1B）。这一发现可以推测是通过由WA-314ΔYopE-PMK-BLA，其既可以抑制有效易位以外感染的60分钟或导致荧光染料的损失，由于质膜完整性的破坏所施加的渐进的细胞毒性作用进行说明。通过使用相对FRET系数（CH 3），用于分析所提供的结果是在良好的根据由单独的供体通道获得的结果。然而，在某些条件下（WA-314ΔYopE-PMK-BLA，60和90分钟的感染）表示非常大量的易位β-内酰胺酶的融合，显然CCF4基材在地开设处理的成像可被启动之前。这些条件不会允许用于计算一个合理的最大负斜率，因为在曲线的相关部分被错过了在此数据表示（图1C）。相对FRET系数信道的图像提供给比较单个细胞（图1D）之间的差异的可能性。
效应易位通过TEM-1 YopE融合在Y.图1.定量分析菌 。 CCF4衬底通过易位TEM-1β-内酰胺酶（A）的水解用激光扫描显微镜监测。激发在405nm处产生了完整底物的绿色荧光发射（530 nm），而在切割的水解公关的蓝色荧光发射（460 nm）的oduct（香豆素）（B，C）的数据显微镜定量通过绘制施主信道强度（CH1）或计算和绘图相对FRET系数（CH 3 = CH 2'/（CH1 + CH2'））进行分析。数据代表三次独立的实验。（D）的描绘的显微照片（FRET通道）取自代表电影在指定的时间点。 WA-314ΔE-PMK-BLA感染的细胞表现出的相对的FRET系数的更快速下降比野生型WA-314-PMK-BLA（60分钟感染）。比例尺，20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.串扰测定荧光V450和FITC的。两个个别荧光团的光谱的测定用共聚焦显微镜。渗出通过供给方V450进入525-535毫微米检测器的范围内的受信道是从线性回归（插入）来计算。串扰的两个测量值计算的平均百分比等于0.33。渗出通过受体FITC进入捐助通道（455-465纳米）中没有检测过的噪音水平。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们在这里成功地应用于基于TEM-1β-内酰胺酶报告基因分析的效应易位中用 Y定量分析菌 。这种敏感，特异的和相对简单的技术的许多不同的变化，在文献中已经描述。在这项研究中的激光扫描显微镜进行最灵敏和最精确的检测荧光信号的进行。专门校正的供体和受体染料和单独调节检测的带宽之间的串扰允许测量更高的精度相比该方法的其它变型。结果清楚地表明，该方法是能够定量分析的易位。不同的培养时间代表不同浓度的细胞内的β-内酰胺酶与供体荧光强度的斜率呈正相关。另外，WA-314ΔYopE的显著高于易位率比较与野生型菌株WA-314可以证明。
数据分析两个备选方案都适用：捐助通道强度和相对FRET系数。使用供体通道的优点是，它直接表示的CCF-4水解产物（香豆素）的积累。这种方法是可能的微观设置中，因为比在读板器校正用供体的比率在细胞密度差异等/受体是没有必要的。然而，CCF4染料或其水解产物的出口仍然是在这种方法的可能的混杂因素。这个缺点可以通过计算相对FRET系数来克服。
在所描述的设置实验在96孔板中进行的。这个格式允许的多个条件在一次实验中测试和有助于节省昂贵的化学品（特别是CCF4 / AM装载盒）。在所描述的工作流程是，开始IM是关键年龄收购在另外的易位β-内酰胺酶的CCF4 / AM负载解决方案，因为CCF4的水解后不久，在规定的时间点立即启动。在案件处理很多条件的同时，调整的重点和横向位置时（步骤5.1.4）可能需要很长时间，妨碍适时启动图像采集。因此，需要平行样品的最大数量被单独确定。
对使用此方法中遇到的主要问题是由HeLa细胞的相当大的出口CCF4基板的在37℃。这种现象不可能通过用丙磺舒治疗的细胞被充分地抵消。因此，我们正在进行的感染过程中决定，而不是监测易位如前所述，首先完整感染和后来加载的细胞与CCF4 / AM染料。采用这种方法，有可能监视在RT所述CCF4基板的处理。在这些条件下热镀观察CCF4的CED出口。 CCF4基板的出口量似乎是细胞特异性;这里所描述的安装允许进行易位也在细胞系的可靠的分析，这强烈地导出CCF4在37℃。
出口CCF4的是不是在一些其它细胞系，允许通过该显微镜设置为实时同时监测感染和易位的处理的问题。这提供了分析易位成单个细胞的可能性，并可以被用来关联易位与宿主细胞相互作用的特定事件，如细 菌粘附或形成微菌落20。因此，该测定法是一种有价值的工具，以进一步阐明如何易位细菌和宿主细胞的相互作用过程中调节的机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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