Summary
Detta manuskript beskriver en modelleringsteknik för kapsel infarkt. Här har vi använt en modifierad photothrombotic teknik med låg intensitet av ljus efter mål kartläggning innan operation. Med denna teknik har vi skapat en begränsad kapselinfarktmodell med ihållande motorisk försämring.
Introduction
Tills nyligen, den "grå substans stroke (GMS) modeller" har uteslutande användas för att förstå patofysiologin av stroke och för att styra utvecklingen av nya behandlingar. Däremot har det skett en ökande förekomsten av stroke som drabbar subkortikala vita substansen hos äldre personer, som utgör 15-25% av alla stroke 1,2. Ett flertal studier har genomförts avseende stroke använder GMS modeller, medan det finns få studier som har använt vita substansen stroke (WMS) modeller. Vita substansen hos gnagare är väsentligt mindre än den vita substansen i människor eller primater. Följaktligen är det svårare att selektivt komma åt och förstöra målregionerna i den vita substansen 3. Dessutom har inga effektiva verktyg utvecklats hittills för att selektivt förstöra den planerade omfattningen av riktade vit substans. Därför har det varit brist på lämpliga modeller för studiet av vita substansen stroke.
Animal stRöke modeller används ofta för att följa utvecklingen av motor återhämtning för utveckling av ny rehabiliterande och terapeutiska metoder. Det är idealiskt att använda en djurmodell, som uppvisar en långsiktig neurologiskt bortfall konkordant med de anatomiska förändringar påvisas i human stroke 4,5. I detta avseende kan en snabb återhämtning av motor underskott och ett brett deltagande av hjärnan efter infarkt lesionering inte vara realistisk i strävan efter strokeforskning. Tidigare kapsel infarkt modeller har gjorts av ocklusion av inre hals eller främre koroidala artärer och spridning av endotelin-1 (ET-1) i den inre kapseln 6-9. Ändå kräver artärocklusion noggrann dissektion av artärer, men det producerar ett brett område av infarktskada, inklusive den inre kapseln, utan ihållande beteendestörningar. Dessutom ET-1 var inte diffust att fullständigt förstöra den bakre delen av den inre kapseln, och därmed mindre markerad eller fortsätta behavioral underskott.
En photothrombotic infarkt modell har använts i stor utsträckning för att generera olika typer av infarkt lesioner i cortex och subkortikala strukturer 10. Tekniken innefattar intravenös administrering följt av fokal belysning, vilket leder till blodplättsaggregation i de små blodkärlen och generering av infarkt lesioner 10. Photothrombotic teknik har i stor utsträckning använts för att skapa GMS lesioner Det har sällan använts för att generera WMS lesioner 5,11. För denna teknik, har en kombination av Rose Bengal färg och ljus bestrålning visat sig vara användbar i förstörelse av målstrukturen, vilket motsvarande funktionella brister. Den viktigaste delen av photothrombotic tekniken är ljusbestrålning, eftersom den bestämmer storleken på infarkt skador. Ljusbestrålning resulterar i olika effekter på grå och vit substans, eftersom spridningen av ljus är mer än 4 gånger högre i vitt matter jämfört med grå substans 12; Följaktligen, om ljusintensiteten har en tillräckligt låg irradians (<1140 mW / mm2), kan man begränsa förlängning som photothrombotic skada påverka i vilken utsträckning den vita substansen (dvs., Inre kapseln). Till exempel, kan ljus av högre energi förmå infarkter i både grå och vit substans, men lägre energilampa kan inducera photothrombosis endast i vit substans. Vidare penetration av ljusenergi var mycket begränsad. Ca 99% av ljusenergi förlorades över 1 mm från ljuskällan 13. Därför förväntas det att exakt riktade, inducerar lägre energilampa photothrombosis endast i den vita substansen med en minimal intrång i grann grå.
Här beskriver vi ett nytt förfarande för att skapa infarkt lesioner i forelimb område i den inre kapseln i gnagare. Vi beskriver den metod för identifiering av forelimb området på den inre capsule, tekniken för ljusbestrålning, inklusive justeringen och tillförsel av ljus, och genereringen av en infarkt lesion. Vi beskriver också beteendetestning användes för att utvärdera fullständigheten hos den kapsulära modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes enligt de institutionella riktlinjerna för Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), och alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid GIST.
1. Pre-lesionering Steps
- Identifiering av Forelimb området på den inre Capsule med AAV-GFP
- Hus och hantera Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 veckor) i enlighet med institutionella och nationella riktlinjer.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg och elektroderna med hjälp av en lämplig steriliserings (ånga eller plasma autoklav). Använda ångsterilisator vid 121 ° C såsom inställning av 30 min för sterilisering och 30 min för torr.
- Söva djuret med en blandning av ketamin-hydroklorid (100 mg / kg) och xylazin (7 mg / kg) via en intramuskulär injektion. Kontrollera djupet av anestesi genom tass nypa. Bibehålla kroppstemperaturen vid 37,5 ± 0,5 ° C via en värmedyna enligtkroppen av djuret.
- Placera djuret i en stereotaktisk ram med hjälp av ett öra bar och mun hållare.
- Rengör och desinficera det kirurgiska stället med 70% alkohol och povidonjod lösning. Infiltrera 2% lidokainhydroklorid under hårbotten i det avsedda skallen snitt område för att minska intraoperativ smärta.
- Applicera veterinär oftalmologiska salva för att förhindra uttorkning av ögonen. Placera en steril duk över djuret till de operativa platser. Upprätthålla alla förfaranden i sterila förhållanden.
- Utför en mittlinje skalle snitt av 2 cm med hjälp av en skalpell och dra huden bilateralt med tråd upprullningsdon. Torka skallen med bomullspinnar och 30% väteperoxid.
- Gör ett hål med hjälp av en handstycke borr över forelimb området motoriska cortex (AP: 2,5 från bregma, ML: ± 2,5 från mittlinjen) och rensa tarmkanalen med mikro currette för virusinjektion.
- Tina AAV-GFP (2 x 10 12 virusmolekyler / ml) på is och last 1 pl avvirus i en spruta 10 | il. Placera sprutan på den stereotaktiska ramen.
- Flytta nålen till färdiga hål och sänka nålen 1 mm djupt in i dura.
- Injicera viruset långsamt (0,1 | j, l / min) med användning av en hög precision mikropump och lämna nålen på plats under ytterligare 10 min för att göra det möjligt för viruset att diffundera ut.
- Efter rengöring operationsstället med koksaltlösning bevattning, säkra såret med 3-0 nylon sutur; frigöra råtta från den stereotaktiska ramen och överföra den till en återvinningskammaren. Administrera ketoprofen (2 mg / kg) via en intramuskulär injektion för postoperativ smärtkontroll.
- Upprätthålla kroppstemperaturen (37 ° C) med värmedyna och administrera andra generationens antibiotika cefemer klass (0,1%, 1 ml) via en intramuskulär injektion och 2% lidokainhydroklorid via subkutan injektion som behövs. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthållasternala VILA. Enda hus djuret tills fullständig återhämtning.
- Efter 2-3 veckors återhämtnings, djupt söva råttan med en överdos av ketamin hydroklorid (300 mg / kg) via en intramuskulär injektion i huven. Bekräfta död animaliska brist på tå nypa respons, puls och andning. Placera råttan liggande i huven.
- Öppna bukhålan via en "Y'-formade snitt för att öppna brösthålan. Tätt klämma aorta descendens med en hemostat och spräcka det högra förmaket av hjärtat från råtta efter blod dränering. Initiera perfusion in i den vänstra ventrikeln av hjärtat med kall 1% paraformaldehyd under 5 min (10 ml / min) följt av 4% paraformaldehyd under 30 min (10 ml / min).
- Avlägsna råtta huvudet från stommen med hjälp av en sax. Gör en mittlinjen snitt från halsen till näsan och ta bort nackmusklerna med hjälp av sax eller rongeur så att skallen är utsatt. dissekera försiktigt skallben och duras ut från hjärnan.
- Extrahera hjärnan och placera råtthjäma i ett 50 ml koniskt rör fylldes med 4% paraformaldehyd över natten. Nästa dag, tvätta hjärnan med 1x PBS 3 gånger och placera den i en 30% sackaroslösning.
- Efter hjärnan helt sjunker till botten av sackaroslösningen 30%, placera hjärnan i cryomold med oktober förening vid -20 ° C i cryotome. Skiva hjärnan i frontalplanet vid en tjocklek av 40 ^ m och ett intervall på 200 | j, m.
- Utför GFP immunohistokemi färgning med hjälp av skjutmetoden 14. Tillämpa primär antikropp (1: 200 av anti-grönt fluorescerande protein, Kanin IgG-fraktion) till hjärnsnitt över natten vid 4 ° C. Den 2: a dagen, tvätta med 1% fosfatbuffrad saltlösning med Tween-20 (PBST) lösning 3 gånger och applicera den sekundära antikroppen (1: 500 av get anti-kanin IgG (H + L)) under 1 timme. Skölj objektglaset med en% PBST 3 gånger. Placera täckglaset på hjärnan skiva.
- Med användning av ett fluorescensmikroskop (excitationsvåglängd470 nm, emissionsvåglängd 525 nm, förstoring 5X), observera AAV-GFP transducerade axoner i den inre kapseln. Jämför placeringen av transducerade axoner med råtthjärna Atlas 15 för att bestämma den stereotaktiska koordinaterna för omvandlade axoner
- Pre-lesionering Justering av ljusintensiteten Lämplig för Kapselkontraktur infarkt modellering
- Byggandet av den optiska Neural Interface
- Skär en lämplig längd (4 cm) av en 27 gauge spinal nål med en stilett insidan med hjälp av en skärborr.
OBS: Kapning kan komprimera och krossa ryggrads nålspetsen; avlägsna mandrängen och polera spinal nålspetsen för att avlägsna den krossade delen av ryggrads nålen och bibehålla den inre kaliber av ryggrads nålen. - Strippa en lämplig längd (10 cm) av manteln av den optiska fibern (125 | j, m med ett 62,5 um kärna) av en sidokorskopplingskabel.
- Sätt i unjacked optiska fiber in i metallröret (yttre diameter: 3,8 mm, innerdiameter: 3,3 mm och längd: 17 mm), som sedan är fastklämd runt fibern. Metallröret är användbart för att fylla utrymmet mellan den optiska fibern och navet i den spinal nål. Kläm fast nedre 1/2 av metallröret med en pressar två gånger.
- Applicera den värmehärdbara epoxi på den optiska fibern och för in den optiska fibern in i ryggrads nålen. Applicera ytterligare epoxi till det tomma utrymmet i navet. Härda epoxin i 20 min vid 100 ° C under stabil fixering.
- Klyva den optiska fibern som sticker ut från spinal nål och polera den optiska fibern vid spetsen av den spinala nålen med hjälp diamantläppning (polering) ark.
- Anslut FC / PC-kontakt en del av korskopplingskabel till kopplaren av grön lasersystemet och mäta ljusintensiteten från spetsen av den optiska fibern med hjälp av digital optisk effekt och energimätare.
- Skär en lämplig längd (4 cm) av en 27 gauge spinal nål med en stilett insidan med hjälp av en skärborr.
- Byggandet av den optiska Neural Interface
2. PhotothromBotic Infarkt lesionering i den inre kapseln
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg och elektroderna med hjälp av en lämplig steriliserings (ånga eller plasma autoklav). Använda ångsterilisator vid 121 ° C såsom inställning av 30 min för sterilisering och 30 min för torr.
- Söva djuret (~ 400 g, 11 - 13 veckor) med en blandning av ketamin-hydroklorid (100 mg / kg) och xylazin (7 mg / kg) via en intramuskulär injektion. Kontrollera djupet av anestesi genom tass nypa. Bibehålla kroppstemperaturen vid 37,5 ± 0,5 ° C via en värmedyna under kroppen av djuret.
- Placera djuret i en stereotaktisk ram med hjälp av ett öra bar och mun hållare.
- Rengör och desinficera det kirurgiska stället med 70% alkohol och povidonjod lösning. Infiltrera 2% lidokainhydroklorid under hårbotten i det avsedda skallen snitt område för att minska intraoperativ smärta. Applicera veterinär oftalmologiska salva för att förhindra uttorkning av ögonen.
- Applicera en steril duk över enimal och exponera operativa platser. Upprätthålla alla förfaranden i sterila förhållanden.
- Utför en mittlinje skalle snitt av 2 cm och dra huden bilateralt med tråd upprullningsdon. Torka skallen med bomulls swappar och väteperoxid.
- Justera höjden av näsan klämman tills bregma och lambda är inriktade på samma nivå. Kritiskt steg: Denna inriktning är kritisk för korrekt närma sig en djupare struktur, såsom vid utförande av en infarkt lesion i den inre kapseln i huvudexperiment.
- Gör ett hål (diameter: 2 mm; AP: -2,04 från bregma, ML: ± 3,0 från mittlinjen) med hjälp av en borr för att inducera photothrombosis.
- Polish och rengör den optiska fibern spetsen av det optiska gränssnittet. Fäst ONI till stereotaktisk ram utan att böja. Kontrollera spetsen på ONI och torka ut det tydligt före och efter insättning av det optiska gränssnittet.
- Mäta laserintensiteten från spetsen på den optiska fibern före införingen av optical-gränssnitt till målstället av råtthjärna. Justera laserintensiteten till 3,5 mW, vilket bekräftas av pre-kirurgi steg, vid spetsen av den optiska fibern.
- Sätt i ONI i målområdet för den inre kapseln (-7,8 mm bekräftade från pre-kirurgi steg) genom borrhålet.
- Bibehålla kroppstemperaturen vid 37,5 ± 0,5 ° C under photothrombosis. En lägre kroppstemperatur kan inte producera den förväntade omfattningen av infarkt. Injicera Rose Bengal (2 ml / kg) via svansvenen.
- Slå på 532 nm grön laser under 90 sekunder 1 minut efter Rose Bengal injektionen. Efter bestrålning, försiktigt bort ONI från hjärnan. Efter rengöring av operationsområdet, säkra såret säkra såret med 3-0 nylon sutur; frigöra råtta från den stereotaktiska ramen och överföra den till en återvinningskammaren.
- För skenopererade gruppen (SOG), utför en identisk skada fattandet, med undantag för injektion av saltlösning (0,2 ml / 100 g) i stället för Rose-Bengal.
- Bibehålla kroppstemperatur (37 ° C) med värmedyna efter operationen och administrera antibiotika (andra generationens cefalosporin, 0,1%, 1 ml) via en intramuskulär injektion. Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka postoperativa djur till buren upptas av andra djur tills återhämtat sig helt.
OBS: Preliminär experiment utfördes i samma förfaranden för att hitta den optimala ljusintensitet från 1 mW till 5 mW och förfarandet kan krävas för att förvärva en tillfredsställande omfattning av skada i olika tillstånd.
3. Utvärdering av Kapselkontraktur infarkt lesionering
- Behavioral Test och djurgruppering
- Utföra enda pellet gående uppgifter såsom beskrivits av Whishaw et al. 14 för att utvärdera motorunderskott forelimb varje dag under en vecka efter stroken modellering. Utför en enda pellet nå uppgift(SPRT) i livsmedels begränsade djur (90% av kontroll kroppsvikt) med hjälp av tydliga plexiglas (30 x 15 x 35 cm höjd) med en 1 cm bred slits och en livsmedels hylla i framför mitten av den främre väggen.
- Placera en pellet på mat hyllan snett kontra den föredragna framben. Administrera 20 pellets per session för 3 veckor.
OBS: En framgångsrik antal SPRT definieras som en räckvidd där djuret griper ett livsmedel pellets och sätter den i munnen utan att tappa den. - Beräkna poängen som en procentandel av framgångsrika når, som definieras av följande formel:
OBS: Vi delar djur i 3 grupper: den skenopererade gruppen (SOG), måttlig återhämtning grupp (MRG), och dålig återhämtning grupp (PRG). Om en post-stroke SPRT poäng> 50%, vi klassificerar råttorna som MRG, som indikerar närvaron av en väsentlig lesion, men inte fullständig förstörelse av TArFå. Om efter stroke SPRT poäng är <50% jämfört med före stroke SPRT poäng, vi klassificera grupp som PRG, vilket tyder på fullständig lesionering i målet.
- Neurohistologiska Bekräftelse av Infarkt lesionering
- Utföra hjärtperfusion med 4% paraformaldehyd såsom beskrivits tidigare. Efter hjärnan helt sjunker i 30% sackaroslösning, utför koronal sektione vid en tjocklek av 10 ^ m och ett intervall på 200 ^ m med användning av en mikrotom eller cryotome 4.
- Fläcken med H & E, Nissl, Luxol snabb blå-PAS, neurofilamentprotein-L eller gliafibrillärt syraproteinfärgning och observera histologiska fynd att bestämma den optimala ljusintensitet som kan täcka hela bredden av den inre kapseln i målområdet för att observera färgning 4,17.
- Med hjälp av ImageJ programvara, mäta volymen av photothrombotic infarktområdet av den inre kapseln på hjärnan bilder.
- För att mäta volymen av infarktområdet, starta "ImageJ" programvara. För att öppna de filer som ska staplas väljer "på bilden för att Stacks" ( "Bild" → "Stacks" → "bilden för att Stacks"). Redigera filnamn och välj "Ställ in Scale" ( "Analysera" → "Ställ in Scale") för att redigera skala.
- I "Plugins", välj "Mät Stacks" för att beräkna volymen eller område av bilder. Sätt avståndsintervallet 2 bilder i "Slice Mellanrum". Gör en ritning av ROI (Region Of Interest) av alla bilder och klicka på "Measure".
OBS: Programmet "ImageJ" beräknar automatiskt området och volymen av varje bild och den totala volymen av dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som presenteras här syftar till att skapa en begränsad kapsel infarkt med en ihållande motor underskott. Därför är det viktigt att korrekt bestämma målet inom den inre kapseln i pre-kirurgi steget. Den somatotopic kartläggning av pyramid fibrer i den inre kapseln har inte lösts hittills. För att korrekt identifiera målet inom den inre kapseln måste forelimb området avgränsas. En injektion av AAV-GFP in i forelimb område av motoriska cortex kan spåra axonerna hos de pyramidformade fibrerna i den inre kapseln (Figur 1). Andra neurala spårämnen, såsom biotinylerat dextran amin (BDA), kan användas för samma syfte. De stereotaktiska koordinaterna för målet inom den inre kapseln kan belysas genom att spåra de axonala projektioner som härrör från forelimb område motoriska cortex till den inre kapseln.
Figur 1. Namnet på Forelimb området på den inre kapsel 2 veckor efter injektionen av AAV-GFP. GFP-transduced axonal fibrer som har sitt ursprung från forelimb område motoriska cortex visas i ventrolaterala kärnan i thalamus (pilar) och den kaudala delen av den inre kapseln (pilspets). Den streckade linjen visar konturen av den inre kapseln, och siffrorna hänvisar till avstånden från bregma. Hippo, hippocampus; Cpu, caudatus putamen; VL, ventrolaterala nucleus; IC, inre kapseln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den optimala ljusintensitet kan vara olika beroende på belastningen och kroppsvikten hos djuret och de typer och diametrar av optiska fibrer. Därför bör den optimala ljusintensiteten bestämmas separat före huvud infarkt lesionering experiment. Med hjälp av photothrombotic förfarande kan ljusintensiteten gradvis ökas tills omfattningen av skadan täcker hela bredden av den inre kapseln utan att förstöra de angränsande grå hjärnsubstans strukturer (Figur 2). Kan verifieras Den optimala ljusintensitet genom att jämföra histologiska utsträckning av infarktskada och platser.
Figur 2. Omfattningen av infarkt Skador Över varierande intensitet av laserljus från 2 mW till 5 mW två veckor efter Photothrombotic lesionering. Den optimala ljusintensitet anses vara mellan 3 mW och 4 mW i detta experimentella inställning. Pilarna anger infarkt lesionen./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi föredrar att använda ONI i vilket den optiska fibern är innesluten i ett tunt metallrör (spinal nål). Den optiska fibern kan producera minimal ljusspridning från sidan av fibern, som sannolikt kommer att generera ytterligare neurala skador längs den optiska fibern tarmkanalen. Omslutningen av den optiska fibern är också fördelaktigt för att förhindra böjning av den optiska fibern i djupare mål, såväl som att fästa ONI till den stereotaktiska ramen (Figur 3).
Figur 3. Konstruktion av den optiska neurala gränssnitt (ONI). (A) Kapning av ryggrads nålen. (B) strippning av den optiska fibern. (C & D) Förankrings metallrör sätts in överavskalade optisk fiber och trånga för att säkra den optiska fibern till navet av ryggrads nålen. (E) Den epoxi-sattes optiska fibern sätts in i spinal nål. (F) Epoxin härdades vid 100 ° C under 20 min. (G) Den optiska fibern klyvs vid spetsen av den spinala nålen. (H) Den optiska fibern är polerad. (i) Ljusintensiteten mäts från toppen av den optiska fibern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den photothrombotic förfarande kommer att producera reproducerbara lesioner och platser med ~ 70% framgång i motorisk försämring. Typiska kapselinfarkt lesion omfattar ventrodorsal dimension kapsulära fibrer (Figur 4A). Vidare sträcker sig det infarkt lesion längs anteroposterior axel den inre kapseln på grund av ökad ljusspridning inuti kapsel fibern. (Figur 4B) Den optiska kanalen placerad under den inre kapseln består av vita substansen fibrer; sålunda är det ofta skadas av bestrålning med en ökad ljusintensitet. Seriesektioner och färgning är krävs för att bekräfta hela volymen och omfattningen av infarkt. Den infarktvolymen var 0,63 ± 0,37 mm 3. För att utvärdera förstörelsen av den kapsulära fiber, neurofilament och Luxol fast blue-PAS fläckar är användbart.
Figur 4. mikroskopiska utseende Kapselkontraktur infarkt 3 veckor efter Photothrombosis. Mikroskopisk utseende kapsel infarkt 3 veckor efter photothrombosis. A) Brain skiva coronal sektion i råtthjärna. Pilspets indikerar området av nålen som innehåller optisk fiber i thalamus och upp till inre kapseln. B) Serie Nissl färgning av koronala hjärnan skivor showi ng hela omfattningen av infarkt lesion i den inre kapseln. Pilspetsar indikerar infarkt skada. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Framgången för modellering kan utvärderas genom beteende tester med en enda pellet nå uppgift. Beteende prestanda efter en vecka efter infarkt lesionering är en bra guide för att bekräfta exakt lesionering, som åtföljer den ihållande och markant försämring av SPRT trots den dagliga enda pellet nå utbildning (Figur 5). När motorn underskottet visas i PRG, den neurologiska underskott kvarstod under tre månader av observation. Skenopererade gruppen visade inte den betydande minskningen av SPRT prestanda efter operation.
ladda / 53281 / 53281fig5.jpg "/>
Figur 5. Förändringar i Single Pellets Nå ställningen efter Kapselkontraktur Infart 4,20. Experimentgrupperna (PRG och MRG) uppvisade signifikant minskade poäng omedelbart efter infarkt lesionering jämfört med skenopererade gruppen (SOG). MRG uppvisar en gradvis återhämtning av SPRT föreställningar, medan PRG uppvisar ihållande motorisk försämring över tiden. Op, photothrombotic infarkt lesionering; PRG, dålig utvinning grupp; MRG, måttlig återhämtning grupp. Statistisk signifikans bestämdes med användning av upprepade mått analys av avvikelser. + SOG kontra MRG; * SOG kontra PRG. Data är medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapselmodellen infarkt presenteras här visar en riktad skada med tydlig och ihållande motorisk försämring i forelimb funktion. Tidigare modeller av subkortikal kapsel stroke har visat en otillräcklig grad av motorisk försämring och en snabb återhämtning process 6,8,9. I denna mening, liknar denna modell de kliniska kapselinfarkt fall som uppvisar en långsiktig funktionsnedsättning.
De mest kritiska stegen i utvecklingen av en omskriven kapsulär infarktmodell är: 1) för att korrekt identifiera somatotopic representation av kroppsdelen är avsedd för att inaktivera funktionen inom den inre kapseln; 2) för att identifiera den optimala intensiteten av den gröna lasern, som kan förstöra hela bredden av den inre kapseln med minimal intrång i grannlandet av grå hjärnsubstans strukturer; och 3) för att noggrant placera den optiska fibern i målstrukturen. Även om de presenterade teknikerna kan inducera OMSKRIVAd kapsel infarkt modell med en hög replikeringshastighet (> 70%), kan små skillnader i inriktning och graden av fullständighet av förstörelse som täcker hela bredden av den inre kapseln redogöra för olika motor underskott.
Corticospinal tarmkanalen är belägen i den främre halvan av den bakre lemmen i den inre kapseln i människor trots kontroverser av somatotopic organisation 15. Däremot har det inte funnits någon motsvarande klassificering eller detaljerad belysning av somatotopic organisation av den inre kapseln hos gnagare. Bristen på kunskap om somatotopic organisation leder ofta till felaktiga mål för infarkt lesionering inom den inre kapseln med olika motor utfall bland kapselinfarkt modeller. Men vi identifierat GFP-transduced axoner i den bakre delen av den inre kapseln, vilket sannolikt representerar banan för forelimb motor fibrerna. Dessutom lesionering av detta område demonstrated en markant och ihållande underskott av forelimb nå skicklighet. Därför rekommenderar vi den näst sista delen av den inre kapseln för stereotaktisk lesionering att förbättra giltigheten av kapselinfarktmodellen.
Förjustering av ljusintensiteten är obligatoriskt att en jämn grad av infarkt lesion hos strokemodeller eftersom djuret stammen, kroppsvikt, ljuskälla och typer av ONI kan generera olika storlekar av infarkt. Därför bör preliminära experiment med olika ljusnivåer i försöksdjur med samma stam och kroppsvikten genomföras fram till tillfredsställande infarkt skadan uppnås med minimal ljusintensitet.
Stark ljusintensitet som kan förstöra hela bredden av kapsel fiber (anterior-posterior och dorsoventral utsträckning) som motsvarar forelimb med minimal skada på närliggande byggnader anses vara den optimala ljusintensitet. den forelimb-området i den inre kapseln avgränsas av thalamus superiorly och optiken kanalen inferiorly. Därför bör djupet av ONI ings vara korrekt för att förstöra hela utsträckningen av IC i dorsoventral riktning, med samtidig bevarande av de övre och undre närliggande konstruktioner. Felaktig placering av ONI resulterar i en ofullständig nedbrytning av IC, vilket leder till snabb återhämtning av motor underskott som ett resultat av den synaptiska plasticiteten hos de återstående pyramid fibrerna i den inre kapseln. I serie histologiska undersökningar, mest confounding faktorn i induktion av en ihållande motor underskott var felaktig placering av ONI, vilket leder till underlåtenheten att förstöra hela bredden av Plic 4,16. Därför bör uppmärksamhet ägnas åt nå rätt mål. Nyligen Blasi et al. Rapporterade att varaktig ren-motor underskott kan framställas genom att göra en infarkt skada i bakre inre kapselnmed hjälp av endotelin-1 (ET-1) 17. Emellertid kan ET-1 förstöra angränsande grå substans struktur genom diffusion av ET-1.
Beteendetestning är en omedelbart tillgänglig riktmärke i laboratoriet för att bedöma bildandet av infarkt skada i den inre kapseln. Emellertid är utvärdering av motorprestanda en vecka efter infarkt lesionering rekommenderas att dela upp djuren till måttliga och fattiga självhjälpsgrupper. Måttlig återhämtning definierades som en ökning i prestanda poäng genom> 50% jämfört med poängen före lesionering, medan dålig återhämtning definierades som återvinning av <50%. Bland forelimb motor beteendetester, är den enda pellets nå uppgift en av de mest känsliga test för både kvantitativa och kvalitativa mätningar av stroke-inducerade motoriska prestationer 14. Uppgiften mäter kvantitativt nå framgång samtidigt ger en analys av forelimb användning, såsom gripa och hämta ett livsmedelpelletera. Den kvalitativa analysen av gående rörelse är också bra att differentiera kvaliteten på stroke återhämtning genom att skilja äkta funktionell återhämtning eller ersättning 20. Här beskrev vi kort kvantitativ mätning av SPRT; dock kvalitativ analys med hjälp av inspelningen och poängsättning baserad på en ram-för-ram rekommenderas analys för mer detaljerad analys.
De tekniker som presenteras här behöver inte begränsas till induktion av omskrivna kapselinfarkt modellering. Tekniken kan appliceras på induktion av en infarkt skada i andra områden av vit substans, såsom corpus callosum, tvärförbindelser i hjärnan och anslutande fibrer bland neurala strukturer. Kombinationen av den lilla ONI och photothrombotic teknik baserad på de optiska egenskaperna hos vita substansen är troligt att förstöra de riktade strukturerna med minimal skada på de angränsande strukturerna. Till exempel kan lakunära infarkter lätt producerad genom att rikta de subkortikala strukturer i samband med motor, kognitiva och minnesfunktioner. När målstrukturen är stor, kan multipla insertioner av den ONI och olika inriktnings och vinklade banor att krävas för att ge den önskade graden av lesioner.
Det finns flera begränsningar i denna teknik. Tekniken är tillräckligt för att visa en följd av infarkt lesionering i Plic och efterföljande återhämtning. Men denna modell inte speglar hela spektrumet av mänskliga WMS eftersom photothrombotic förstörelse av vita substansen skiljer sig något från de mänskliga WMS. Följaktligen kan neurobiologiska eller MRI fynd uppvisar olika funktioner i ett tidigt skede av photothrombotic lesionering. Därför bör denna modell på lämpligt sätt för att handla av modellens fördelar och nackdelar. Tekniskt sett inte alla operationer kan producera den markerade och permanent motor underskott i denna modell eftersom det kräver mycket noggranna rutiner. Specifically, är utbildade och erfarna händer krävs för att producera hög reproducerbarhet i genereringen av denna modell.
Sammanfattningsvis är den kombinerade användningen av en photothrombotic teknik, optimering av ljusintensitet och korrekt inriktning en användbar teknik för att producera en begränsad kapselinfarktmodell. Denna modell kommer att vara till hjälp inte bara för att studera WMS på beteende, kretsen, och cellulära nivåer, men också för att bedöma nyttan av nya terapeutiska och rehabiliterande insatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Institute of Medical System Engineering (Imse) & GIST-Caltech Collaborative Fund (K04592) från GIST och grund Science Research Program genom NRF Korea finansieras av ministeriet för vetenskap, IT och framtida planering (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
