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Biology

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Identificare gli obiettivi diretti di molecole-genoma di mira resta una sfida importante. Per capire come le molecole che legano il DNA impegnano il genoma, abbiamo sviluppato un metodo che si basa sulla reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina (COSMIC).

Abstract

Il genoma è il bersaglio di alcuni dei chemioterapici più efficaci, ma la maggior parte di questi farmaci mancano DNA specificità di sequenza, che porta a dose-limitante tossicità e molti effetti collaterali negativi. Targeting il genoma con piccole molecole sequenza-specifiche può consentire molecole con maggiore indice terapeutico e minori effetti fuori bersaglio. N -methylpyrrole / N poliammidi -methylimidazole sono molecole che possono essere razionalmente progettati per indirizzare specifiche sequenze di DNA con squisita precisione. E a differenza di molti fattori di trascrizione naturali, poliammidi possono legarsi al DNA metilato e chromatinized senza perdita di affinità. La specificità sequenza di poliammidi è stata ampiamente studiata in vitro con l'identificazione del sito cognate (CSI) e con approcci tradizionali biochimici e biofisici, ma lo studio di poliammide vincolanti agli obiettivi genomici nelle celle rimane inafferrabile. Qui riportiamo un metodo, la reticolazione di piccole molecole per Isolate cromatina (COSMIC), che identifica i siti di legame di poliammide in tutto il genoma. COSMIC è simile a immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), ma differisce in due modi importanti: (1) un photocrosslinker viene impiegato per consentire selettiva, cattura temporalmente controllata di poliammide eventi di legame, e (2) la maniglia affinità biotina è usato per purificare poliammide coniugati -DNA in condizioni di semi-denaturazione per diminuire DNA che non è legato covalentemente. COSMIC è una strategia generale che può essere utilizzato per rivelare gli eventi di legame genoma di poliammidi e di altri agenti chemioterapici genome-targeting.

Introduction

Le informazioni da rendere ogni cellula del corpo umano è codificato nel DNA. L'uso selettivo di tali informazioni governa il destino di una cellula. I fattori di trascrizione (TFS) sono proteine ​​che si legano a specifiche sequenze di DNA di esprimere un particolare sottoinsieme dei geni nel genoma, e il malfunzionamento del TF è legata alla comparsa di una vasta gamma di malattie, tra cui difetti di sviluppo, il cancro e il diabete . 1,2 Siamo stati interessati a sviluppare molecole in grado di legare selettivamente al genoma e modulare reti di regolazione genica.

Poliammidi composto da N e N -methylimidazole -methylpyrrole sono molecole in grado di indirizzare il DNA con specificità e affinità che rivali fattori di trascrizione naturali. 3-6 Queste molecole si legano a sequenze specifiche nella solco minore del DNA razionalmente progettati. 4,5,7 -11 Poliammidi sono stati impiegati sia repress e attivare l'espressione di specifici gEnes. 4,12-19 Essi hanno anche interessanti antivirali e antitumorali 20-24 12,13,25-30 proprietà. Una caratteristica interessante di poliammidi è la loro capacità di accedere a sequenze di DNA che sono metilati 31,32 e avvolti intorno proteine ​​istoniche 9,10,33.

Per misurare le specificità completi vincolanti di molecole che legano il DNA, il nostro laboratorio ha creato il metodo di identificatore del sito affine (CSI). 34-39 La presenza prevista di siti di legame sulla base di specificità in vitro (genomescapes) possono essere visualizzati sul genoma, perché la in vitro intensità vincolanti sono direttamente proporzionali alla costanti di associazione (K a). 34,35,37 Queste genomescapes permettono di percepire occupazione poliammide in tutto il genoma, ma misurare poliammide legame in cellule vive è stata una sfida. DNA è strettamente impaccato nel nucleo, che potrebbe influenzare l'accessibilità dei siti di legame. L'accessibility di queste sequenze di DNA chromatinized a poliammidi rimane un mistero.

Recentemente, molti metodi per studiare le interazioni tra piccole molecole e acidi nucleici sono emersi. 40-48 La cattura affinità chimica e sequenziamento del DNA massicciamente paralleli (chem-SEQ) è una tale tecnica. Chem-ss utilizza formaldeide per reticolare piccole molecole ad un target genomica di interesse e di un derivato biotinilato di una piccola molecola di interesse per catturare l'interazione ligando-bersaglio. 48,49

Formaldeide reticolazione porta a interazioni indirette che possono produrre dei falsi positivi. 50 Abbiamo sviluppato un nuovo metodo, la reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina (COSMIC), 51 con un photocrosslinker per eliminare questi cosiddetti picchi "fantasma". 50 Per iniziare, abbiamo progettato e sintetizzato derivati ​​trifunzionali di poliammidi. Queste molecole contenevano una pol-legame al DNAyamide, un photocrosslinker (psoralen), e una maniglia di affinità (biotina, Figura 1). Con poliammidi trifunzionali, possiamo covalente di catturare le interazioni in poliammide-DNA con irradiazione UV 365 nm, una lunghezza d'onda che non danneggia il DNA o indurre non psoraleni a base di reticolazione. 51 Successivamente, frammentare il genoma e purificare il DNA catturato sotto severe, semi condizioni -denaturing per diminuire DNA che non è legato covalentemente. Quindi noi consideriamo COSMIC come metodo correlate a chem-seq, ma con una lettura più diretta di DNA targeting. È importante sottolineare che i deboli (K 10 3 -10 4 M -1) affinità di psoraleni per il DNA non rilevabile poliammide impatto specificità. 51,52 I frammenti di DNA arricchito possono essere analizzati da una delle polimerasi quantitativa reazione a catena 51 (COSMIC-qPCR) o per sequenziamento di prossima generazione 53 (COSMIC-ss). Questi dati consentono un design imparziale genoma-guidata di ligandi che l'Interagire con loro loci genomici desiderato e minimizzare gli effetti fuori bersaglio.

Figura 1
Figura 1. poliammidi bioattivi e schema cosmico. (A) Hairpin poliammidi 1-2 bersaglio la sequenza del DNA 5'-WACGTW-3 '. Poliammidi lineari 3-4 bersaglio 5'-AAGAAGAAG-3 '. Anelli di N-metilimidazolo sono in grassetto per chiarezza. Cerchi aperti e pieni rappresentano N -methylpyrrole e N -methylimidazole rispettivamente. Square rappresenta 3 clorotiofene, e diamanti rappresentano β-alanina. Psoraleni e biotina sono indicati con P e B, rispettivamente. (B) schema cosmico. Le cellule vengono trattate con derivati ​​trifunzionali di poliammidi. Dopo la reticolazione con irradiazione UV 365 nm, le cellule sono lDNA genomico ysed e viene tagliata. Sfere magnetiche rivestite di streptavidina vengono aggiunti per catturare addotti poliammide-DNA. Il DNA viene rilasciato e può essere analizzato mediante PCR quantitativa (qPCR) o sequenziamento di prossima generazione (NGS). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. La reticolazione in cellule vive

  1. Inizia con ~ 2.5x10 7 celle H1, o altre cellule in coltura.
    NOTA: Il numero di celle H1 corrisponde a cinque piatti da 10 cm (circa il 40% di confluenza).
  2. Crescere cellule in E8 media su piatti ricoperti su una superficie in grado di supportare le cellule staminali pluripotenti (vedi Materiali List), e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2. Celle di raccolta enzimatica (vedi Materiali List). Nota: Non lasciare le celle H1 di superare il 90% di confluenza; confluenza induce la differenziazione spontanea delle cellule H1. Per contare le cellule, crescere un 10 cm piatto extra di cellule, sollevare le cellule enzimaticamente come descritti nelle sezioni 1.8-1.10, e le considero con un emocitometro.
    1. Preparare E8 coltura come descritto in Chen et al. 54
  3. Prima di aggiungere poliammide, rimuovere il mezzo di coltura trascorso con una pipetta Pasteur collegato a una trappola di vuoto. Aggiungere mezzi freschi con comepipetta erological e distributore pipetta (8 ml per 10 cm piatto).
    NOTA: Aggiungere il supporto al lato del piatto per evitare di perturbare le cellule. Da questo punto in poi proteggere le cellule dalla luce per evitare premature foto-reticolazione.
  4. Aggiungere poliammide con una pipetta (8 ml di 400 mM in DMSO, poliammide 400 nM concentrazione finale) direttamente al mezzo di coltura di ogni piatto. Agitare il piatto per disperdere la poliammide in modo uniforme nei media.
    NOTA: La concentrazione può essere variata, ma assicura che nessuna tossicità cellulare si osserva per il trattamento selezionato.
  5. Incubare le cellule 24 ore 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2, e garantire che siano protetti dalla luce.
    NOTA: Il tempo di incubazione può essere variata per misurare il legame attraverso il tempo in poliammide.
  6. Lavare ogni piatto 10 cm con 4 ml di PBS (1.05 mM fosfato monobasico di potassio, 155,17 mM cloruro di sodio, 2.97 mM sodio fosfato bibasico) utilizzando una pipetta e pipette sierologiche dispenser. Aspirare PBS e aggiungere 3 ml di E8 coltura.
  7. Con le luci abbassate, rimuovere il coperchio 5 piastre di coltura e posizionare le celle su una superficie piana esterna della cappa. Mettere un filtro di vetro sopra i 5 piatti della cultura per filtrare la luce con λ <300 nm. Posizionare la sorgente UV in cima filtro. Campioni Crosslink 30 min con 365 irradiazione UV nm (2,4 mW / cm 2).
    NOTA: tempo di reticolazione deve essere determinato empiricamente.
  8. Trasferimento piatti della cultura torna alla cappa. Aspirare i media con una pipetta Pasteur collegato a una trappola a vuoto. Lavare ogni piatto 10 cm con 4 ml di PBS. Aspirare il PBS. Aggiungere 3 ml di enzima per la dissociazione delle cellule (vedi Materiali List) per 10 cm piatto dissociare le cellule. Incubare 5 minuti a 37 ° C.
    NOTA: Non pre-riscaldare l'enzima.
  9. Placare l'enzima con 3 ml E8 supporti per ogni piatto. Trasferimento dissociato cellule in un tubo da 15 ml.
    NOTA: Cellule posto su ghiaccio da questo punto in avanti.
  10. Centrifuge dissociato cellule 5 min, 500 xg a 4 ° C. Aspirare il surnatante per rimuovere enzima e dei media.
    NOTA: il punto di pausa. Le cellule possono essere congelati rapidamente in azoto liquido, conservati a -80 ° C per la successiva elaborazione in un secondo momento.

2. Isolamento di cromatina

  1. Aggiungere 1,2 ml di tampone COSMIC (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, NaCl 150 mm, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) e pipetta su e giù più volte per risospendere il pellet cellulare per ogni campione 1,2 ml di tampone COSMIC.
    1. Aggiungere 133 microlitri ciascuno di 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), benzamidine 100 mM e 150 mM, pepstatina inibitori della proteasi freschi ad una concentrazione finale di 1 mM PMSF e per benzamidine e 1,5 mM per pepstatina. Soluzione scissione di lisato cellulare in due ambra 1,7 ml microprovette.
  2. Sonicare con sonicatore 35 min (10 sec a 10 sec spento, il potere il 60%) per frammentare il genoma di 100 tra unND 500 bp.
    1. Mantenere il livello della soluzione cromatina nella provetta parallelo al livello dell'acqua nel serbatoio. Confermare questo livello mediante ispezione visiva.
      NOTA:. Verificare che il DNA è stato tranciato con un gel di agarosio 1,5% 55
    2. Ottimizzare il tempo di sonicazione empiricamente. Utilizzare una quantità minima di ghiaccio nel serbatoio per refrigerare i campioni, e garantire il ghiaccio non interferisca tra i campioni e il corno tazza.
  3. Centrifugare il campione di 12.000 xg 10 min. Salvare la soluzione acquosa che contiene cromatina solubile trasferendola in una nuova provetta per microcentrifuga ambra con una pipetta. Eliminare il pellet.
  4. Trasferire 110 microlitri (10%) di campione in una nuova provetta ed etichettarlo DNA di ingresso. Conservare a -80 ° C. Salvare il resto del campione cromatina in ghiaccio per uso nel passo 3.3.

3. Acquisizione di ligando-DNA legami crociati

  1. Utilizzare una pipetta per erogare 60 microlitri streptavidin-rivestito sfere magnetiche in una provetta. Aggiungere 1 ml di tampone COSMIC e mescolare in una nutator 5 minuti a temperatura ambiente. Inserite sfere magnetiche sulla separazione magnetica cremagliera 2 minuti per catturare perline. Rimuovere tampone COSMIC con una pipetta.
    NOTA: Non lasciare che le perline si asciughino. Procedere immediatamente alla fase successiva.
  2. Aggiungi campione cromatina (~ 1 ml) di perline (60 mL) e risospendere le sfere. Incubare cromatina con streptavidina rivestite sfere magnetiche almeno 4 ore su una rotazione, mixer a dondolo a 4 ° C. Incubare i campioni O / N se lo si desidera.

4. Isolamento del DNA purificato per affinità

  1. Lavare perline con 7 min intervallo con RT con le seguenti tamponi di lavaggio per rimuovere le interazioni non specifiche. Utilizzare un rack di separazione magnetica per catturare perline dopo ogni lavaggio. Risospendere le sfere dopo ogni cambio di tampone di lavaggio.
  2. Preparare tamponi di lavaggio in acqua deionizzata distillata e filtro (0,2 micron) prima dell'uso. Tamponi di lavaggio Conservare 1 e 2 a 4 ° C per several mesi. Preparare tampone di lavaggio 3 fresco ogni giorno. Aggiungere e rimuovere tamponi di lavaggio dal campione con una pipetta. Per 2 e 4, aggiungere 1 e 3 (5 mM), rispettivamente, nei lavaggi. I campioni possono inoltre essere lavate due volte con tampone COSMIC (una volta 12 ore, una volta 4 ore) prima dei lavaggi elencati di seguito.
    1. Lavare una volta con tampone di lavaggio 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Risciacquare una volta con tampone di lavaggio 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% sodio desossicolato). Lavare due volte con tampone di lavaggio 3 (4 M urea, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Lavare due volte con Tris EDTA (TE) di buffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Risospendere le sfere in 200 microlitri di buffer TE con una pipetta. Questo campione di DNA catturato è indicato come purificato per affinità (AP) DNA.
  4. Supplemento Input e AP DNA con 10x Crosslink Reversal Buffer (100 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) per 1x concentrazione finale. 56,57 Incubare 30 minuti a 90 ° C.
    NOTA: 254 nm irradiazione UV può anche essere utilizzato per invertire la reticolazione psoralen, 58 ma dimeri di pirimidina ciclobutile possono essere formati da irradiazione a questa lunghezza d'onda e interferire con l'elaborazione a valle del DNA.
  5. Per il DNA AP, mettere la provetta contenente il campione sulla separazione magnetica cremagliera 2 minuti a temperatura ambiente e liquido di (DNA) con una pipetta. Trasferire il DNA AP (che è stato rilasciato dalle perline) in una nuova provetta per microcentrifuga ambra.
    NOTA: Il DNA AP desiderato è nel liquido, non è più attaccato ai talloni.
  6. Neutralizzare ingresso e il DNA di AP con HCl concentrato a pH 7 con l'aggiunta di circa 1 ml 6 N HCl per 100 microlitri del campione con una pipetta. Confermare i campioni vengono neutralizzati con l'aggiunta di ~ 0,5 microlitri su carta pH con una pipetta. ATTENZIONE: concentrato HCl è un forte acido corrosivo. Maneggiare secondo il vostro istituto217; s linee guida per l'equipaggiamento di protezione personale appropriato.
  7. Aggiungere RNasi A (100 mg / ml) e 0,2 mg / mL concentrazione finale sia all'ingresso e DNA AP. Incubare 1 ora a 37 ° C. Aggiungere proteinasi K (20 mg / ml) e 0,2 mg / mL concentrazione finale sia all'ingresso e DNA AP, aggiungere. Incubare 1 ora a 55 ° C.
  8. Purificare il DNA con un kit di colonna DNA cancellazione (vedi Lista dei materiali). 55 Elute DNA in 58 microlitri DNA-grade H 2 O. Conservare i campioni di ingresso e di AP a -20 o -80 ° C
  9. Analizzare il DNA AP mediante la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) con primer specifici per locus, e / o di sequenziamento di prossima generazione. Per qPCR, utilizzare 2 microlitri DNA AP per locus con i seguenti parametri: 1 ciclo di 95 ° C 10 min e 40 cicli di 95 ° C 20 sec, 54 ° C o 56 ° C 20 sec, 72 ° C 40 sec.
    NOTA: La temperatura di ricottura dovrebbe essere modificata in funzione della temperatura di fusione delle coppie di primer utilizzati. Selezionare una tempera di ricotturare che riduce al minimo il ciclo di quantizzazione con nessuna amplificazione non specifica.
    NOTA: Per l'analisi da sequenziamento di prossima generazione, obiettivo per almeno 10 milioni mappato legge. Il numero di letture mappato può essere aumentata aumentando la quantità di DNA AP e combinando il numero di campioni in una corsa per il sequenziamento. Ulteriori letture migliorare la sensibilità. Pacchetti standard per l'analisi ChIP-seq (ad esempio, Omero, 59 MACS, 60 e 61), SPP lavorano con dati COSMIC-ss. Come nel caso di altri metodi che si basano su sequenziamento di prossima generazione, tra cui il sequenziamento del genoma e Chip-Seq, regioni ripetitivi creano ambiguità in allineamento e il montaggio, e quindi rimangono una sfida tecnica.

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Representative Results

Per tenere conto di non uniforme genoma frammentazione e altre variabili, il DNA purificato deve sempre essere normalizzato contro un riferimento di DNA Input. Primer specifici di un luogo di interesse possono essere utilizzati. È utile analizzare anche un locus qualora non si preveda la molecola di legare, come controllo negativo. Vediamo un aumento> 100 volte in occupazione poliammide upon irraggiamento con luce di 365 nm (Figura 2).

Arricchito DNA può essere analizzato da sequenziamento di prossima generazione. DNA è preparato per il sequenziamento nello stesso modo come DNA chip viene preparato (per esempio, con un kit di preparazione campioni commerciali, vedi Elenco Materials). Anche con sequenziamento di prossima generazione, usiamo ancora qPCR per confermare l'arricchimento del DNA a loci dove ci aspetta la poliammide ad essere vincolato. Una volta sequenziato il DNA prime letture sono allineati al genoma e densità tracce sono preparati con lo stesso software progettato per analizzare i dati ChIP-Seq (Figura 3). Based sulla nostra analisi delle distribuzioni poliammide nelle cellule, abbiamo scoperto che cluster siti di legame, che coprono una vasta gamma di affinità, meglio prevedere occupazione nelle cellule. Abbiamo sviluppato un algoritmo per segnare l'intero genoma per il legame con i nostri in vitro dati CSI (Figura 4A). Questo metodo di punteggio ha rivelato che diversi loci genomici con punteggi vincolanti previsti simili esporre le diverse raggruppamento di più siti di affinità diverse (Figura 4B).

Figura 2
Figura 2. Risultati delle COSMIC-qPCR. Effetto di irradiazione UV 365 nm per la frazione di AP / input da cellule HEK293. AP, purificate per affinità. I risultati sono tracciati su scala logaritmica e rappresentano media ± sem

Figura 3
Fifigura 3. Risultati di COSMIC-Seq nelle cellule H1. traccia COSMIC-ss densità tag per poliammide lineare 4 creato per identificare ripetizioni AAG. Densità tag è stato normalizzato a 10 7 tag e visualizzato con il genoma visualizzatore integrato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Modello di poliammide. Trame (A) violino di punteggi previsti vincolante per 2 e 4 vincolante in tutta l'intero genoma. Vengono visualizzati anche genomescapes rappresentativi per 4. Con il metodo di punteggio bioinformatica impiegato, loci genomici possono sommare allo stesso punteggio previsto in modi diversi. (B) Loci con bassa multipla e medie affinità sequenze show simile occupazione in poliammide per loci con poche sequenze ad alta affinità. Ristampato con il permesso. 51 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

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References

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