Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.
organogenez anlamak için, doku gelişimi sırasında meydana gelen uzamsal ve zamansal değişiklikler kaydedilmesi gerekir. Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma ve z-yığın edinimi için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş böbrek gelişiminin time-lapse analiz sağlar. Ile floresan etiketli böbrek yapıları kullanılmıştır: nefrogenezisi, transgenik zebra balığı (GFP) Tg (wt1b) görselleştirmek için. Böbrek kusurları Wilms tümörü geni wt1a, böbrek gelişimi için çok önemli olduğu bilinen bir faktör karşı antisens morfolino oligonükleotid enjeksiyonu ile tetiklenmesi.
deney düzeneği avantajı ek donanım olmadan x, y veya z yönünde yeniden ayarlama hareketler için basit stratejileri ile zoom mikroskop birleşimidir. sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan odak kayması aşmak içinBir otofokus stratejisi yerine genellikle gerekli çevresel odasını kullanan uygulandı. nedeniyle xy-sürüklenme için konumsal değişiklikler yeniden ayarlamak için, baskılı tehcir ızgaraları ile görüntüleme odaları istihdam edilmiştir.
Böyle konfokal lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıt için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolaydır. Ayrıca, bu tür alan yüksek derinliği ve uzun bir çalışma mesafesi olarak mikroskop özgü yararları diseksiyon sunmaktadır.
Burada sunulan organogenez çalışma yöntemi aynı zamanda optik olarak kısımlara ayırma yeteneğine sahip değildir Flüoresans stereo mikroskobu ile birlikte kullanılabilir. yüksek verimlilik için sınırlı olmasına rağmen, bu tekniğin normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.
gastrulasyon ardından, organogenesis bir bireyin yaşam döngüsünün bir sonraki aşamasıdır. Bu doku ve organların üretmek için yeniden düzenleme, etkileşim ve hücrelerin çok sık göç içerir. organların gelişimini altında yatan süreçlerinde yanlışlık genellikle ileri yaşlarda hemen ya da kendilerini ortaya çıkabilir hastalıklara yol açar. Böylece, organogenezi anlama gelişimsel biyoloji ve biyomedikal araştırmalarda önemli bir çaba olmuştur. Belli bir organ gelişimine araştırmak edebilmek için, bu da embriyo gövde duvarı aracılığıyla görünür olması gerekir. Bu gelişim sırasında meydana gelen mekansal ve zamansal değişikliklerin kaydedilmesini sağlar. Ayrıca organogenez katılan faktörlerin önemi analiz etmek amacıyla, bu manipülasyon duyarlı olması gerekir.
In vivo organogenez soruşturma son derece uygun olan bir organizma Zebra balığı olduğunu. onun transparFloresan transgenik hatların kullanımı ile kombinasyon halinde, embriyonik gelişimi sırasında Ensi protein lokalizasyonu ve ifade dinamiklerinin gözlem, aynı zamanda, iç organların 1 görselleştirme sağlar. Bu kimin organları mikroskopik analiz için erişilemez memeli modellere göre gerçek zamanlı olarak, organ gelişiminin soruşturma ile ilgili benzersiz bir avantaj sağlar. Ayrıca, farklı araçlar zebrafish embriyo gelişimini işlemek için kullanılabilir. Mutant çizgilerinin üretilmesine yanında, antisens morfolino oligonükleotitler (MO), bazı organların gelişiminde dahil olan belirli bir gen aktivitesinin demonte etmek için kullanılabilir. MOs bir ekleme sitesi veya translasyon başlangıç kodonunu (Ağustos) hedef ve böylece ön-mRNA veya çeviri eklenmesine engel ya.
Zebra balığı embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimi ve gen işlevini incelemek için anatomik basit ama değerli bir modeldirböbrek hastalıklarının 2 ile ilgili es. Bu nefron denilen sadece iki fonksiyonel birimden oluşmaktadır. Her nefron kan filtrasyon yer 3 alan bir glomerulus oluşur. Ayrıntılı bileşenler kısa boyunlu bölgenin yanı sıra kloakanın 4 biter sekresyon ve çözünen maddelerin reabsorbsiyonunun ve kanal için parçalı borucuk vardır. Ne olursa olsun basit kompozisyon, organizasyon ve zebra balığı pronephros farklı hücre tipleri memeli böbrek 5,6 çok benzer.
Böbrek gelişiminde kritik rol oynayan bir faktör, Wilms Tümör baskılayıcı gen WT1 7 tarafından kodlanmıştır. Balığı wt1a adlandırılan iki paralog sahiptir ve pronephros 8 geliştirilmesi sırasında üst üste binen, ancak aynı desen içinde ilave edildiği, wt1b. GFP-etiketli pronephros yapılarla transgenik zebrafish kullanılarak, wt1a <o tam devirerek gösterilmiştir/ em> veya belirli bir ekleme formu embriyonik böbrek ağır ya da hafif malformasyonlar, sırasıyla 9,10 yol açar.
Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş nefrogenezisi zaman atlamalı analiz sağlar. Genel olarak optik kesitler sadece odak içi bilgi içeren görüntü edinme sağlar. Out-of-odak bilgiler, matematiksel algoritmalar (örn. Deconvolution), optik tasarım (örneğin Konfokal lazer tarama mikroskopisi) ya da her ikisinin kombinasyonu (örneğin yapılandırılmış aydınlatma) gibi çeşitli yaklaşımlarla önlenebilir.
Böbrek geliştirme kusurları neden biz bir antisens bir transgenik zebrafish hattı enjekte edildi wt1a karşı MO (GFP) Tg (wt1b) kullanılır. Bu hat glomerulus, boyun ve ön GFP floresan gösterirtübül 9,10 parçası. Böyle lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıtları için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolay ve ucuzdur. Ayrıca, yapılandırılmış aydınlatma ekipmanı kolayca uzun bir çalışma mesafesi ve bakış geniş alanı olarak geleneksel floresan ekipmanı (örneğin floresan lamba, filtreler) ve mikroskop özel avantajlar diseksiyon teklifler ile kombine edilebilir. sürüklenme ile ilgili sorunlar genellikle istikrarlı sonuçlar için gerekli olan ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) kullanmadan çözüldü. bir otofokus stratejisi kurulmuş ve baskılı taşınma ızgaraları ile görüntüleme odaları x veya y yönünde bir sürüklenme aşağıdaki konumlandırma yeniden ayarlamak için kullanılmıştır odak kayması için düzeltmek için.
Bu çözümler aynı zamanda, floresans, stereo m optik kesit amaç olmadan mikroskoplar uygulanabiliricroscopes ve normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.
Zebra balığı insan hastalıklarının omurgalı gelişimi ve modelleme çalışmaları için popüler bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar saydam kalır, çünkü beyin ve kalp gibi gelişmekte olan organlar bir standart hazırlama mikroskobu kullanılarak görülebilir. organ spesifik floresan transgenik yararlanarak floresan mikroskobu ile yaşayan embriyoların içinde farklı gelişim aşamalarında organogenez değerlendirmelerini sağlar. Standart Epifloresans mikroskobu ile tüm organların yapısal ayrıntıları görüntüleme için bir sınırlama odak düzlemi üstündeki ve altındaki nesnelerin gelen sinyallerin etkisidir. Bu out-of-focus ışığı değil azalmış görüntü kontrastı ve çözünürlüğü sadece sonuçlar, aynı zamanda ilgi 13,14 önemli yapılarını gizleyebilir. Disk confocal- veya multiphoton mikroskobu iplik gibi lazer tarama confocal- olarak çeşitli teknikler, out-of-focus bilgisini ve böylece increas en aza indirmek için geliştirilmiştire görüntü kontrastı yanı sıra eksenel çözünürlük. Optik bölümleri elde etmek için alternatif bir yöntem lazerli ve tarama ücretsiz yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi, düzenli bir mikroskop 15 uygulamak basit ve geniş bir alan bazlı aydınlatma tekniğidir. Burada sunulan sonuçlar mikroskop uygulanan ve genişletilmiş odak görüntüleri yeniden birlikte yapılandırılmış aydınlatma elde optik kesit, normal yapısal detayları görselleştirme sağladığını göstermektedir ve Zebra balığı böbrek gelişimini rahatsız. Özellikle, wt1a morphants GFP-pozitif hücreler değişik odak derinliklerde disperse edilir ve dışı olma odaklama bulanıklık sadece tek bir düzlemde görüntüleri fenotipi üç boyutlu karmaşık hafife olacaktır.
Organ organizasyonu, düzenlenmesi ya da bozulma dinamiklerini takip etmek, zaman atlamalı floresan mikroskopi karmaşık tekniği olsa bir güçlüdür. time-lapse sırasındagörüntüleme hafif titreşimler veya küçük sıcaklık dalgalanmaları x, y veya z yönünde sürükleniyor neden olur. Bu istikrarlı sonuçlar elde etmek için ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) gerektirir. sunulan yöntem ekstra cihazlar olmadan zaman atlamalı görüntüleri kaydetmek için motorlu odak sürücü ile bir mikroskop yeteneği kullanır. istikrarlı bir odak sağlamak için, bir otofokus stratejisi kurulmuş ve görüntüleme odasının dibine baskılı bir tehcir ızgara x düzeltilmesi, y istikrarsızlık kullanıldı.
embriyonun uygun gömme protokolü içinde kritik bir adımdır. Bazı uygulama onunla bindirilirken olmadan ızgara olarak cam alt mümkün olduğu kadar yakın ve yakın çevresinde ilgi yapısını yerleştirmek için gereklidir.
yöntemin en önemli avantajı bu tür yaşam büyüme ve göç gibi gelişim süreçleri doğrudan gözlem için uygun fiyatlı ve basit bir araçtır olmasıdırbirkaç saat boyunca embriyolar. Ayrıca, bu tür görünüm ve genişletilmiş çalışma mesafesi geniş alanı olarak diseksiyonu mikroskop özgü yararları bütün organları dahil büyük örneklerin incelenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, bazı sınırlamalar göz önünde tutulması gerekir. Kontrol ve konumlandırma yeniden ayarlamak için deney duraklatma işlemi zaman alıcı ve sağlam bir sıcaklık kontrolü yokluğu zebrabalıkları 16 28.5 ° C'de saat sonra döllenme olarak tanımlanan "standart" gelişimsel zaman, değişiklikleri yapar. Bir diğer potansiyel sorun çıkar yapısı embriyo veya larva içinde bulunan, özellikle hayvana görüntüleme kısıtlı derinliğidir. Böyle bir yapı Somitlerin ve yolk kesesi arasında yer almaktadır Zebra balığı Pronephric glomerulus vardır. glomerul görüntüleme için sınırlayıcı derinliği yaklaşık 200 um, gelişme 5 gün sonra ulaşılır bir mesafe olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, L flüoresan yapılar olduğuDaha uzun bir süre için görüntülenebilir hayvanın yüzeyine yakın ocated. Örneğin karaciğer hücreleri en az 9 dpf'e kadar görüntüleme için erişilebilir. Bir başka sınırlama agaroz ve Tricaine tedavisinde embriyo veya larva uzun süreli immobilizasyon sırasıyla büyüme geriliği ve kalp ödemi neden olmasıdır. Bu normal gelişim engel olabilir, çünkü ilgi belirli bir süre için time-lapse kayıt süresini kısıtlamak için önerilmektedir. ilgi görüntüleme yapılarının sırasında emin olmak için bir hayvan olduğu ile genel görünümünü aynı deney koşulları altında, ancak gömme ve Anesthetization olmadan muhafaza (sonunda) karşılaştırmak yararlı olur normalde gelişir.
5 saat ve odak görüntü uzatılmış derinliği daha sonra hesaplama bir süre boyunca her 30 dakikada bir, normal erken olayları mekansal ve zamansal bilgiler ve optik kesit bir z-yığın kayıt b indüklenmiştir böbrek gelişimi rahatsızy wt1a ve demonte morfolino aracılı. Sabit zaman görüntüleme pronephros geliştirilmesi için GFP hattı 9,10 işaret ortaya. Daha önce gerçekleştirilen morfolino demonte deneyler Mevcut böbrek markör 17,18 ve transjenik wt1b istihdamı in situ hibridizasyon Wt1a pronephros oluşumunda bir erken ve gerekli bir rol oynadığı göstermiştir kesintiye glomerüler morfojenezinde o wt1a eksikliği sonuçları ve podosit şartname başarısız oldu. Bu statik yaklaşımların aksine, zaman atlamalı kayıtları doğrudan erken kontrol embriyolar nefrogenezisi ve wt1a morphants uzak Pronephric bölgeden GFP pozitif hücrelerin göç dinamiklerini görselleştirmek. zamanla yanlış yönlendirilmiş hücreleri izlemek için olasılık daha detaylı fenotip analiz sağlar.
Genel olarak, burada sunulan yöntem sağlayan ucuz ve karmaşık alternatif kullanımı kolay ve daha az erişilebilir setups normalde böyle (bir çevre odasına ve anti-vibrasyon masası ile donatılmış) lazer tarama mikroskobu veya hafif levha mikroskop gibi zaman atlamalı görüntüleme için kullanılır. sürüklenme sorunları gidermek için açıklanan rutin ayrıca floresan stereo mikroskop gibi optik kesit seçenekleri olmadan kurulumları zaman atlamalı görüntüleri gerçekleştirmek için uygulanabilir.
tekniği, sadece böbrek gelişimi araştırmak için uygundur, ancak, aynı zamanda, kalp, karaciğer ve diğer organların normal ve kusurlu morfonogenezi izlemek için uygulanabilir. Bundan başka, metot, yara iyileşmesi veya rejenerasyonu embriyonik ve yetişkin model organizmaların çeşitli dinamik işlemleri gözlemlemek için kullanılabilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz eleştirel okuma ve el yazması geliştirmek için Thomas Bates teşekkür ederiz. Biz de balık bakımı için Christina Ebert ve Sabrina Stötzer teşekkür ederiz.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |