Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hurtig Scan elektronspinresonans åbner nye muligheder for Imaging Fysiologisk vigtige parametre Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

En ny elektronspinresonans (EPR) metode, hurtige scanning EPR (RS-EPJ), der er påvist for 2D spektral rumlig billeddannelse, som er overlegen i forhold til den traditionelle kontinuert bølge (CW) teknik og åbner nye steder for in vivo imaging. Resultaterne demonstreres ved 250 MHz, men teknikken er anvendelig ved alle frekvenser.

Abstract

Vi demonstrerer en overlegen metode til 2D spektral-rumlige billeddannelse af stabile radikale reportermolekyler ved 250 MHz under anvendelse af hurtig-scan elektron-paramagnetisk resonans (RS-EPR), der kan give kvantitative oplysninger under in vivo-betingelser på oxygenkoncentration, pH, redox status og koncentration af signalmolekyler (dvs. OH •, NO •). RS-EPR teknik har en højere følsomhed, forbedret rumlig opløsning (1 mm), og kortere erhvervelse tid i sammenligning med standarden kontinuert bølge (CW) teknik. En række stiplede konfigurationer er blevet testet, med rumlig opløsning varierer fra 1 til 6 mm, og spektral bredde af reportermolekyler varierer fra 16 uT (160 mg) til 5 mT (50 G). En cross-loop bimodal resonator afkobler excitation og detektion, hvilket reducerer støjen, mens den hurtige scanning effekt giver mere magt til at være input til spin, før mætning, hvilket øger EPR-signalet. Dennefører til en væsentligt højere signal-til-støj-forhold end i konventionelle CW EPR eksperimenter.

Introduction

I forhold til andre medicinsk billedbehandling modaliteter, elektronspinresonans imaging (EPRI) er unikt i stand til kvantitativt billede fysiologiske egenskaber, herunder pH 1-3, PO2 4-7, temperatur 8, perfusion og levedygtighed af væv 9, mikroviskositet og let diffusion af små molekyler 10 og oxidativ stress 11. Skøn over den lethed af disulfid spaltning af glutathion (GSH) i væv og celler 12,13 kan rapportere om redox status. Til in vivo-billeddannelse, er EPR i frekvensområdet mellem 250 MHz og 1 GHz valgt, fordi disse frekvenser tilvejebringe tilstrækkelig dybde af vævspenetration (op til flere cm) for at danne billeder af små dyr, hvor intensiteter ikke er mindsket med dielektriske tab effekter. Højere frekvenser, såsom 9,5 GHz 14 (X-bånd) og 17 GHz (K u -Band) 15,16 kan anvendes til billeddannelse af hud og hår eller enkeltceller, henholdsvis. Succesen med EPRI ved alle frekvenser afhænger paramagnetiske spin-prober, som er specifikke for væv, så at deres placering og skæbne i miljøet kan afbildes.

Hvis miljøet af en elektron spin-sonde er rumligt heterogen, EPR spektrum er summen af ​​bidrag fra alle steder. Spektral-rumlige billeddannelse opdeler prøvens volumen i et array af små rumlige segmenter og beregner EPR spektrum for hver af disse segmenter 17. Dette tillader kortlægning af det lokale miljø ved at måle den rumlige variation i EPR-spektret. Magnetfeltgradienter anvendes til at kode geografisk information i EPR-spektre, som kaldes fremspring. Den spektrale-rumlige billede er rekonstrueret fra disse fremskrivninger 18,19.

I RS-EPR magnetfeltet scannes gennem resonans i en tid, der er kort i forhold til elektron spin-relaksationstider (figur 2) 20,21. D econvolution af den hurtige-scan signal giver absorptionsspektret, hvilket svarer til den første integral af det konventionelle første-derivat CW spektrum. signal hurtig-scan detekteres i kvadratur, således at begge absorptions- og spredningsegenskaber komponenter af spinsystem respons måles. Dette er hovedsagelig indsamler dobbelte mængde data pr tidsenhed. Mætning af signalet i en hurtig scanning eksperiment sker ved højere beføjelser end for CW, så højere magter kan anvendes uden bekymring for mætning. 20,22 Mange flere gennemsnit kan gøres per tidsenhed i sammenligning med CW. Højere magt, direkte kvadratur påvisning og flere gennemsnit per tidsenhed kombineres for at give hurtig scanning et bedre signal-til-støj-forhold (SNR), især ved høje gradient fremspring, der definerer rumlig adskillelse, hvilket fører til højere kvalitet billeder. For at opnå omtrent samme SNR for et billede af et fantom krævede ca. 10 gange så lang tid for CW som til hurtig scanning 23.

telt "> Den øgede SNR tillader også eksperimenter ved 250 MHz med lave koncentration af spin trap addukter dannet ved omsætningen af OH med 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline- N-oxid (BMPO-OH), som ville være usynlige for CW metode 24. Dinitroxides forbundet med en disulfid linker er følsomme for spaltning med glutathion, og så kan rapportere om cellulær redox-status. eksisterer Equilibrium, afhængig af koncentrationen af glutathion til stede mellem de di- og mono-radikal former. observere disse ændringer kræver indfangning af hele 5 mT bredt spektrum, og der kan opnås meget hurtigere med hurtig scanning EPR forhold til stepping magnetfeltet i en CW eksperiment.

Et komplet system for hurtig scanning består af fire dele: spektrometer, hovedfeltet magnet, den hurtige scanning coil driver, og den hurtige scanning tværs loop resonator. Spektrometeret og hovedfeltet magnet funktion den samme som i en CW eksperiment, indstilling af main Zeeman feltog indsamle data fra resonator. Den hurtige scanning spole driver genererer sinusformet scanning strøm, der går ind specialdesignede hurtige scan spoler på den hurtige scanning tværs loop resonator. De hurtige scan spoler på den hurtige scanning cross-loop resonator generere et stort homogent magnetfelt, som er fejet ved frekvenser mellem 3 og 15 kHz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opsætning af den hurtige Scan Coil driver ved 250 MHz

  1. Beregning af Rapid Scan Eksperimentelle Betingelser
    Bemærk: Den vigtigste parameter i RS-EPJ er scan sats, α, som er produktet af scanningen frekvens og scan bredde (ligning 3). For smalle scan bredder, er hurtigere scan satser anvendt, og til bredere sweep bredder, bruges langsommere scan satser. Følgende instruktioner træder gennem sidstnævnte tilfælde og vise, hvordan at nå frem til de eksperimentelle spole driver parametre for 7 mT sweep bredde og 6,8 kHz scan frekvens.
    1. Bestem resonator båndbredde (BW Res).
      ligning 1 (1)
      hvor v res er driftsfrekvensen resonatorens og Q er kvaliteten faktor. Q = 90, er fælles for en hurtig scanning resonator anvendes til at opnå dataene i Repræsentative resultater.
    2. Bestem den hurtige scan rate, α, alleskylder resonator båndbredde ligning 2 (2)
      ligning 3

      hvor N er en konstant ofte konservativt valgt til at være 5-6, Ab pp er peak-to-peak-derivat linewidth i mT, og a er scanningshastighed hvis T / s for en Lorentz linjebredde.
      Note: En almindelig værdi for de radikale i den repræsentative afsnit er ligning 4 = 0,1 mT. I sammenligning med tidligere litteratur hurtig scanning; Ligning 2 er afledt ved at indstille signalet båndbredde (BW SIG) lig med BW Res.
    3. Bestem den maksimale hurtige scanning frekvens tillades af hastigheden.
      ligning 5 (3)
      ligning 6
      hvor w er bredden af scan og f er scanningen frekvens. En sweep bredde på 7 mT vil dække 100% af spektret for strømprober anvendes in vivo. Brug denne værdi og den kurs, der beregnes i (ligning 2) for at bestemme scanningen frekvens.
      ligning 7
  2. Udvælgelse af afstemningskondensatorer og tuning af hurtig scanning spoledriver
    Bemærk: Den hurtige scanning spole driver er typisk køre i en klingende tilstand generere en sinusformet bølge. Resonans finder sted ved en scanning frekvens, hvor de induktive og kapacitive reaktanser er af samme størrelse og modsat fortegn, således at den samlede reaktans er tæt på nul.
    1. Bestem den korrekte kapacitans for frekvensen bestemmes i 1.1.3 ved hjælp af induktans, L, af de hurtige spoler scan og (ligning 4).
      ligning 8
      ligning 9
    2. Divider C TOT fra (ligning 4) i halvdelen at få kondensator værdier for hver side af spolen driver kondensator boks.
      ligning 10
      ligning 11
      Bemærk: Den hurtige scanning spole føreren har to forstærkere. Når du vælger en kondensator, skal afbalanceres med en lige kapacitans på hver side af kassen kondensatoren kassen. De to parter er i serie.
    3. Skru topdækslet af kondensator boksen og indsætte kondensatorer på begge sider, der er lig med værdien bestemt i trin 1.2.2.
    4. Sæt toppen af ​​kondensatoren, og skru den ned for at sikre, at den forbliver på.
    5. Brug af frontpanelet på klingende spoledriver, justere udgangsfrekvensen indtil den sinusformede bølgeform har den maksimale amplitude.

2. Forberedelse af reagenser og Phantoms

  1. Udarbejdelse af radicals
    1. Fjern 15 N-PDT fra fryseren og tillade beholderen at komme til stuetemperatur (10-15 min).
    2. Afvejes 1,4 mg 15 N-PDT ved hjælp af en analytisk balance.
    3. Tilføj 1,4 mg 15 N-PDT til 15 ml deioniseret (DI) H2O til en slutkoncentration på 0,5 mM.
      Bemærk: 4-oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) methyl-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra (2 H 3) methyl-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) og 3-carboxy-2,2,5,5-tetra (2 H 3) methyl-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-PROXYL) 25 (figur 1E-G) radikaler langtidsstabilitet (2 år) i vandig opløsning og ved stuetemperatur. Deres faste former sædvanligvis opbevares i en fryser eller køleskab for at holde disse radikaler stabile i årevis.Stabiliteten af ​​nitroxid radikaler generelt gør dem ikke-toksiske, og deres fremstilling kan udføres på en normal benchtop når opløsningsmidlet er vand. Ved brug af organiske opløsningsmidler, forberede nitroxid løsninger inde et stinkskab, mens udstyret med den rette personlige værnemidler (PPE).
  2. Fremstilling af pH-følsomme trityl radikaler
    1. Afvej 0,7 mg triaryl methylgruppe (Atam 4) 26 radikal (1.400 g / mol) og opløses i 200 pi absolut ethanol.
    2. Afvej 0,00681 g KH 2 PO 4 (136,1 g / mol) og opløses i 50 ml deioniseret vand til en slutkoncentration på 1 mM.
    3. Afvej 2,8 g KOH (56 g / mol) og opløses i 50 ml Dl-vand til en slutkoncentration på 1 M.
    4. Tilføj KOH dråbevis til phosphatbuffer (2.2.2) for at justere pH på 7,0.
    5. Tilføj 800 pi 1 mM phosphatpuffer og 200 pi af Atam 4 i absolut ethanol til en slutkoncentrationentration på 0,5 mM i 80:20 puffer: ethanol.
    6. Gentag trin 2.2.1-2.2.5 at skabe den Atam 4 prøven ved pH = 7,2.
    7. Placer Atam 4, pH = 7,0 og Atam 4, pH = 7,2 i separate 6 mm kvarts prøveglas.
    8. Placer begge 6 mm kvarts EPR-rør ind i en 16 mm kvarts EPR rør, med en 2 mm tyk Styrofoam spacer i mellem.
      Bemærk: Væggene i kvarts prøverøret er 0,5 mm tyk, og ud over de 2 mm spacer give en 3 mm adskillelse mellem Atam prøverne. De pH-følsomme trityl radikaler anvendte blev syntetiseret ved Ohio State University 26. Det eksempel, der blev anvendt til billeddannelse kaldes Atam 4. Omsætningen som tegner sig for pH-følsomheden er vist i figur 1A.
  3. Frembringelse af BMPO-OH
    1. Der afvejes 680 mg af KH 2 PO 4 og opløses i 100 ml DI-vand til en slutkoncentration på 50 mM.
    2. Tilsæt 1 M KOH dråbevistil phosphatpuffer til pH = 7,3.
    3. Afvejes 50 mg BMPO (199,25 g / mol).
    4. Kombiner 50 mg BMPO med 5 ml phosphatbuffer i en 16 mm kvarts bestråling rør.
    5. Tilsæt 100 pi 300 mM hydrogenperoxid.
    6. Bestråle blandingen i 16 mm kvarts bestråling rør med en mediumtryk 450 W UV-lampe i 5 minutter.
    7. Ved hjælp af en glas overførselspipette, overføre 2,5 ml af bestrålet BMPO-OH opløsningen ud af kvarts bestråling røret og ind i den ene side af en 16 mm kvarts prøverør med 3 mm divider.
    8. Overfør det resterende 2,5 ml bestrålede BMPO-OH i den anden side af 16 mm kvarts prøverør med 3 mm divider.
  4. Fremstilling af dinitroxide radikal
    1. Afvej 24,7 mg 2 H, 15 N-disulfid dinitroxide (figur 1C) i 1 ml DMSO til en stamopløsning på 47,5 mM.
    2. Forbered 10 mM Tris-buffer og justeres til pH 7,2.
    3. Tag 40pi dinitroxide stamopløsning og fortyndes med Tris-buffer til en slutkoncentration på 1 mM.
    4. Placer 250 pi dinitroxide opløsning i puffer i en 16 mm kvarts prøveglas med en 10 mm skillevæg i midten.
    5. Der afvejes 154 mg glutathion og tilføje til 5 ml Tris-puffer til en slutkoncentration på 100 mM.
    6. Tilsæt 5 pi af 100 mM glutathion opløsning til 250 pi af 1 mM dinitroxide opløsning på den ene side af 10 mm divider at konvertere diradikal i monoradikal.
  5. Fremstilling af nitronyl nitroxid
    1. Fjern radikalet fra fryseren og tillade beholderen at komme til stuetemperatur (10-15 min).
    2. Afvej 1,9 mg nitronyl (390 g / mol).
    3. Afvej 0,56 mg KOH og opløses i 10 ml DI-vand til en slutkoncentration på 1 mM.
    4. Bland 1,9 mg nitronyl i 10 ml 1 mM KOH-opløsning til en slutkoncentration på 0,5 mM nitronyl.
      Bemærk: Hvis necessAry, brug en vortexer eller sonikator til hastighed solvatisering af nitronyl.

3. Opsætning af den hurtige Scan instrument ved 250 MHz

Bemærk: Tuning af resonator med en vandig prøve af nitroxid radikal, som har en lignende effekt på resonator Q og tuning som bufferopløsning, er en god måde at sætte op for prøven, der skal afbildes

  1. Tune resonatoren med en vandig prøve af nitroxid radikal.
    1. Sæt 15 ml 0,5 mM 15 N-PDT i vand prøven i en 16 mm kvarts EPR rør.
    2. Sæt kvarts røret i afsløring side af cross-loop RS-EPJ resonator.
    3. Ændre frekvensen af ​​instrumentet kilde, indtil det passer hyppigheden af ​​påvisning side, der indeholder prøven. Manuelt ændre bærebølgefrekvensen af ​​250 MHz kilde ved at indtaste den ønskede værdi i software.
    4. Ændre frekvensen af ​​excitation side at matche freker af forsøget kilde og detektion side af resonator. Ændre frekvensen af ​​excitation side ved at dreje en variabel kondensator i resonatorkavitet ifølge producentens protokol.
  2. Opsæt Instrument Console og Main Magnet
    1. Tænd for spektrometer og vælg et eksperiment, der registrerer forbigående data med tiden som abscisse.
    2. Inden softwaren, indstille antallet af point til 65.536 og den tid basen til 10 ns.
    3. Indstille antallet af gennemsnit til 10.000 for en stærk eller smalt signal, og til 45.000 for en bred eller svagt signal.
    4. Tryk på knappen "engagere" i softwaren til at sende de eksperimentelle parametre fra software til konsollen og energi hovedfeltet magnet.
    5. Indstil vigtigste magnetfelt til 9 mT.
    6. Indstil tænd dæmpning knop til 50 dB, og tænd for 7 W high power forstærker.

4. UdførelseRapid Scan Experiment

Bemærk: Specifikke instruktioner relateret til analyse af fantomer indeholder BMPO-OH 24, er pH-følsomme TAM radikaler 19,27 og redox følsomme dinitroxides 28 tilvejebragt i litteraturen.

  1. Power mætning af standard nitroxid prøve
    Bemærk: Det er fordelagtigt at gøre en effekt mætningskurve på en standard nitroxid radikal prøve under de samme forsøgsbetingelser som vil blive benyttet til at se på radikaler følsomme i pH eller redox-status.
    1. Tænd for hurtig scanning spole driver, med værdierne fra afsnit 1 (scan frekvens på 6,8 kHz og scan bredde på 7 mT).
    2. Starter ved 50 dB, indsamle en hurtig scanning spektrum med 100k gennemsnit. Sænk dæmpning med 3 dB og gentag målingen. Fortsæt indtil en attenuator indstilling på 0 dB, eller så længe isoleringen måling på broen udlæsning er <0.
    3. Transfer than rå hurtige scan data til en udfoldning program (f.eks skrevet i Matlab) og behandle de rå data i absorptionsspektret.
    4. Indtast scanningen frekvens, sweep bredde, antal point og timebase ind i programmet, og kør programmet til at behandle rå hurtig scanning signal til et absorption signal.
    5. Plot amplituden af ​​absorptionen som en funktion af kvadratroden effekt (i watt) indfaldende på resonatoren. I den ikke-mættende regime, amplituden er lineært afhængig af kvadratroden af ​​indfaldende effekt.
    6. Monter en tendens linje starter ved 0,0 og omfatter alle datapunkter, der falder ind i den lineære respons region. I den lineære respons region, signal amplitude stiger proportionalt med kvadratroden af ​​mikrobølgeeffekt.
    7. Ekstrapolere denne tendens til højere magter, og sammenligne EPR signal intensitet. Brug den højeste effekt, for hvilken signalamplituden ikke afviger mere end 3% fra den ekstrapolerede trend linje. I order til udfoldning af den hurtige signal scanning for at fungere korrekt, skal signalet stadig være i den lineære respons region med hensyn til hændelse magt.
      Bemærk: Overførsel af de rå data hurtige scanning kan gøres over en netværksforbindelse eller via tommelfinger drev. I dette tilfælde er det nødvendigt overdragelsen fordi programmet at behandle rådata (Matlab) er ikke på den samme computer, som har dataindsamling software. Den udfoldning algoritme, der behandler rå data er beskrevet i 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Produktet fra eksperimentet er et sæt af fremspring, der er rekonstrueret i todimensionale (en spektral, en rumlig) billeder med en falsk farveskala til at repræsentere signalamplitude. Dyb blå betegner baseline, hvor intet signal er til stede, grøn er lav amplitude og rød er højest. Skiver langs x-aksen (spektral dimension) afbilder EPR-signalet (EPR overgang) på et magnetfelt akse. Langs y-aksen (rumlige dimension), adskillelse mellem signaler svarer til den fysiske rumlige adskillelse mellem prøver i resonatorerne.

Figur 3 viser en sammenligning af to billeder, erhvervede med CW (figur 3B) eller RS (figur 3A) af et fantom med tre forskellige typer af 15 N substituerede nitroxid radikaler (figur 3D). Den bredeste signal svarer til 15 N-PROXYL, en fem medlem pyrrotidine ring med en negativ ladning ved fysiologisk pH, som kan hjælpe med at målrette molekylet til specifikke cellulære rum. Dubletten signal tilhører 15 N-mHCTPO og er resultatet af en enkelt hydrogen midt ellers komplet deutereringen. Denne enkelt opdeling er optimeret til at overvåge ændringer i iltkoncentrationen 30. Den smalleste signal kommer fra 15 N-PDT, en fleksibel piperidinring, der er helt deutereret. Det kan bruges til at overvåge oxygenkoncentrationen, eller redox miljøet (reduktion af strukturen fører til fald i EPR signal).

Af samme 5-min erhvervelse tid, RS billede viser overlegen rumlig opløsning og klarhed af den spektrale mønster for hver gruppe. En årsag til forbedring af RS end CW kan ses ved at sammenligne spektre ved to forskellige gradient styrker mellem de to teknikker (figur 3C). Som gradient styrke øges despektralsignalet udvides. Betydelig nedbrydning af CW spektret under de høje gradienter (1 mT / cm), som koder for geografisk information.

Fordi et derivat signal udvider hurtigere end en absorption signal, SNR for den højeste gradient CW fremspring (rød trace) er meget ringe sammenlignet med den for den højeste gradient RS fremspring (blå spor). Liniebredde som en funktion af rumlig position kan ekstraheres fra en 2D plot. Linjebredde vil være bredt eller smalt baseret på ændringer i ilt koncentration eller viskositet omkring nitroxid sonden. Fantomet afbildet i figur 3A var ved stuetemperatur, og åben til luften. Da iltindhold og viskositet (som bestemt ved temperatur) forblev stabil, bør liniebredden af hver probe være konstant tværs over bredden af hvert rør indeholdende en radikal. Figur 4 viser spredning i linjebredder passer fra skiver gennem 2D-billedet sammenlignettil den sande liniebredden værdi (sort vandret linje). De billede skive værdier, især for 15 N-PDT, er et bedre match til den sande liniebredden værdi for RS (figur 4A) end for CW (figur 4B). Dette er også et resultat af den forbedrede SNR af RS over CW teknik.

En anden fordel ved RS teknik er evnen til at generere store magnetiske homogene felt fejer i en meget kort tid. En typisk scanning frekvens for eksperimenter ved 250 MHz er 9 kHz, svarende til 0,11 ms. Dette er 0.11 msek, om feltet sweep er 0,5 mT eller 5,0 mT. Sammenlign dette med CW, hvor en 5,0 mT sweep vil tage snesevis af sekunder til minutter. Med hurtig scanning bliver det muligt hurtigt at samle 100% af den spektrale information i tider som Domstolen kan in vivo imaging.

Figur 5 demonstrerer brede spektrum RS-EPJ imaging anvendes til at spinde fældefangst modeller. Vigtige signalmolekyler, som OH • og NEJ • er endogene frie radikaler med meget korte levetider. For at studere disse molekyler, er "spin-fælder" anvendes. Et eksempel på omsætningen af spin-fælde 31 (BMPO) med OH • er vist i figur 1B. Billeddannelse af et fantom indeholdende 5 pM BMPO-OH adduktet er vist i figur 5 (A, B). Spin-fælde addukt signal er afhængig af startkoncentrationen af OH • og har en halveringstid på 30 minutter muliggør undersøgelse af eventuelle processer, som frembringer OH •. Den nitronyl nitoxide 32 blev anvendt som et andet eksempel på bredt spektrum billeddannelse, men har været anvendt i fortiden for spin-indfangning af NO • 33,34. Billeddannelse af et fantom indeholdende nitronyl er vist i figur 5 (C, D). For spi fælder, opfange hele spektret giver en bedre betegnelse for de oprindelige forbigående radikale arter, der var til stede.

Følsomhed over for fysiologiske ændringer som pH og redox-status er afledt af ændringer i hele spektret. Figur 6 viser billeddannelse med Atam 4. I figur 6B, profil Atam 4 ved pH = 7,0 (blå) har mange spektrale træk, og et udsnit fra billedet passer godt med den tilsvarende nul gradient spektrum (grøn). Sammenlign denne til profilen af Atam 4 ved pH = 7,4, figur 6C, med færre spektrale træk og stadig i god overensstemmelse med den tilsvarende nul gradient spektrum. Billeddannelse af fantomer indeholdende af dinitroxide i sin dimere og reduceret monomere form er vist i figur 7. De to forskellige spektre er genereret ved spaltning af et disulfid (SS), og så formidle følsomhed over for redox environment 1,35.

figur 1
Figur 1. EPR prober er følsomme for mange fysiologiske ændringer. (A) Et eksempel på pH-følsomme tri-aryl-methyl (TAM) radikaler 26. (B) Spin fælde BMPO. (C) 15 N-dinitroxide. (D) Den nitronyl. (E) 15 N-PROXYL. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Hurtig scanning EPJ har i sagens natur bedre SNR. (A) In CW EPR amplituden h er en lille brøkdel af det samlede signal, der bestemmes af magnetfeltet modulation. (B) I direkte-opdaget hurtig scanning, registreres den fulde signal amplitude. Signal-støj stigning er tydelig i eksperimentet, hvor superoxid genereret af E. faecalis er fanget med BMPO ved X-band. Af samme 30 sek erhvervelse tid, næppe nogen signal observeres i CW spektrum (C), mens et stærkt signal er observeret i den hurtige scanning spektrum (D) 36. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Forbedret SNR giver en bedre rumlig opløsning. For den samme 5-minutters erhvervelse tid, RS billede ( (B). (C) Der er god overensstemmelse mellem fremskrivninger erhvervet med hurtig scanning (blå) og CW (rød), når ingen gradient er til stede (0 mT / cm) (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Indholdet af en hurtig scanning billedinformation er højere end for CW. (A) Skiver af 2D RS billedet. (B) Skiver af 2D CW billede. Den sande linjebredde (sort vandret linje) af hver prøve er vist til sammenligning. Se reference 23. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Rapid felt fejning tillader indfangning af et helt spektrum i et par sekunder. (A) 2D spektral-rumlige billede af et fantom bestående af BMPO-OH addukt. (B) En simulering tilpasning til nul-gradienten BMPO-OH-spektrum ved 250 MHz blev anvendt til at passe den oprindelige BMPO-OH billede og skelne mellem regioner, der indeholder BMPO-OH og støj indeholdende regioner. (C) 14 N nitronyl radikal, som kan anvendes til fangst af nitrogenoxid in vivo. (D) Skiver gennem hvert spektrum viser den spektrale form ved 250 MHz. Se reference 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

ve_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 6
Figur 6. Ingen del af spektret er udeladt, så bedre overvågning af fysiologisk inducerede spektrale ændringer. (A) 2D spektral-rumlige billede af et fantom, der består af to rør af pH-følsom Atam 4 radikal. (B) Spectral profil Atam 4 ved pH = 7,0 (blå) og den tilsvarende nul gradient spektrum (grøn). (C) Spectral profil Atam 4 ved pH = 7,4 B (blå) og den tilsvarende nul-gradient spektrum (grøn). Se referencer 19,26,37. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Rapid scanning åbner døren til in vivo redox overvågning ved 250 MHz. (A) 2D spektrale-rumlige billeder af 15 N-dinitroxide. (B) Skiver gennem toppen (blå spor) og bund (rød trace) rum i de to billeder. (C) Den øverste rum forbliver den samme, men den nederste rum er blevet reduceret med glutathion. (D) Slice gennem hvert billede objekt der viser ændringen i 1D-spektrum af den nederste rum. Se referencer 1,28,35. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rapid-scan signaler har højere frekvenskomponenter end CW, og kræver en større resonator båndbredde afhængigt linjebredder, relaksationstider, og hastigheden af ​​den hurtigtvirkende scanninger. Den båndbredde, der kræves for et givet eksperiment er baseret på linjebredde og scanningshastighed på magnetfeltet (ligning 2). Afhængigt af relaksationstiden for sonden under undersøgelse (T 2 og T 2 *), og skanningshastigheden, kan oscillationer vises på bagkanten af signalet. For nitroxid radikaler med T 2 ~ 500 ns ved 250 MHz (57 th Rocky Mountain konference om Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015), eksperimentelle scan satser ofte ikke er høj nok til at observere eventuelle svingninger.

Den eksperimentelle båndbredde er typisk begrænset af resonatoren båndbredde. Hver halvdel cyklus af en hurtig scanning eksperiment er optaget med enten faldende eller stigende felt / frekvens, så den eksperimentelle båndbredde er ½ than resonator båndbredde, som vist i (ligning 1). Hvis den eksperimentelle båndbredde er begrænset af valget af parametre, således at den er større end resonator båndbredde og svingninger dæmpes, udvider resultater i udfoldede linje. Da forsøget båndbredde er bestemt af hastigheden og linewidth af den radikale blive undersøgt, forstå disse funktioner er et centralt element i den hurtige scanning eksperiment.

Den nuværende protokol viser EPRI ved 250 MHz af fantomer indeholdende prober følsomme over for oxygen, viskositet, pH, endogen forbigående signaleringsmolekyler (dvs. OH •, NO •) og redox-status. Geografiske opløsninger på mellem 1 og 3 mm er blevet påvist, med eksperimentelle erhvervelsestider mellem 29 sekunder (enkelt linie af en 2 linje 15 N spektrum, figur 3) og 15 minutter (fulde spektrum af 5 uM BMPO-OH, figur 5). Metodeudvikling med fantomer showsbrug af RS-EPJ billeder erstatter den konventionelle CW-EPJ imaging teknik 23,24, og åbner nye muligheder for in vivo imaging ved hjælp EPR prober.

EPRI er fordelagtig i forhold til andre in vivo-billeddannelse teknikker baseret på fluorescens eller phosphorescens, som EPR prober er følsomme over for et bredere udvalg af in vivo fænomener. Desuden RF penetration ved 250 MHz er ~ 7 cm, således at anomal væv på et dybere niveau kan studeres. Nuklear magnetisk resonans imaging (MRI) giver meget detaljerede anatomiske kort, men kæmper for at give kvantitative fysiologiske oplysninger. En kombination af MRI og EPRI der en dag resultat i en all magnetisk resonans version af en positron-emissions-tomografi (PET) / computertomografi (CT) scanner. Et sådant instrument ville give den samme fordel for PET / CT, men uden de store strålingsdoser eller dyre radioaktive sporstoffer.

Metodeudvikling med fantomer fortsætter med at skubbe than begrænser af RS-EPJ, men det ultimative mål er at gennemføre den teknik i laboratorier med dyremodeller. Beregninger for billed rekonstruktioner skal forbedres for at fremskynde indsamling af data til en 4D eksperiment (3 rumlige, en spektral dimension). En forbedret algoritme er under udvikling og er afgørende for in vivo applikationer, men beviset for princippet kan gøres med 2D-billedbehandling.

Mange af de radikaler, såsom 15 N-PDT, der anvendes i fantomer nedbrydes hurtigt under in vivo betingelser med halveringstider på kun 60 sekunder. Grupper med en forbedret resistens over for in vivo reduktion 39 er blevet syntetiseret og er vigtige for opbygningen tilstrækkeligt store koncentrationer in vivo. Den forbedrede følsomhed RS-EPR i CW-EPR 24 vil være en anden fordel i at løse dette problem. Følsomheden af ​​hurtige scanning er i øjeblikket 5 uM for et fantom, og mellem 100 um og 5 mm afhængigt afsonden skal afbildes, for dyreforsøg bliver udført på University of Chicago (personlig kommunikation, Maggio, M., 2015). RS metode vil fortsat blive udviklet til at lukke dette hul, men ansøgningen er allerede begyndt at flytte ind i faktiske in vivo applikationer (57 th Rocky Mountain konference om Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Delvis støtte for dette arbejde ved NIH tilskud NIBIB EB002807 og CA177744 (GRE og SSE) og P41 EB002034 til GRE, Howard J. Halpern, PI, og ved University of Denver er taknemmeligt anerkendt. Mark Tseytlin blev støttet af NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Forfatterne er taknemmelige for Valery Khramtsov, nu på University of West Virginia, og Illirian Dhimitruka ved Ohio State University til syntese af de pH-følsomme TAM radikaler, og Gerald Rosen og Joseph Kao ved University of Maryland til syntese af mHCTPO , PROXYL, BMPO og nitronyl radikaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Tags

Bioengineering elektronspinresonans (EPR) hurtig scanning nitroxid, 250 MHz pH iltkoncentration redox status signalmolekyler biofysik
Hurtig Scan elektronspinresonans åbner nye muligheder for Imaging Fysiologisk vigtige parametre<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, J. R., Mitchell, D. G.,… More

Biller, J. R., Mitchell, D. G., Tseytlin, M., Elajaili, H., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo. J. Vis. Exp. (115), e54068, doi:10.3791/54068 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter