Summary
私たちは、保存可能な、可搬型の脂質二重層形成システムを実証します。凍結した膜前駆体を周囲温度にしたときに脂質二重膜は、80％以上の成功率で1時間以内に形成することができます。このシステムは、イオンチャンネルに関連した面倒なプロセスと専門知識を軽減します。
Abstract
人工脂質二重層、または黒色脂質膜（BLM）は、イオンチャネルおよびタンパク質相互作用を研究するため、ならびにバイオセンサー用途のための強力なツールです。しかし、従来のBLM形成技術は、いくつかの欠点を持っており、彼らはしばしば、特定の専門知識と手間のかかるプロセスを必要とします。具体的には、従来のBLMsは低形成の成功率と一貫性のない膜形成時間に苦しみます。ここでは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）に、従来から使用されるフィルム（ポリテトラフルオロエチレン、ポリオキシメチレン、ポリスチレン）を交換することによって制御間引き時間と強化されたBLM形成速度で貯蔵可能と搬型BLM形成システムを実証します。この実験では、このようなPDMS薄膜として多孔構造ポリマーが使用されます。また、低粘度で、従来から使用される溶媒とは対照的に、スクアレンの使用は、膜の寿命を延長する、PDMSによって遅く溶媒吸収を介して制御間引き時間を可能にしました。広告でditionは、スクアレン及びヘキサデカンの混合物を使用して、脂質溶液の凝固点は、無期限に保存され、容易に輸送することができ、膜前駆体を作製した。加えて、（〜16℃）に上昇させました。これらの膜前駆体は、<1時間のBLM形成時間を減少させ、〜80％のBLM形成速度を達成しています。また、グラミシジンAとイオンチャンネル実験は、膜システムの実現可能性を実証しました。
Introduction
人工脂質二重膜、または黒色脂質膜（BLM）、細胞膜、およびイオンチャネルのメカニズムを解明するため、ならびにイオンチャネル及びイオン/分子間の相互作用を理解するための重要なツールである。パッチクランプ法が、1-7多くの場合、細胞膜の研究のためのゴールドスタンダードとみなされ、それは面倒であり、イオンチャネル測定のための高度に熟練したオペレータを必要とする。8人工的に再構成された脂質二分子膜は、イオンチャネルの研究のための代替的なツールとして浮上してきたが、9,10、それらも面倒に関連付けられていますプロセスおよび特定の専門知識。さらに、膜は機械的な摂動の影響を受けやすいです。したがって、これまでに導入された脂質二重層の技術は、実際の用途が限られている。11
脂質二重膜の堅牢性と寿命を向上させるために、コステロら 12、およびIDEと柳田
脂質二重層プラットフォームの開発は、主に増加堅牢性とBLMsの寿命を中心に展開しています。 BLMsの寿命は、suコマンドであったがbstantially最近強化され、そのアプリケーションが原因で輸送及び保存性の欠如に限られていました。これらの問題を克服するために、チョンら貯蔵可能な膜システムを作成し、MPを構築するために、膜前駆体（MP）16を導入し 、それらを3％DPhPC（1,2- diphytanoyl-を含むN-デカン、ヘキサデカンの混合物を調製し錫 -glycero -3-ホスファチジルコリン）は、〜14℃（室温下、典型的な冷蔵温度以上）で凍結なるように、脂質溶液の凝固点を制御します。この実験では、MPは、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）膜の小さな開口部に広がるし、続いて4℃で冷蔵庫に凍結しました。 MPを室温にしたときに、MPを解凍し、脂質二重層を自動的に形成し、典型的には膜形成に関連する専門知識を排除します。しかし、MPから作られたBLMの成功率は、〜27％と低く、膜構成体nは時間がその実用的なアプリケーションを制限する、（24時間まで30分）矛盾していました。
以前にリュによって報告されたように、本研究では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）薄膜の代わりに（A）コントロール製造時間及び（b）BLM形成の成功率を高めるために、従来の疎水性薄膜（PTFE、ポリオキシメチレン、ポリスチレン）で使用されら 17ここで、膜形成は、PDMSの多孔性の性質に起因する溶媒抽出によって促進された、膜形成に要する時間が正常にこの研究で制御しました。脂質溶液は、PDMS薄膜中に吸収されたように、このシステムでは、一貫性のある膜形成時間が達成されました。また、膜の寿命はPDMS薄膜、脂質溶液のスクアレンの加算結果に起因する溶媒の遅い吸収を延長しました。我々は、この技術を用いて形成された膜は私に適していることを確認するために光学的及び電気的測定を実施しましたチャネルの研究に関する。
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Protocol
1.溶液の調製
- 緩衝液の調製：
- 緩衝液を処方するために、蒸留水で1 MのKCl（塩化カリウム）、10mMのトリス-HCl（トリス - 塩酸塩）、及び1mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を溶解し、pHを8.0に調整します。
- 0.20μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。滅菌するために、15分間121℃で溶液をオートクレーブ。
- プレ塗装のための脂質溶液の調製：
- 8 のn -デカン及びヘキサデカン（V：2の混合物中：プレ絵画、3％を溶解DPhPC（1,2- diphytanoyl- のsn -glycero -3-ホスファチジルコリン）脂質（V w）のための脂質溶液を策定するために、 V）。回転子を使用して、一晩撹拌しました。
- 膜形成のための脂質溶液の調製：
- 膜形成のための脂質溶液を調合するために、DPhPC 0.1％を溶解させ（1、2-diphytanoyl- SN -glycero -3-ホスファチジルコリン）（W：V）脂質：8 SQ 2の混合物でualene及びヘキサデカン（V：V）。回転子を使用して、一晩撹拌しました。
PDMS薄膜の2形成
- PDMSプレポリマーを形成するために、混合カップ1（w / w）の比：9にPDMSと硬化剤を混合します。 （ - 厚さ250μm200）PDMS薄膜を形成するためのペトリ皿にPDMSプレポリマーの5グラムを追加します。薄膜を形成するために10秒間800rpmでスピンコーターを用いて、PDMSプレポリマーを広げます。
- 気泡を除去するために2時間100ミリトールの圧力で真空デシケーターにペトリ皿を置きます。プレポリマー薄膜、70℃で5時間、オーブンで焼くを重合させます。
- 正方形PDMS薄膜を作るために、2×2 cm 2の正方形に重合PDMS薄膜を切りました。 PDMS薄膜の中央に開口部を作るために500μmのマイクロパンチを使用してください。 8 のn-デカン、ヘキサデカン：2で混合し、3％DPhPCの脂質溶液による前ペイント開口。
3.チャンバーの作製とASSEmbly
- BLM室を製造するために、4センチメートルのx 1.5センチメートル×1センチ、X 1.3センチメートルのx 0.8センチメートル17 1.5センチメートルの内側のウェルの寸法の外形寸法と3D描画ソフトウェアを使用して、チャンバの設計2対称ブロック。
- CNCマシンとPTFEブロックを用いてチャンバを作ると、製造元の指示に従ってください。
4.商工会議総会
- 室を組み立てるために、2つのPTFEブロック間塗装済み-PDMS薄膜を配置するPDMS薄膜上に開口部がチャンバーの穴と一致するように。
- （光学観察を容易にする）グリースでカバーガラスを用いてチャンバの外縁をシール。ナットとボルトを使用して組み立てられたチャンバーを固定化します。
メモ：液漏れがないように、チャンバは、よく密封されていることを確認します。
速め自己組織形成と膜前駆体の5形成（MPES）
- ピペットを使用して、0.5を堆積8 のn -デカン：2で混合し、0.1％DPhPC脂質μlの室で組み立てPDMS薄膜の開口部の上にヘキサデカン。
- 使用前に、冷凍庫または10℃以下の冷蔵庫にチャンバを格納します。
6.膜形成と検証
- MPESとBLMを形成するためには、冷蔵庫からチャンバーを撤回し、チャンバーの各側面に緩衝液2mlを一時停止します。凍結した膜前駆体が解凍されるまで、<10分間脇室を設定します。
- 正確には、光源と顕微鏡に対する仰角を制御するためにマイクロマニピュレーターの上室を置きます。 BLM形成プロセスの光学観察用PDMS薄膜の開口部を明るくするためにハロゲン光ファイバ照明装置を用いた光源として、チャンバの一方の側を照明します。
- 他の側では、（20によって拡大BLMの形成を観察するために、光源に対して垂直にデジタル顕微鏡を配置0X）。
- BLMの形成を確認するために、色が弁輪よりも明るくなる開口部の中心を観察します。
7.電気的記録
- 電気的測定のために、> 1分間の次亜塩素酸ナトリウムで208ミクロンの厚さの銀線や漂白剤を使用したAg / CL電極を準備します。十分な深室の各側面に銀/ CL電極を配置するには、緩衝液中に浸漬されます。
- 微小電極増幅器に電極を接続します。電気生理学ソフトウェアを使用して、方形波を取得するために膜を横切って±10 mVの三角波形を適用します。 V_clamp（MV）に示されている矢印をクリックすることで、電圧を印加することに設定します。
- 録音ボタン（赤い点のアイコン）をクリックすることにより、膜の電気的特性を記録します。均一な方形波が観察されるまで記録を続行します。黒い四角いアイコンをクリックして録音を終了します。
8.イオンチャネル設立
NOTE：GAは脂質溶液に直接添加されているようグラミシジンA（GA）の取り込みは、BLMの形成時に自然に起こります。
- ジョージアチャネル活動を観察するために、膜の保持電位を測定するために、5 kHzでのサンプルレートで膜を横切って100 mVのに適用します。 V_clamp（MV）に示されている矢印をクリックすることで、電圧を印加することに設定します。
- 録音ボタン（赤い点のアイコン）をクリックしてのGA取り込みの電気的特性を記録します。現在のジャンプが観察されるまで記録を続行します。黒い四角いアイコンをクリックして録音を終了します。
- 電気的データ収集の後、電気生理学ソフトウェアを使用して100Hzでローパスベッセルフィルタでデータをフィルタリングします。
- フィルタリング潜在的なデータを保持するには、現在のジャンプを観察したGaの取り込みを確認するために（〜0.15 NS、それぞれ現在のジャンプを、Gaイオンチャネルの二量体化を表します）。
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Representative Results
MPES液組成の最適化
脂質および溶媒の異なる組成が正常MPESの脂質二重膜を再構成するために試験しました。 DPhPC 14 3％を含有するN-デカン、ヘキサデカンの混合物MPシステムは、膜形成（〜27％）の低い成功率を示しました。 PDMS膜を連続的に脂質溶液を抽出したように加えて、無傷の脂質二重膜を維持するために、溶媒組成を最適化する必要がありました。従って、20℃、18で12センチポイズの粘度を有するスクアレンは、代わりに20℃で0.92センチポイズの粘度を有するN-デカン、を使用した。19スクアレンが原因に増加し、安定性と寿命の両方を用いた場合PDMSによる溶媒吸収の減少率。 表1は、間引き時間、寿命、および異なる溶媒組成を有する膜の成功率を比較します。
のn-デカンを用いた場合、膜の形成が矛盾していましたし、膜が頻繁に起因するPDMS薄膜による溶媒の急速な吸収に、短時間で破裂しました。スクアレンを使用した一方、膜破断までの時間が遅延しました。また、膜形成時には、膜形成の成功率が向上し、膜の寿命が増加、より一貫性になりました。
膜前駆体（MP）からの膜形成
MPは、室温で解凍の際に容易に使用可能となる脂質溶液の凍結状態です。 PDMS薄膜中の小さな開口16℃以下に凍結し、そして凍結した形で無制限に保存可能と搬型ある中でのn-デカン、ヘキサデカンの混合物を含有する脂質溶液は。 図1は、PTFEとPDMS薄膜のアセンブリを示しています茶MPを生成するmber。使用前に、PTFEチャンバは、膜形成用冷蔵庫から取り出しました。本明細書において、凍結脂質溶液を含むPDMS薄膜PTFEチャンバの2つの半分の間に配置しました。緩衝溶液は、その後、室温、凍結膜前駆体（MP）の解凍の際に自然に形成された脂質二重膜でチャンバの両側に追加されたとき。
解凍の際、図2で説明したように脂質溶液を間引い。凍結膜前駆体を解凍すると、バッファと脂質溶液との界面に沿った2つの単層を接触させた。膜を形成した後20、予備混合したGaモノマー脂質溶液のチャネル活性を示しました。
膜の光学観測
光学膜の形成を確認するために、我々膜を可視化するために透過光を使用します。膜形成時には、膜が原因で間引処理に周囲よりも明るく現れ、アパーチャ（膜形成の場所）の中心が線維輪よりも明るかった。 図3は、デジタル顕微鏡を介して観察膜形成を示しています。膜が正常に間引き融解時。
脂質二重層の電気計測
我々は、膜の厚さを計算するために、増幅器を用いて膜を横切って電流を測定しました。 Ag / AgCl電極は、電気的測定のために両方のチャンバに浸漬しました。 10 mVのピークツーピーク三角波が膜を横切って印加されたときに、三角波は（コンデンサとして作用する）による脂質二重膜の特性への電流の方形波に変換した。21その結果、ました膜の厚さを推定することができます以下の式を用いて。
ここで、I（t）は、電流を表し、Cは、膜を横切って静電容量を表します。 Vは、印加されたピーク・ツー・ピーク電圧（0.0625秒20 mVの）を表します。ここで、Cは、脂質の自由空間の誘電率（×10 8.85 12 F / m 2）で、誘電率（2.1）で表すことができ、22 A、膜の面積（〜1.29×10 -7 M 2）、およびd、二重層の厚さ。 図3と電気的データにおける光学的データでは、我々は〜4nmであることが、膜の厚さを算出しました。また、再構成された膜は、典型的には、イオンチャネルの研究のために必要とされるギガオームレベルシール（> 1GΩ）を満足する。23
グラミシジンAのイオンチャネル活動（GA）
MPから形成された脂質二重層を有するイオンチャネルスクリーニングの実現可能性を検証するために、我々は、GA、膜形成を確認するために最も頻繁に使用されるイオンチャネルの1つを組み込みました。グラミシジンAは7イオンチャネルの形のgAの二量体化時に。その後、二量体化する二つの異なるサブユニットのような膜に組み込まれ、及びイオンがGaイオンチャネルを透過する。4は、取り込みとGaの二量体化を示しています。 GA二量化の際に、ジョージア州のチャネルコンダクタンスのレベルは、以前の報告の結果と一致し28のpSであった。3
| 脂質濃度 | 溶媒 | 間引き時間（分） | ライフタイム（分） | 成功率 |
| 0.1％ | 2：8 スクアレン：ヘキサデカン | 50.6（30.9を±） | 52.4（30.9を±） | 77.8パーセント |
| 0.1％ | 2：8 n個のデカン：ヘキサデカン | 13.2（12.3±） | 10.8（±7.8） | 75.2パーセント |
| 1％ | 2：8 n個のデカン：ヘキサデカン | 15.8（±8.8） | 26.2（25.3±） | 69.3パーセント |
| 1％ | 2：8 n個のデカン：ヘキサデカン | 13.8（13.3±） | 23.6（30.1±） | 55.6パーセント |
| 1％ | 2：8 n個のデカン：ヘキサデカン | 13.6（10.3±） | 8.9（3.0±） | 50.0％ |
MPES液組成の表1の最適化。脂質溶液の0.5μlをPDMS薄膜開口部（直径500μm）に懸濁させました。ここでは、脂質濃度、溶媒の組成、及びプレ塗装変える。17。龍、H. らの許可を得て適応。7
膜形成システムの 図1. 模式図はチャンバーの各半分の外形寸法は、4センチメートルのx 1.5センチメートル×1 cmであった、と内側のウェルのサイズは1.5センチメートルのx 1.3センチメートルは×0.8 cmでした。内側のウェルを緩衝液2mlに適応するのに十分な大きさでした。各PTFEブロックに緩衝溶液でPDMS薄膜の接触を持っている穴がありました。他方側はBLMの光学観察用のカバーガラスで密閉しました。最後に、チャンバーブロックは液漏れを回避するために、ボルトとナットで補強しました。4258 / 54258fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PDMS薄膜開口部の図 速め自己組織化と凍結膜前駆体の 2 模式図（MPES）形成。脂質溶液は、無期限に凍結することができます。凍結した膜前駆体を解凍するために室温に持ち込まれた場合には、脂質二重層の形成が原因でPDMS薄膜中に疎水性溶剤の抽出を容易にされます。 GAモノマーが直接脂質溶液中に追加されたように、膜形成直後に形成されたGaイオンチャネルは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
= "/ファイル/ ftp_upload / 54258 / 54258fig3.jpg" />
図3.間引き処理の顕微鏡図。MPESと疎水性溶媒のその後の吸収の解凍時には、間引き処理は、PDMS薄膜の開口部に促進された、膜は解凍後2分以内に形成されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
グラミシジンA.現在の組み込みの際に、図4の電気測定は 、膜への組み込みとGaの二量体化が示されている時にジャンプします。 〜28 Psの振幅は（保持電位は100mV、100ヘルツベッセルローパスフィルタ）のGAモノマーの二量体化の際に観察されました。目標確認= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
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