방법 논문

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

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⸱

DOI:

10.3791/54277

⸱

2016년 7월 25일

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

이 논문에서

요약

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

영양막 줄기 세포 (의 TSC)는 포유 동물 발달에서 제 1 셀의 운명 결정의 결과로서 발생한다. 그들은 자기 갱신과 태반의 태아 부분에 세포 인구주는 상승 줄기 생체에 해당 영양막 세포 계보의 모든 하위 유형으로 분화 할 수있는 능력을 유지, 체외에서 배양 할 수있다. 따라서,의 TSC는 체외에서 여분의 배아 세포 운명 결정 대 태반 개발 및 배아를 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이후 배반포 단계에서 DNA 메틸화와 히스톤 수정 구성된 별개의 후생 유전 학적 장벽은 단단히 두 계통을 분리한다. 여기, 우리는 완전히 과발현 쥐의 배아 섬유 아세포에서 영양막 세포 키 규제 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2의 과도하여이 혈통의 장벽을 극복 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유도 영양막 세포의 줄기 세포는 자기 갱신 할 수 있습니다 및 파생 영양막 세포의 줄기 세포를 배반포 거의 동일하다 내가형태, 마커 유전자 발현과 메틸화 패턴 N 조건. 생체 외 및 생체 내 분석 기능은 이러한 세포는 영양막 세포의 혈통이 배수체 영양막 세포 거대 세포를 생성하고 포배에 주입하면 태반을 chimerizing 따라 차별화 할 수 있는지 확인합니다. 체세포 조직에서 영양막 줄기 세포의 유도는이 엑스트라 배아 혈통 유전자 및 후생 유전 학적 특성을 연구하는 새로운 길을 열고 각각의 배아를 파괴하지 않고 영양막 줄기 세포주를 생성하기위한 가능성을 제공한다.

서론

최근 줄기 세포 변환을 영양막하는 마우스 배아 줄기 세포의 여러 가지 접근 방식을 비교하는 연구는 모든 분석 시스템에서, 혈통 전환이 불완전 남아 있음을 밝혔다. 대신 그래서 영양막 줄기라고 유도 영양막 줄기 세포 (iTSCs)의 세포 유사 세포가 기원 한 세포의 운명의 메모리 유지 생성되었다. 여기, 우리는 ITSC 세대의 다른 접근 방식을 따랐다. 쥐 배아 섬유 아세포 (MEFs에) (2)로부터 다 능성 줄기 세포의 직접 유도와 유사하게, iTSCs 직접 분화 된 체세포 조직에서 변환되었다. 첫째, 우리는 MEFs에에서 과발현 때 TSC의 운명을 유도 (12) 후보 요인을 확인했다. 나중에, 요소 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2는 ITSC 유도 3 필요하고 충분한 것으로 확인되었다. 동시에, 다른 그룹은 독립적으로 iTSCs에 MEFs에 변환 할 충분한 것으로 Tfap2c, GATA3 및 Eomes를 발견했다. 그러나,에 그연구는 유전자 발현을 위해 필요한 시간이 상당히 길어 Ets2는 분화 칵테일 4에없는 경우에는, 다른 전환 반응 속도를 나타내는 연구와 비교된다.

유도 배반포 영양막 유래 줄기 세포의 배양을 포함하는 종래의 소 태아 혈청....

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프로토콜

모든 마우스 실험 동물의 보호와 지역 기관 동물 관리위원회 (Landesamt FUER 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, 노르 트라 인베스트 팔렌 [승인 ID 번호의 승인을 계약의 독일 법에 따라 수행 하였다 : 84-02.04.2013 AZ .A428).

1. 미디어 준비

  1. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을 피루브산 나트륨 (1 mM)을 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) 293T 매체를 준비한다.
  2. DMEM, 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을, 1X 비 필수 아미노산, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) MEF 매체를 준비한다.
  3. TS 매체를 준비 (w / FGF4 / 헤파린 O) : 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 1640, 20 % (v / v)의 FBS (줄기 세포 배양 등급), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배), L- 글루타민 (2 mM의 b), 나트륨 피루 베이트 (1 mM)을 2- 메르 캅토 에탄올 (0.1 mm)이다.
  4. 줄기 세포 (RPMI 1640, 20 % (V / V) FBS : FGF4 / 헤파린 (TS + F4H)....

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결과

4 층의 유전자 발현이 활성화 접시에서 세포를 신속하게 형태를 (그림 2A와 B를 비교)로 변경합니다. 하루의 주위에 14-21 별개의 transdifferentiated 영역 (두 가지 예는 그림 2B와 C에 나와있다) 등장. 이 차의 식민지는 전형적인 TSC 형태 부족; 그러나 그들은 단단한 가장자리와 선의의 TSC의 매우 연상시키는 밝은 경계 계대 배양, 특성 상피 형태 나타난다 (그림 2D) 일단. 영양막 세포의 전사에 대한 긍정적 인 4F-iTSCs 얼룩은 CDX2와 Tfap2c (그림 2E)을 요인. 이러한 ITSC 라인은 현재 시험 관내 또는 생체 내 분석에 대한 후속 즉 체외 분화 검정 또는 태반 키메라 실험에 사용될 수있다.

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토론

여기에 제시된 4 인자 (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 기반으로 분화 프로토콜은 충실하게 생성 마우스 배아 섬유 아세포에서 iTSCs을 변환 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 또한, 상기 방법은 비록 배아 섬유 아세포 (3)에 비해 효율의 저하로도 산후 테일 섬유 아세포에 적용된다. 일반적으로, 기본 섬유 아세포의 분화 품질 결과 및 치료의 중요한 요소가 초기 통로 세포 (통로 3-2)를 사용하여 수행되어야한다.

이 프로토콜의 강도는 유전자 발현의 시간 제어를 허용 독시사이클린 - 유도 성 벡터를 사용하는 것이다. 이는 유전자 발현 독립적 TSC 운명을 유지 내생 전사 인자를 활성화 네트워크 안정 ITSC 라인의 생성을 가능하게한다. 이것은 줄기 세포의 운명 TSC의 유도를 설명하기 이전에 발행 프로토콜 대조적이다 방법 그쪽현재까지 t은 불완전 재 프로그램 영양막 세포의 줄기 세포 유사 세포 (1)를 산출.......

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
독시사이클린 하이클레이트시그마-알드리치D9891-10G멸균 PBS에 용해시키고 2mg/ml 원액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. C
클로로퀸 디포스페이트 염 Sigma-AldrichC6628-25G멸균 세포 배양 등급의 물에 25mM 원액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. C
폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)시그마-알드리치107689-10G멸균 세포 배양 등급의 물에 8mg/ml 원액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. C
인간 재조합 섬유 아세포 성장 인자 4ReliaTech300-131LPBS의 멸균 0.1 % BSA에 용해하고 25 µ를 준비하십시오. g/ml 원액. 부분 표본을 -80 °에 저장하십시오. C
헤파린 나트륨 염Sigma-AldrichH3149-10KU멸균 PBS에 용해하여 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부분 표본은 -80°C에 저장하십시오. C
ProFection Mammalian Transfection SystemPromegaE1200
PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음ThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640, 글루타민 없음ThermoFisher Scientific31870-025
Advanced DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드ThermoFisher Scientific25300-054
폴리-L-라이신시그마-알드리치P4707
소 태아 혈청HycloneSH30071.03IR
계면활성제 무함유 셀룰로오스 아세테이트-멤브레인 필터Corning431220
비필수 아미노산ThermoFisher Scientific11140-035
페니실린 스트렙토마이신ThermoFisher Scientific15140-122
나트륨 피루베이트;ThermoFisher Scientific11360-039
L-글루타민 ThermoFisher Scientific25030-24
2-메르캅토에탄올ThermoFisher Scientific31350-010
디메틸설폭사이드(DMSO), 세포 배양 등급Panreac AppliChem GmbHA3672,0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-Gata3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA Addgene19780
생쥐 B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7JAX 마우스6965
129S2SV찰스 리버129

참고문헌

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....

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재인쇄 및 허가

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태그

Tfap2c Gata3 Eomes Ets2L293 T

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