Summary
A rigidez arterial representa um factor essencial na velocidade de onda de pulso e doença cardiovascular (PWV) pode ser considerado como um substituto para o índice de rigidez arterial. Este protocolo descreve um algoritmo de processamento de imagem para calcular a VOP em camundongos com base em processamento de imagem de ultra-som que é aplicável em locais arteriais diferentes.
Abstract
A rigidez arterial pode ser avaliada por meio do cálculo da velocidade da onda de pulso (PWV), isto é, a velocidade com a qual a onda de pulso viaja num vaso de conduto. Este parâmetro está a ser cada vez mais pequenas investigado em modelos de roedores em que é utilizada para avaliar alterações na função vascular relacionada com determinados tratamentos genótipos / ou para caracterizar a progressão da doença cardiovascular. Este protocolo descreve um algoritmo de processamento de imagem que leva a não-invasiva de medição VOP arterial em ratos usando apenas as imagens de ultra-sons (US). A técnica proposta tem sido utilizado para avaliar a VOP aorta abdominal em ratinhos e avaliar suas alterações associadas com a idade.
aorta abdominal exames de US são obtidos a partir de ratos sob anestesia gasosa utilizando um dispositivo específico US equipados com sondas norte-americanas de alta frequência. B-mode e as imagens de pulso-Wave Doppler (PW-Doppler) são analisados a fim de obter diâmetro e significa valores instantâneos de velocidade, respectivamente. Para este propósito, as técnicas de detecção de borda e de seguimento de contorno são utilizados. O único batimento diâmetro médio e são formas de onda de velocidade vez alinhados e combinada, a fim de alcançar o diâmetro da velocidade (lnD-V) loop. PWV valores são obtidos a partir do declive da parte linear do circuito, que corresponde à fase sistólica no início.
Com a presente abordagem, anatômica e funcional informações sobre o mouse aorta abdominal pode ser alcançado de forma não invasiva. Exigindo o processamento de imagens dos EUA só, pode representar uma ferramenta útil para a caracterização não-invasivo de diferentes locais arteriais no rato em termos de propriedades elásticas. A aplicação da presente técnica pode facilmente ser estendido a outras regiões vasculares, tais como a artéria carótida, proporcionando assim a possibilidade de obter uma avaliação da rigidez arterial multi-local.
Introduction
Modelos de ratinho são cada vez mais utilizados para a investigação de doenças cardiovasculares (CVD) e particularmente utilizado em estudos longitudinais que permitem a caracterização de diferentes fases do desenvolvimento da doença 1. propriedades elásticas das grandes artérias estão relacionados com diferentes condições patológicas; a partir de um ponto de vista técnico, a rigidez arterial pode ser avaliada por medição da velocidade de onda de pulso (PWV), que representa a velocidade com a qual a onda de pulso viaja num vaso de conduta 2. Por causa de seu significado clínico, é cada vez mais medida mesmo em pré-clínicos pequenos modelos animais 3.
Diferentes técnicas estão disponíveis para avaliar a VOP em camundongos. abordagens invasivos baseiam-se na utilização de transdutores de pressão de ponta de cateter. VOP é avaliada através da aquisição de sinais de pressão arterial em dois locais diferentes e dividindo a distância entre os dois s mediçãoites pelo desvio de tempo entre os sinais 4. A principal desvantagem relacionada com estes tipos de técnicas é que eles exigem o sacrifício de animais para a avaliação da distância entre os dois locais de medição e, assim, não pode ser utilizado em estudos longitudinais. Para superar esta limitação, abordagens não invasivas, com base em técnicas de imagem diferentes, têm sido desenvolvidos. Estudos anteriores relataram avaliações VOP em camundongos obtidos por aplicação do método de tempo de trânsito em dados de ressonância magnética codificada em velocidade 5 e sinais pulsados-Doppler 6. No entanto, o valor VOP obtida com estes métodos é uma avaliação regional da rigidez arterial. Na verdade, ela representa um valor médio, o que representa artérias diferentes em termos de tamanho e propriedades elásticas. Além disso, estes tipos de avaliações requerem a avaliação da distância entre os dois locais de medição que é uma fonte de erro que pode influence o resultado final.
VOP pode ser avaliada utilizando o diâmetro-velocidade (lnD-V) ciclo 7. Este método baseia-se na avaliação simultânea de valores de diâmetro e velocidade de fluxo num recipiente seleccionado. De acordo com esta abordagem, o loop lnD-V é obtido traçando os valores de logaritmos naturais de diâmetro contra os valores médios de velocidade e VOP é estimado por cálculo da inclinação da parte linear do loop obtido correspondente à fase sistólica no início. No que diz respeito à aplicação prática deste método, trabalhos anteriores já relataram resultados sobre a sua aplicação em um set-up sistema in vitro 7 e seu uso para a avaliação de ambos carótida e VOP femoral em humanos 8.
O principal objetivo do presente estudo é fornecer uma descrição detalhada de um algoritmo de processamento de imagem que fornece uma medida da VOP arterial não invasiva em ratos usando Uapenas imagens S. A abordagem proposta permite a avaliação da rigidez arterial local por meio do processamento de tanto em modo-B e pulsada-Doppler (PW-Doppler) e as imagens podem ser aplicados em artérias de grande importância, tal como a aorta abdominal.
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Protocol
Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva Europeia (2010/63 / UE) e da lei italiana (D.Lvo 26/2014), e seguiu os princípios de cuidados com animais de laboratório. O Painel de aprovação ética local aprovou o estudo.
1. Processo de imagem
- Colocar o rato numa câmara de indução de anestesia cheio com 2,5% de isoflurano em 1 L / min de oxigénio puro. Verifique a profundidade da anestesia por falta de resposta a pitada dedo do pé.
- Colocar o animal em uma placa de temperatura controlada em posição supina. Umedeça os olhos do animal com colírio, para evitá-los secando. Fornecer fluxo de gás anestésico (isoflurano a 1,5%), colocando o nariz do rato no cone do nariz dedicado. Se necessário, ajustar a percentagem de isoflurano de caso para caso, dependendo do animal em estudo. Fixar a temperatura da placa a 40 ° C.
- Brasão os quatro membros do animal com pasta condutora e gravá-los sobre os eletrodos de ECG embutidos noborda. Medir a temperatura corporal com uma sonda rectal lubrificada com vaselina. Verifique se todas as medições fisiológicas (ECG e sinal de respiração, bem como de temperatura) estão correctamente adquirido e exibido.
- Remova o cabelo quimicamente a partir do abdômen com creme depilatório e bata-a com gel de acoplamento acústico.
- Coloque o (13-24 MHz) sonda norte-americana no braço mecânico.
- Fixar os EUA sonda paralela ao animal e ajustar a sua posição, a fim de obter imagens longitudinais de aorta abdominal com a região de interesse localizado na zona focal.
- Coletar informações anatômicas.
- Clique no botão permitindo que a alta taxa de quadros de aquisição 9 ECG-fechado, escolha uma aquisição de taxa de quadros igual a 700 fps e começar a aquisição. Nota: Neste modo imagens anatómicas do vaso relacionado a um único ciclo cardíaco possa ser adquirido.
- Coletar informações de velocidade de fluxo. </ Strong>
- Usando a mesma projeção de digitalização, clique no botão PW-Doppler, coloque o volume da amostra no centro do navio e adquirir imagens, garantindo que o loop de cine não é inferior a 3 s. Obter estes dados, mantendo a correção do ângulo tão pequeno quanto possível, ajustando-o de caso para caso em função da projeção US obtido.
- Remover o animal da placa de temperatura controlada e esperar para a recuperação completa.
NOTA: Em nossa experiência isso leva cerca de 10 min. Não deixe e animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
2. Pós-Processamento
- B-mode exportação e imagens PW-Doppler como arquivos DICOM e salvá-los em um computador pessoal. Transformar arquivos PW-Doppler DICOM para imagens .tiff.
- Imagens no modo B processo.
- Importar o arquivo DICOM correspondente usando a interface gráfica do usuário dedicado (GUI).
- Para inicializar contornos, desenhe uma linha perto da parede do fundo do navio (clique único para iniciá-lo e clique duas vezes para acabar com ela) e clique duas vezes perto da parede perto. Uma linha paralela à que perto da parede distante aparecerá automaticamente. Aplicar o algoritmo sobre um único quadro, premindo o botão "ANALISE".
- Verifique o resultado. Se as bordas foram identificados corretamente (ie., A evolução dos pontos inicializados detectaram tanto o posterior e da parede anterior), aplicar o algoritmo em geral cine-circuito clicando no botão "Go". Se as bordas não estão correctamente identificados, limpá-las clicando em "Limpar Contour" e inicializar novamente pelo ponto 2.2.2 repetir.
NOTA: O algoritmo é baseado na detecção de borda e de contorno e técnicas de rastreio foi previamente descrito em pormenor 10. - Obter o resultado final, pressionando o botão "RECORD" e salvar o corrm resposta .mat ficheiro que contém os valores instantâneos de diâmetro relacionadas com um único ciclo cardíaco.
- Abra a GUI para a execução de loop lnD-V.
- Clique no botão "velocidade", a fim de iniciar o processamento de imagem PW-Doppler o que leva a um único batimento significa curva de velocidade.
- Identificar o traço PW-Doppler e localize a linha que corresponde a um valor de velocidade igual a zero, premindo o botão "LINHA BRANCA".
- Executar a calibração de velocidade e calibração tempo usando a "velocidade" e botões de "tempo" (no painel Calibração), respectivamente. Pressionando esses botões permite desenhar uma linha cujo comprimento corresponde ao fator de calibração inserido.
- seleccionar manualmente um ROI contendo os sinais fisiológicos utilizando o botão "ROI PHYSIO".
- seleccionar manualmente um ROI contendo o traço PW-Doppler, premindo o botão "ROI SINAL".
- click no botão "ANALISAR" e verifique se o envelope for identificado. Se o resultado não for satisfatório, alterar o limite (digitando o novo valor no campo de texto "Velocity Threshold" editável) e pressione o botão "ANALISAR" novamente. Sintonize o limiar de caso para caso, dependendo da qualidade das imagens. Pressione o botão "elaboração".
- Localize-R picos do sinal de ECG e dividir o sinal de velocidade envelope em conformidade clicando no botão "Update". Escolha batidas que não estão corrompidos pelo ruído ou localizados na fase de inspiração, clicando no botão "Escolher BEATS". Desta forma, se obter um único batimento dizer onda de velocidade.
- Use o Fast Fourier Transform método para interpolar as batidas selecionadas no domínio da frequência e torná-los todos composta pelo mesmo número de pontos, conforme detalhado na referência 11. Executar esta operação automaticamente, simplesmente pressionando o retchave de urna no teclado do PC uma vez que as batidas foram selecionados. Se a opção "velocidade média" está marcada a única batida significa sinal de velocidade é alcançada dividindo a curva de velocidade máxima por dois, levantando a hipótese de um perfil de velocidade parabólico 12. Pressione o botão "OK".
- Clique no botão "de diâmetro". Interpolar a forma de onda diâmetro batimento única no domínio do tempo, a fim de obter um sinal de batimento diâmetro único com a mesma frequência de amostra, tal como o sinal de velocidade-batida única premindo o botão "interpoladas". Clique no botão "OK".
NOTA: Para ter o diâmetro-beat única e significa curvas de velocidade com a mesma freqüência de amostragem e o mesmo número de pontos de dados, eles são interpoladas no domínio da frequência. - Escolha a abordagem "Second derivado" como o método de alinhamento (acima do gráfico que indica as formas de onda de diâmetro e velocidade) e clique no Butto "UPDATE"n. As duas curvas serão automaticamente usando o segundo método derivado 14-alinhados tempo.
- Construir o ciclo final, lnD-V traçando o logaritmo natural dos valores de diâmetro-beat única contra o single-beat valores médios de velocidade. Isso é feito automaticamente quando as duas formas de onda são alinhados. Nota: Os pontos compreendidos entre os 5% e os 90% do valor máximo do único batimento significa curva de velocidade são automaticamente localizado e uma interpolação linear sobre estes pontos é aplicado para avaliar a inclinação da parte linear do loop.
- Calcular VOP de acordo com a seguinte equação 7
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Representative Results
A abordagem proposta foi aplicada a ratos aorta abdominal em um estudo anterior 11. As figuras seguintes mostram os resultados da aplicação da abordagem descrita em imagens reais ratos. Estes dados são a partir de um único animal (ratinhos de tipo selvagem, 13 semanas de idade, estirpe: C57BL6, peso: 33 g) Em particular, a Figura 1 representa o resultado da análise das imagens dos EUA. técnicas de detecção de borda e de rastreamento do contorno aplicados a imagens em modo B adquiridos com a alta taxa de quadros ECG-gated modalidade de fornecer a forma de onda de diâmetro; Por outro lado, a identificação do sinal de envelope PW-Doppler leva a um único batimento significa a avaliação da curva de velocidade. A avaliação do único batimento significa formas de onda de velocidade inclui a média dos dados dos diferentes ciclos cardíacos. Para os dados mostrados, o desvio padrão das curvas de velocidade (calculado como a média do desvio padrão obtidos acada ponto de tempo) é 0,0137 m / s.
-Beat único de diâmetro e significam formas de onda de velocidade são interpolados, tanto no domínio da frequência e tempo e, em seguida, o tempo alinhadas (Figura 2A). O loop lnD-V é obtida locando os valores de diâmetro logaritmo natural contra as medições de velocidade média, como mostrado na Figura 2B. VOP é avaliada pelo cálculo da inclinação da parte linear do ciclo, que é conhecido por corresponder à fase sistólica no início. Esta porção é automaticamente identificada como a que corresponde à curva ascendente da curva de velocidade média. Estes valores indicam que as operações de processamento de imagem necessários para a implementação da técnica proposta leva a um loop definitiva lnD-V que é semelhante ao obtido em humanos utilizando uma abordagem semelhante 7. Isto sugere que esta técnica pode representar uma alternativa válida para a avaliação da VOP não-invasivo em camundongos.
Figura 1: Processamento de B-mode e PW-Doppler Images. Imagens modo B (A) são processados usando técnicas de detecção de borda e de rastreamento de contorno. Imagens PW-Doppler (b) são processados para a identificação do sinal de envelope a partir do qual o único batimento quer dizer onda de velocidade é obtido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Implementação de lnD-V Circuito de Cálculo VOP. Diâmetro e significam formas de onda de velocidade obtidos a partir de B-mode e processamento de imagem PW-Doppler. (A). O loop lnD-V é obtida locando as logari naturaisTHM dos valores dos diâmetros contra os valores médios de velocidade de (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, um algoritmo de processamento de imagem com base no ciclo lnD-V para a avaliação VOP em ratinhos foi descrita em detalhe. A abordagem proposta baseia-se no processamento de imagens dos EUA só e, por isso, poderia representar uma alternativa válida às técnicas existentes 6, 13, para a avaliação da rigidez arterial em modelos de ratos. Na verdade, ao contrário de métodos invasivos 6, que são baseados na aquisição de sinais de pressão intra-arteriais e requerem que o animal ser sacrificado, esta técnica é completamente não-invasiva e, deste modo, pode ser particularmente apropriado no caso de estudos longitudinais. Além disso, ele fornece uma avaliação da rigidez arterial, que é local e não regional. Embora o método proposto é conhecido por ser influenciado pela onda refletida 15, pode fornecer uma avaliação mais precisa da VOP com respeito a outras abordagens baseadas nos Estados Unidos para PW locaisAvaliação de V, como as baseadas na técnica de área de fluxo 13, que exige a aquisição de dados de cor na projecção de fluxo de corte transversal. O valor VOP mostrado na secção "Resultados representativos", igual a 1,69 m / seg, está de acordo com o que é relatado na referência 11: de facto, neste estudo, abdominal VOP aorta foi igual a 1,91 ± 0,44 m / seg em ratinhos adultos e 2,71 ± 0,63 m / seg em animais idosos.
A fim de minimizar os erros nas avaliações de VOP, grande atenção tem de ser pago na aquisição de imagens dos EUA. Em particular, as imagens de modo B deve ser adquirida com paredes anterior e posterior muito claras, a fim de alcançar uma curva de diâmetro que não é corrompido por ruído. No que diz respeito às imagens PW-Doppler, a correcção de ângulo deve ser minimizado. O valor de 60 graus pode representar, na maioria dos casos, um bom compromisso entre uma boa vista eixo longo e uma boa aproximação das componentes de velocidade. Furthermore, no caso de estudos longitudinais com medições repetidas, o cuidado deve ser tomado em imagiologia do navio da mesma forma, ou seja, com a mesma projeção de digitalização.
A principal limitação da abordagem apresentada refere-se ao fato de que as imagens requeridas para o diâmetro e significam avaliações onda de velocidade não são adquiridos em simultâneo. Esta falta de simultaneidade pode representar uma fonte de erro para a avaliação VOP e fazer a medição menos preciso. Além disso, a aquisição simultânea real seria garantir um alinhamento melhor tempo entre as duas curvas e evitar problemas relacionados com a variabilidade da frequência cardíaca. De um ponto de vista prático, outra limitação poderia ser a falta de disponibilidade da modalidade alta taxa de quadros ECG-fechado. Este problema pode ser parcialmente ultrapassada através da aquisição de imagens de modo-B modalidade e ajustando os parâmetros de aquisição, a fim de alcançar a mais alta resolução temporal. Neste caso, o sinal de diâmetro deveser dividido pela base do ECG e processados da mesma maneira que o sinal de velocidade, a fim de se obter uma única forma de onda diâmetro batida. No entanto, em algumas condições, a resolução temporal será obtida não ser apropriado para atingir um diâmetro de sinal válida. modificações futuras da cadeia de processamento de imagem destinada para superar essas limitações iria melhorar a técnica e conduzir a uma avaliação mais precisa da rigidez arterial local.
futuras aplicações da abordagem apresentada diria respeito outros distritos arteriais. Com efeito, graças ao fato de que ele exige a aquisição de modo-B e apenas imagens PW-Doppler, este método pode ser facilmente aplicado a outros sítios arteriais, tais como a artéria carótida, fornecendo assim uma avaliação da rigidez arterial multi-local. Uma sonda de frequência mais elevada deve ser escolhido para artérias mais superficiais, como a carótida comum; Em qualquer caso, a escolha da sonda deve assegurar a correcta visualização da artéria para tele os animais no estudo. Em conclusão, o sistema descrito pode oferecer uma maneira simples de avaliar propriedades funcionais de diferentes artérias em modelos de ratos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
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