방법 논문

"Phagosome 폐쇄 분석은"사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

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⸱

DOI:

10.3791/54470

⸱

2016년 8월 26일

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

이 논문에서

요약

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할

수 있습니다.

초록

Phagocytosis는 미생물이나 세포 파편을 내재화하고 제거하기 위해 특수 세포가 사용하는 메커니즘입니다. 그것은 입자 주위의 원형질막 확장의 원동력인 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 심오한 재배열에 의존합니다. 또한, 큰 물질의 효율적인 삼킴은 세포 내 구획의 국소 외세포작용에 의존합니다. 이 과정은 매우 역동적이며 수많은 분자 플레이어가 식세포컵 형성 중에 역할을 하는 것으로 설명되었습니다. 그러나 이러한 모든 분자의 시공간 내 정확한 조절은 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, phagosome closure의 마지막 단계는 RNA 간섭 또는 우성 음성 돌연변이에 의한 억제가 종종 phagocytic cup 형성을 지연시키기 때문에 관찰하기가 매우 어려웠습니다.

우리는 전반사 형광 현미경(TIRFM)과 에피형광을 사용하여 커버슬립에 느슨하게 결합된 입자 주위에서 자라는 식체에서 유사 포드의 확장과 그 끝을 단계별로 모니터링하기 위한 전용 실험 접근 방식을 설정했습니다. 이 방법을 사용하면 두 개의 서로 다른 형광 태그가 지정된 단백질에 대해 살아있는 세포에서 식체가 닫히는 동안 pseudopods의 끝과 융합을 고해상도로 관찰할 수 있습니다.

서론

식균 작용은 인식을하고 섭취 재료의 국제화 및 저하로 연결하는 수용체를 표면 재료의 결합을 시작하는 중요한 세포 기능이다. 이러한 금형 Dictyostelium의 discoideum 및 아메바 같은 단세포 진핵 생물은 박테리아에 공급하는 식균 작용을 사용하는 반면, 고등 생물 전문 세포로 진화했다. 대 식세포 또는 수지상 세포는 다양한 조직과 기관의 병원균에 대한 방어의 첫 번째 라인이며, 항원 제시 및 사이토 카인 생산 1-4을 통해 적응 면역 체계를 활성화 할 중요하다. 특정 상황에서 식균 작용은 비전문가 탐식 세포, 예컨대, 내피 세포 및 상피 세포에 의해 수행 될 수있다. 이 과정은 개발 과정과 정상 조직의 매출과 리모델링에 대한 성인의 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 이러한 고환 또는 망막의 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 같은 마지막으로, 전문 식세포색소 상피 세포는 매우 강력한 식세포 5입니다.

phagosome의 형성은 어디 미생물이나 세포 파편의 저하는 탐식 세포의 표면에 식세포 수용체의 클러스터링 시작을 발생합니다. 이러한 Fc 수용체 FCR () 또는 보완 수용체 (CR을) 등의 옵 소닌 수용체의 클러스터링을 다음과 같은 다운 스트림 신호 이벤트가 아니라 특징으로하고있다. 그러나, 수신자 같은 수용체 (TLR에), 렉틴, 만노스 수용체와 스 캐빈 저 수용체 등 다양한 비 옵 소닌 수용체도 있습니다. 이들 수용체는 만노스 또는 푸 코스 잔기, 포스파티딜 세린, 및 리포 폴리 사카 라이드 1,6-9로서 입자 표면에 결정을 인식한다.

병원체 또는 세포 파편 인식에 다음 강렬하고 과도 굴지 리모델링으로 이어질 식세포 수용체의 여러 종류의 클러스터링 바인딩을 포함한다. 세포 내 compartmen의 병렬, 초점 세포 외 유출에TS는 막 긴장의 방출에 기여하고, 큰 입자의 효과적인 식세포 작용에 중요하다. 액틴 중합 막 변형을 유도하는 신호 이벤트는 하나의 식세포 수용체를 유발 실험 모델에서 해부했다. FcRγ 쇄 매개 식균 작용하는 동안, 작은 GTP 아제 (RAC, Cdc42)에 의해 조절된다 강렬한 액틴의 중합이있다. 자신의 다운 스트림 이펙터 중, 비스 코트 - 올드리치 증후군 단백질 (WASP)은 액틴 필라멘트 1,2,4,10를 핵이 액틴 관련 단백질 복합체 2/3 (Arp2 / 3)의 활성화로 연결됩니다. 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P (2))의 로컬 생산 pseudopod 형성 초기 구동 액틴 중합 중요하다. PI (3,4,5) P (3) 그 변환은 pseudopod 확장 및 phagosome 폐쇄 (11)가 필요합니다. 여러 경로는 PI (4,5) P (2)의 실종에 기여한다. 포스파티딜 이노시톨 인산염 키나의 첫째 분리phagosome 체포의 PI (4,5) P (2) 합성에서 SES (PIPKIs). 둘째, 인산화 될 수 있고, 내가 키나제 (PI3K)를 PI3K 클래스에 의해 소비 PI (3,4,5) P (3) (12)에 변환됩니다. 포스와 포스 포에 대한 역할은 포유 동물 세포 및 Dictyostelium (13, 14)에 식균 작용 동안 PI (4,5) P (2) 가수 분해 및 F - 굴지 제거 암시하고있다. 포스 포 리파제 C (PLC) δ는 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 1,4,5- 트리스 포스페이트에 PI (4,5) P (2)를 가수 분해한다. 된 PI (4,5) P (2)와 PI (3,4,5) P (3) 인산 OCRL은 (로우의 로우 증후군)도 phagosome 형성에 관여하고있다. F - 굴지 및 해중합의 정확한 지역의 형성이 밀접하게 공간과 시간에 규제되고 우리가 세포 내 구획의 모집을 보인 것은 따라서 식세포 컵의 바닥에 지역 굴지의 해중합에 기여하고, 로컬 OCRL 포스 파타 아제를 제공하는 것이 중요하다 13, 15. 이를 위해, 우리는 여기에 설명 된 실험 셋업을 사용 하였다.

phagosome 폐쇄 및 막 절단에 필요한기구 및 분자 선수는 가난 때문에 시각화 및 phagosome 폐쇄의 사이트를 모니터링의 어려움 정의 된 상태로 유지됩니다. 최근까지, 식균 작용은 어려운 phagosome 폐쇄의 사이트의 적시 시각화하고, 자신의 등쪽면에 또는면에 입자를 내면화 고정 또는 살아있는 세포에서 관찰되었다. 또한, 고정 방법은 세포막과 바이어스 pseudopodia 확장 및 폐쇄에 결과의 철회의 원인이 될 수 있습니다. 대조적으로, 우리가 설정하고 여기에 기술 한 분석은 우리가 pseudopod 확장 및 총 내부 반사 현미경 (TIRFM) (16)에 기초하여 살아있는 세포 (13)의 탐식의 폐쇄 단계를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 광학 투명의 계면에 얇은 영역에서 형광체를 여기하기 위해 소멸 파를 사용하므로뚜껑 (커버 슬립) 및 액체 (세포 배양 배지). 여진 깊이의 두께는 세포막에 가까운 분자 이벤트의 시각화를 허용 고체 표면에서 약 100 ㎚이다. TIRFM 높은 신호 대 바탕 비율을 허용 의한 세포의 조명에 수집 포커스 아웃 형광 세포 독성을 제한한다.

TIRFM을 활용, 우리는 커버 슬립이의 IgG-옵 소닌 적혈구 (IgG를-SRBCs)로 코팅 한 후 폴리 리신으로 활성화되는 "phagosome 폐쇄 분석"을 개발했다. 관심 일시적으로 찬란 태그 단백질을 발현하는 대 식세포는 다음의 IgG-SRBCs을 삼켜 할 수 있습니다. 세포 비공유 유리 표면에 바인딩 대상 입자를 분리하는 동안, pseudopods의 선단 관찰하고 TIRF 모드에서 기록 될 수있다. TIRF 인수는 마주 할 수있는 위의 3 단계 μm의를 이동 한 후, 표면 형광 모드에서 인수와 결합탐식 컵베이스의 ualization. 이러한 과정 액틴 또는 dynamin 억제 것과 약리학 약물의 첨가는 상기 분자 수준의 처리를 절개하는 것이 가능하다.

여기에 상세히 설명 된 프로토콜은 RAW264.7 쥐의 대식 세포주 및 옵 소닌 입자이지만, 사실상, 이것은 다른 포식 세포와 같은 비드와 같은 다른 표적에 적용될 수있다. 이 방법은 시간과 다양한 식세포 과정에서 pseudopod 확장 및 phagosome 폐쇄에 관여하는 분자 선수의 공간에서 규제의 더 나은 특성을 수 있습니다.

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프로토콜

참고 : Lifeact-mCherry 사용되는 플라스미드 (17) 후에 생성 박사 기욤 Montagnac, 연구소 퀴리, 파리, 일종의 선물이다.

1. 세포와 형질

참고 RAW264.7 식세포가 완전 배지에서 서브 컨 플루 (RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) 1640 배지, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올로 성장 2 mM의 글루타민 및 10 % FCS ( 100 밀리미터 접시에 소 태아 혈청)). 그들은 전기에 의해 찬란 태그 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질된다. 정기적으로 약 5 - 6 10 6 세포는 각각 각 형질 전환 또는 공동 형질 전환 용 플라스미드의 20 μg의 10 μg의 형질된다 X. 리포 펙션 또는 전기 천공에 기초하여 형질 전환의 다른 방법은 다른 방식으로 사용될 수 있습니다.

  1. 셀 리프터 세포를 긁어로 pipetting하여 여러 번 아래 배지 10ml에이를 재현 탁.
  2. 원심 분리기세포 현탁액 (300) XG, 스윙 각도 로터의 RT에서 5 분.
  3. 완전 배지의 데우고 10 ml를 37 ℃에서 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖로 보충.
  4. 원심 분리 후, 상층 액을 제거하고 전기 키트에서 "세척 버퍼 A"의 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
  5. 세포 현탁액 300 XG, 스윙 로터 각도에서 실온에서 5 분 동안 원심 분리기.
  6. 한편, 실온에서 DNA 믹스를 조제 : 120 μL 배 완충액 B를, 관심있는 단백질 QSP 240 μL의 H 2 O를위한 플라스미드 DNA 코딩의 20 μg의
  7. 원심 분리 후, 전체 상층 액을 버린다.
  8. DNA의 혼합물에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 4mm 전기 천공 큐벳으로 옮긴다.
  9. 3 분 동안 실온에서 품어.
  10. 250 V, 900 μF에서 Electroporate.
  11. 즉시 겐타 마이신으로 보충 된 상기 예열 (37 ° C) 세포를 완전 배지 재현 탁하고 판형100 밀리미터 접시에 m.
  12. 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2의 형질 감염된 세포를 품어.
  13. 다음날 아침, (페놀 레드없는 RPMI 1640, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올, 2 mM의 글루타민) 혈청 현미경 배지 10 mL로 완전 배지를 교체한다.

적혈구 2. 옵 소닌

주 : 대 식세포 입자 대상의 모델로서, 양 적혈구 (SRBCs)가 사용된다. 일반적으로 35mm 유리 바닥 접시 당 약 7 × 10 6 SRBCs이 사용됩니다.

  1. 1X PBS (인산염 완충 식염수) /0.1% BSA (소 혈청 알부민)와 원심 분리기 (600 XG, 4 분) 100 ㎕로 세척 SRBCs.
  2. 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 1X PBS 100 ㎕ / 0.1 % BSA와 원심 분리기 (600 XG, 4 분)에 SRBCs을 재현 탁.
  3. 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 토끼 IgG 형 SRBCs와 1X PBS에서 / 0.1 % BSA를 SRBCs를 재현 탁에서 농도를 서브 응집. SRBCs의 항체 / 5 μl를 함유 용액 500 μl를 사용합니다.
    주 : 항체의 서브 응집 농도 네트워크의 형성으로 검출 응집을 유도하지 않았다 최저 농도에 상응한다. 일반적으로, 서브 - 응집제의 농도는 8.2 ㎍ / mL로한다.
    1. 혈구 응집 시험에 의해 SRBCs을 opsonize하는 데 필요한 IgG 형 SRBCs의 농도를 결정합니다. 마이크로 1 / 25,600 - 직렬 1/50 사이 (13.1 ㎎ / ㎖에서 주) IgG 형 SRBCs을 희석. 각 웰에 2 × 10 6 SRBCs를 추가합니다. 몇 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 접시를 품어.
  4. 느린 회전 30 분 동안 실온에서 품어.
  5. 1X PBS에 두 세척 / 전술 한 바와 같이 0.1 % BSA 후 예열 현미경 무 혈청 배지에서의 IgG - 옵 소닌 SRBCs (IgG의-SRBCs) (2 ㎖ / 접시)를 재현 탁.

Coverslips는 3. 폴리 라이신 코팅

  1. 한편실온에서 30 분 동안 0.01 % 폴리 -L- 리신 2 ㎖로 35mm 유리 바닥 요리를 취급한다.
  2. 1X PBS 2 ㎖로 요리 두 번 씻으십시오.

유리 바닥 요리에 SRBCs 4. 비 공유 고정

  1. 35mm의 유리 바닥 접시 당 SRBCs 현탁액 2 ㎖를 붓고.
  2. 35mm의 유리 바닥 접시 위에 2 분 동안 500 XG에서 스윙 로터와 원심 분리기.
  3. 상층 액을 제거하고 1X PBS / 10 % BSA 2 ㎖로 한 번 씻는다.
  4. 접시 당 1X PBS / 10 % BSA 2 ㎖로 30 분 동안 입자를 부화.
  5. 1X PBS 2 ㎖로 요리 세 번 씻으십시오.
  6. 예열 된 (37 ℃) 무 혈청 현미경 배지 2 ㎖로 1X PBS 교체.

5. 탐식 TIRFM에 의해 가시화

  1. 현미경
    참고 TIRFM는 오일 액침 대물 (N 100X, NA1.49), CO (2)와 가열 챔버를 구비 한 현미경을 사용하여 수행하고, 두 노래1.5 배 렌즈와 결합 르 광자 검출 카메라 EMCCD (배가 전자 전하 결합 소자).
    1. TIRF 현미경 세션 전날, 현미경 스테이지의 균일 한 가열을 할 수 있도록 37 ºC에서 가열 실의 전원을 켭니다.
  2. 임계각 결정
    참고 ImageJ에 컬러 프로파일 소프트웨어 TIRF 이미지 스트림을 처리하기 위해 사용된다.
    1. 현미경 무 혈청 현미경 매체와 옵 소닌 SRBC를 포함하는 35mm의 유리 바닥 접시를 놓습니다.
    2. 세포를 긁어하고 추가하기 전에 매체를 재현 탁 - 접시에 (100 500 μl를).
    3. 현미경을 제어하고 491 nm의 및 / 또는 형광 태그 단백질을 발현하는 세포를 식별하는 561 nm의 레이저로 여기를 수행하기 위해 "라이브 취득"소프트웨어를 사용합니다.
    4. 찬란 태그 단백질을 발현하는 세포를 식별합니다.
    5. 필드의 중간에 배치하고 500 메신저 취득다른 각도와 하나의 여기 파장에서 연령, 0.01º (그림 2A)의 증가와 함께, 5 °까지 0 °에서 시작. 각도 자동 현미경 시스템에 의해 변경된다.
    6. 입사광이 완전히 유리 / 매체 인터페이스에 반영 될 수 있도록 임계각을 결정하고 소멸 파를 생성합니다. ImageJ에 색상 프로파일 러 소프트웨어를 사용하여, "파일"을 클릭하여 "열기"이미지 시퀀스를 열고 파일을 선택합니다.
    7. 균일 한 형광 (도 2B 옐로우 1)와 셀 직사각형 도구, ROI (region of interest)를 선택한다.
    8. 은 "Z 축 프로파일"플롯 (메뉴 "플롯 Z 축 프로필"드롭 다운 메뉴의 "콘텐츠"탭 "스택"을도 2b를 클릭하여 X 축에 대한 각도의 함수로 ROI 측정 형광 강도를 의미 빨간색 2).
      주 : 임계각은 MA 선도 각도형광의 급격한 감소 전에 ximum 형광.
    9. 예 2.00 (도 2C)과 같은 TIRF 신호를 획득하기 위해 현미경 세션 중 임계각보다 우수한 X 축에 대한 각도의 값을 사용한다.
  3. 취득
    1. 라이브 수집 소프트웨어를 사용하여 모듈 "프로토콜 편집기"(그림 3A)와 인수의 매개 변수를 설정합니다.
      1. TIRF 지역에 대한 관심의 단백질의 형광 신호를 획득하는 "멀티 채널"인수를 포함하는 "루프"와 프로토콜을 만듭니다. (예 : 2.00)을 TIRF 각도 (예 : 50 밀리 초에 대한) 노출 시간 (예 50 %) 레이저 강도 (그림 3B 1)를 입력합니다.
      2. 은 "멀티 채널"도구를 사용하여 표면 형광에서 신호 포착을 얻기 위해 TIRF 영역 위의 목적 3 ㎛의 "Z 이동"을 소개합니다. t 아래 각도를 입력그 임계각 (예 : 1.00)을, 폭발의 시간 (50 밀리 초) 레이저 강도 (50 %) (도 3b,도 2 및도 3).
      3. 다음은 TIRF 영역 (그림 3B 4)에서 반환, 아래의 목적 3 ㎛의 "Z 이동"을 추가합니다. (발광 다이오드) (그림 3B 5) LED 밝은 빛 셀의 "스냅 샷"을 추가합니다.
    2. 입자 주위에 세포막을 확장하여 SRBC의 식균 작용을 시작 형광 태그 단백질 발현의 중간 수준으로 관심의 세포를 찾아보십시오.
    3. 필드의 중간에 넣습니다.
    4. 1000 프레임 - 500의 인수를 스트리밍 시작합니다. 은 "루프 카운트"탭에서 "750 프레임"(그림 3B 1)를 입력합니다.
      참고 ImageJ에 컬러 프로파일 소프트웨어 TIRF 이미지 스트림을 처리하기 위해 사용된다.
    5. 클릭하여 이미지 J 소프트웨어의 시퀀스 이미지를 엽니 다, "열기", "파일"파일을 선택.
    6. 탭 "이미지"를 클릭하여 채널을 분리, "Hyperstacks은"메뉴 "스택 hyperstack하기"기능에 드롭 다운. 등장 창을 완료 : 주문 : xyctz을; 채널 (C) : 채널 번호 (예 : "2"두 개의 형광 색소가있는 경우); 조각 (z) : z 축 슬라이스의 수 (예 : "1"Z- 축에 아무런 움직임이없는 경우); 프레임 (t) : 채널 수에 따라 분할 이미​​지의 수; 디스플레이 모드 : 그레이 스케일.
      주 : 두 개의 별도의 이미지 시퀀스는 두 개의 서로 다른 채널에 대응하여 생성된다.

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결과

이 논문에 설명 된 실험 시스템은 개략적으로도 1에 표시된다. 형광 태그에 융합 관심의 단백질을 발현하는 트랜 RAW264.7 식세포는 비공유 수정 된 IgG를 - 옵 소닌 양 적혈구 (SRBCs)에 접촉 배치 커버 슬립에. 대 식세포는 그것을 삼켜하기 위해 커버 슬립에서 SRBC를 분리 할 수​​ 있습니다. 사용 TIRF 현미경이 3 μm 이상의 Z 시프트 후의 표면 형광 모드 pseudopods 및 신호의 선단에 대응하는 TIRF 영역으로부터 신호를 수반 취득 할 수있다.

이는도 2이 플라즈마 막 아래의 100 nm의 영역에서 깨끗한 TIRF 신호 보장에 기재된 3도. 전반사 형광 대한 임계각을 결정하는 것이 필수적이다 acquisiti의 발전을 나타낸다"프...

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토론

여기에 설명된 실험 프로토콜은 실시간으로 살아있는 세포에서 고해상도로 포작용의 형성, 특히 폐쇄를 따라갈 수 있는 전례 없는 방법을 제안합니다. 몇 가지 기술적 측면을 논의해야 합니다. 첫째, 분석은 온도에 매우 민감합니다. 식균 작용의 효율성을 손상시킬 수 있는 온도 변화를 피하기 위해 가열 챔버가 37°C에 있고 모든 배지, 장치 또는 세포가 챔버 내에 유지되는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 우리는 미묘한 온도 변화만으로도 식세포 형성을 방지하기에 충분하다는 것을 알아차렸습니다. 둘째, 여기에 설명된 프로토콜을 사용하면 실험 전반에 걸쳐 사용될 TIRF 각도를 정확하게 결정할 수 있습니다. 우리는 이것이 TIRF 실험을 수행할 때 상당한 이점을 구성하여 원형질막 근처의 사건에 대해 결론을 내릴 때 확신을 가질 수 있다고 믿습니다. 셋째, 일시적으로 형질감염된 세포로 작업할 때 관심 단백질의 발현 수준이 적당한 세포를 선택하는 것이 중요합니다. 게놈 편집 기술의 혁명으로 천연 수준에서 단백질을 발현하는 세포로 작업하는 것이...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

실험적 접근법에 대한 초기 논의를 해주신 Alexandre Benmerah 박사(프랑스 파리의 Institut Imagine Necker)와 원고를 읽어주신 Jamil Jubrail 박사에게 감사드립니다. Nadège Kambou와 Susanna Borreill은 우리 실험실에서 이 방법으로 실험을 수행한 것으로 인정받고 있습니다. 이 연구는 CNRS(ATIP 프로그램), Ville de Paris 및 Agence Nationale de la Recherche(2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale(FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 FMA 박사 펠로우십 포함)의 보조금, JM의 박사 펠로우십을 포함한 Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales"(ANRS)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티 양 적혈구 IgGMP Biomedicals55806
소 혈청 알부민 열 쇼크 분율, pH 7, ≥ 98% SigmaA7906
Cell lifterCorning3008
큐벳 4 mmCell projectEP104
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Thermo Fischer Scientific14190-094실온
전기버퍼 키트Cell projectEB110
100 mm TC 처리된 세포 배양 접시Corning353003
Gene X-cell pulserBiorad165-2661
겐타마이신 용액SigmaG1397
유리 바닥 접시 35mm 코팅되지 않은 1.5MatTek corporationP35G-1.5-14-C Case
iMICTILL PhotonicsOil-immersion objective (N 100X, NA1.49), CO2가 있는 가열 챔버, 카메라 단일 광자 검출 EMCCD(Electron Multiplying Charge Coupled Device) 및 1.5X 렌즈
Poly-L-Lysine 용액 0.1%SigmaP8920-100ml물에 0.01% 희석 
RPMI 1640 중간 GLUTAMAX  보충Life technologies61870-010
RPMI 1640 매체, 페놀 레드 없음 (10 x 500 ml)Life technologies11835-105Warm in 37 ° C 사용 전 수조
양 적혈구 (SRBC)EurobioDSGMTN00-0Q4 °에서 Alsever 버퍼에 보존; C 사용하기 전에

참고문헌

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