Summary
Avtalen gir en metode for å oppløse aerobic granulert slam for å trekke alginat-lignende ekstracellulære polymerer (ale).
Introduction
De siste årene har aerobic granulære slam (AGS) prosessen har blitt en populær biologisk rensing av avløpsvann prosess, med hell brukes på flere fullskala renseanlegg 1. I motsetning til den konvensjonelle aktiverte slamprosess, i AGS behandle de mikroorganismer som danner granuler i stedet for fnokker 2. Disse granulater har bedre settleability, er i stand til å tåle høyere organiske lasting priser, og har høyere toleranse for toksisitet enn aktivslam flocs 3.
I motsetning til biofilm, er AGS dannes spontant uten involvering av alle bærematerialet fire. I AGS, som i biofilmer, mikroorganismer produserer en betydelig mengde av sterkt hydratiserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5 for å danne en hydrogel matriks i hvilken de er selv immobilisert 4. - 6.. EPS er en kompleks blanding, som består av polysakkarider, proteiner, nukleinsyrer, (phospho) lipider, humus og noen inter polymerer 5,7,8. Disse polymere bestanddeler vekselvirker med hverandre gjennom elektrostatiske krefter, hydrogenbindinger, attraktive ioniske krefter og / eller biokjemiske reaksjoner, etc. 5, som danner en tett og kompakt tertiær nettstruktur. Polymerene i EPS som er i stand til å danne hydrogeler 4,9 og bidrar til dannelse av den tertiære nettstruktur er i denne henseende betraktes som strukturelle EPS, en delmengde av de totale EPS.
EPS er ansvarlig for den kjemiske struktur og fysikalske egenskaper av granuler 5. Det er derfor avgjørende å forstå funksjonen til hver EPS sammensatte. Ulike tilnærminger brukes til å trekke ut EPS 10-15. Men på grunn av sin ekstreme kompleksitet, er det nesten umulig å trekke ut alle EPS-komponentene ved en enkelt metode. Til dags dato er det ingen "one size fits all" metode for EPS utvinning. Valget av ekstraksjonsmetoden påvirker ikke bare den totale mengden, men også sammensetningen av den gjenopprettede polymerene 13,16 - 20. Avhengig av typen av slam og EPS av interesse forskjellige fremgangsmåter er påkrevd.
Ekstrahering av gel-dannende polymerer, som karakteriserer deres egenskaper og å undersøke deres interaksjon med hverandre og med ikke-geldannende EPS vil bidra til å avsløre rolle EPS i aerob granulert slamdannelse. Videre er de gel-dannende polymerer er også nyttige biopolymerer i industrielle anvendelser. En mulig anvendelse er allerede vist ved hjelp av gel-dannende polymerer fra AGS som et beleggmateriale for å øke motstandsdyktigheten overfor vann av papir 21.
Derfor blir ekstraksjonsmetoder, spesifikke for geldannende EPS nødvendig. Målet med denne studien er å utvikle en metode for å trekke gel-forming EPS fra AGS. Seks ekstraksjonsmetoder 10-15,22, som er ofte brukt i litteraturen, ble valgt for å ekstrahere EPS fra AGS. Den totale mengde og den geldannende egenskap av de ekstraherte EPS ble sammenlignet for hver metode.
Protocol
MERK: AGS ble samlet inn fra Nereda pilotreaktor ved renseanlegget Utrecht, Nederland. Reaktoren ble matet med kommunal kloakk. Det granulære slam hadde en slamvolumindeks (SVI 5 min) på 59,5 ml / g VSS. Slammet ble tatt prøver i april på slutten av en aerob syklus. Etter prøvetaking, ble slammet straks transporteres til laboratoriet, siktet og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
1. EPS Utvinning
MERK: Sentrifuger granulert slam ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min, og dekanter supernatanten. Samle granulater i pelleten for ekstraksjon. Det totale tørrstoffinnhold (TS) og flyktige faststoffer (VS) av granulene ble bestemt ved standard metoder 23. Omregningsfaktoren mellom granulen våtvekt - vekten av granulene tatt direkte fra pelleten - og TS ble bestemt før ekstraksjonen. Alle ekstraksjoner ble gjort i tre paralleller.
MERK: 3 g våt granules ble benyttet for hver utvinningsmetoden. Deres TS og VS verdier (0,39 g TS og 0,34 g VS), målt i tre paralleller, ble anvendt for å beregne ekstraksjonsutbyttet.
- Sentrifugering utvinning 11
- Transfer 3 g (våtvekt) av granuler inn i en sentrifuge rør og fylle opp sentrifugerøret til 50 ml med demineralisert vann.
- Litt riste sentrifugerøret for hånd.
- Sentrifuger sentrifugerøret inneholdende blanding ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Samle av væsken i en glassbeholder, forkaste pellet og fortsette med supernatanten som beskrevet i kapittel 1.7.
- Lydbehandling utvinning 10
- Transfer 3 g (våtvekt) av granuler inn i en sentrifuge rør og fylle opp sentrifugerøret til 50 ml med demineralisert vann.
- Anvende pulsede ultralydbehandling på is i 2,5 min ved 40 W til blandingen.
- Sentrifuger sentrifugeringrør inneholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Samle av væsken i en glassbeholder, forkaste pellet og fortsette med supernatanten som beskrevet i kapittel 1.7.
- Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ekstraksjon 11
- Transfer 3 g (våtvekt) av granuler inn i en 100 ml glassflaske og fylle opp flasken til 50 ml med 2% (w / v) EDTA-løsning.
- Litt riste flasken for hånd og lagre den i kjøleskap ved 4 ° C i 3 timer.
- Overfør blandingen til et 50 ml rør sentrifugering.
- Sentrifuger sentrifugerøret inneholdende blanding ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Samle av væsken i en glassbeholder, forkaste pellet og fortsette med supernatanten som beskrevet i kapittel 1.7.
- Formamid - natriumhydroksyd ekstraksjon (NaOH) 13
- Transfer 3 g (våtvekt) av granuler inn i en 100ml glassflaske og fylle opp flasken til 50 ml med demineralisert vann.
- Legg 0,3 ml 99% formamid.
- Litt riste flasken for hånd og lagre den i kjøleskap ved 4 ° C i 1 time.
- Tilsett 20 ml 1 M NaOH til granulat suspensjon.
- Litt riste flasken for hånd og lagre den i kjøleskap ved 4 ° C i 3 timer.
- Overfør blandingen jevnt inn i to 50 ml sentrifugering tube.
- Sentrifuger sentrifugeringsrør inneholdende blanding ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Samle av væsken i en glassbeholder, forkaste pellet og fortsette med supernatanten som beskrevet i kapittel 1.7.
- Formaldehyd - NaOH utvinning 11
- Transfer 3 g (våtvekt) av granuler inn i en 100 ml glassflaske og fylle opp flasken til 50 ml med demineralisert vann.
- Legg 0,3 ml 37% formaldehyd.
- Litt riste flasken for hånd og butikkden i kjøleskap ved 4 ° C i 1 time.
- Tilsett 20 ml 1 M NaOH til granulat suspensjon.
- Litt riste flasken for hånd og lagre den i kjøleskap ved 4 ° C i 3 timer.
- Overfør blandingen jevnt inn i to 50 ml sentrifugering tube.
- Sentrifuger sentrifugeringsrør inneholdende blanding ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Samle av væsken i en glassbeholder, forkaste pellet og fortsette med supernatanten som beskrevet i kapittel 1.7.
- Høy temperatur - natriumkarbonat utvinning (Na 2 CO 3) 9,22,24
- Forvarm 150 ml vann fra springen i et 1000 ml begerglass på en magnetrører til 80 ° C.
- Transfer 3 g (våtvekt) av granuler i en 250 ml kolbe med ledeplater og fylle opp kolben til 50 ml med demineralisert vann.
- Legg 0,25 g Na 2 CO 3 vannfri eller 0,67 g Na 2 CO 3 • 10H
- Sett kolbe inneholdende blandingen i vannbad. Dekk til kolben og begeret glass separat med aluminiumsfolie for å forhindre fordampning.
- Omrør blandingen i 35 minutter ved 400 rpm og 80 ° C.
- Overfør blandingen til et 50 ml rør sentrifugering.
- Sentrifuger sentrifugerøret inneholdende blanding ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Samle supernatanten og kast pellet.
- TS og VS måling av alle ekstrakter i henhold til standardmetoder 23.
- Ta supernatanten og dialyser det i 24 timer mot 1000 ml ultrarent vann (dialyse bag med 3500 Da molekylvekt avskåret (MWCO)) 11,12. Endre dialyse vann etter 12 timer for å forsterke effekten av dialyse.
- Overføre en rimelig fraksjon (omkring 1/3) av det dialyserte supernatant tilen aluminium fatet for TS og VS måling 23.
MERK: Tørk prøven over natten ved 105 ° C. Vektdifferansen av den tomme aluminiumskål og aluminiumskål som inneholdt den tørkede prøve er TS-innhold. Deretter brenne den samme aluminiumskål som inneholdt prøven ved 550 ° C i 2 timer. Vektforskjellen mellom det tomme aluminiumskål og aluminiumskål som inneholdt den brente prøve er askeinnholdet. Forskjellen mellom TS og askeinnhold er VS innhold. - For hvert ekstrakt, overføres den gjenværende fraksjon av den dialyserte supernatant til 10 ml begerglass. Tykkere supernatanten i 2 dager ved 60 ° C til et endelig volum på 1-2 ml for å øke polymerkonsentrasjonen i supernatanten.
2. Alginat-lignende ekstracellulær Polymer (ALE) Extraction
- Dialyser ekstraktet oppnådd i trinn 1.6.8 i henhold til trinn 1.7.1.
- Overfør det dialyserte ekstraktet inn i et 250 ml begerglass. Langsomly rør ekstraksjonen ved 100 rpm og værelsetemperatur. Kontinuerlig overvåke pH-endringer med en pH-elektrode, mens tilsetning av 1 M saltsyre (HCl) til en slutt-pH på 2,2 ± 0,05 for å oppnå ALE i den sure form.
- Etter justering av pH til 2,2, overføring av ekstraktet til et 50 ml rør sentrifugering og sentrifuger ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Kast supernatanten og samle den gellignende pellet. Den gel-lignende pellet er ALE i den sure form.
- For å oppnå den natrium (eller kalium) form av ALE Tilsett langsomt 0,5 M NaOH (eller 0,5 M kalium-hydroksyd) til gelen oppnådd i trinn 2.4, under blanding gelen langsomt med en glass stav for hånd inntil pH 8,5 er nådd.
3. Ionic Hydrogel formasjonstest
MERK: For å sjekke om de utpakkede EPS hadde ioniske hydrogel formasjonsegenskaper, en perle formasjonstest med Ca 2+ ioner ble brukt 25.
- Etter fortykning av ekstrakten i trinn 1.7.3 tilet volum på 1-2 ml, sakte røring av blandingen med en glass stav og justere pH til 8,5 med 0,5 M NaOH.
- Ta ekstrakt fra trinn 3,1 eller natrium ALE fra trinn 2.5 og langsomt dryppe av ekstrakten med en Pasteur-pipette inn i en 2,5% (vekt / volum) kalsiumklorid (CaCl2) oppløsning.
MERK: Hvis den utpakkede EPS har ionisk hydrogel gel dannende egenskaper, dråpeformet (sfæriske) perler vil bli dannet. Hvis det ekstraherte EPS ikke har noen ionisk hydrogel geldannende egenskaper, vil ekstrakten dispergere i CaCl2-løsning.
4. Stabilitet Test av Ionic Hydrogel
MERK: For ytterligere å forstå hvilken rolle den ioniske EPS hydrogel i AGS struktur formasjon, ble stabilitetstester utført på de ioniske hydrogel perler av Na 2 CO 3 utvinning, samlet i trinn 3.2.
- Hold hydrogel-kuler i 30 minutter i CaCl2-løsning.
- Bruk en skje til å ta ut hydrogel perler fra CaCl 2
- Lagres fraksjon 1 i 10 ml demineralisert vann i 4 timer ved 4 ° C.
De følgende stabilitetstester ble utført på samme måte som beskrevet i de ekstraksjonsmetoder 1.3 - 1.5. - Lagres fraksjon 2 i 10 ml 2% (w / v) EDTA-oppløsning i 3 timer ved 4 ° C.
- Lagres fraksjon 3 i 7,15 ml demineralisert vann sammen med 60 ul 99% formamid i 1 time ved 4 ° C. Deretter legger 2,85 ml 1 M NaOH og lagre brøkdel tre i 3 timer ved 4 ° C.
- Oppbevares brøkdel 4 i 7,15 ml demineralisert vann med 60 mL 37% formaldehyd i 1 time ved 4 ° C. Deretter legger 2,85 ml 1 M NaOH og butikken brøkdel 4 for 3 timer ved 4 ° C.
- Monitor hvis det er synlig nedbrytning av kulene under lagring under de betingelser som er beskrevet i 4.3 til 4.6 for å vurdere om perlene motstå ekstraksjonsbetingelsene.
Representative Results
EPS utvinning
Utseendet av granuler etter påføring av forskjellige EPS ekstraksjonsmetoder er vist i figur 1. Formen og gelstrukturen av granuler var intakte etter sentrifugering (figur 1a) og EDTA ekstraksjon (figur 1c). Kornene ble brutt opp fragmenter av forskjellige størrelser av lydbehandling. Turbiditeten i den flytende fase kan skyldes suspensjon av små fragmenter (figur 1b) som turbiditeten sterkt redusert etter sentrifugering. Formamide og formaldehyd alene ikke har noen innvirkning på å endre formen på granulat og dens gel struktur (data ikke vist). Etter tilsetningen av NaOH, viste den flytende fase gulaktig. Noen fluffy materiale ble løsrevet fra overflaten av granulene og dannet et lag på toppen av de sediment granulater (figur 1D og 1E). Likevel form avgranuler ble ikke endret. Tilsetningen av NaOH tilsynelatende forbedres EPS oppløseliggjøring, men kan ikke ødelegge den gel-matrise struktur. Til sammenligning, granuler helt forsvunnet etter Na 2 CO 3 ekstraksjon (figur 1f). Istedenfor en blanding av sol-lignende væske og små gelélignende partikler ble dannet, som viser gelmatriks av granuler faktisk ble oppløseliggjort.
Figur 1. Aerobic granulert slam EPS-ekstraksjoner. For en bedre visualisering av virkningen av hver utvinningsmetoden på kornene, eksperimentene ble utført i 25 ml glassflasker. Etter ekstraksjonsprosedyren, ekstraktene ble holdt i 1 time ved romtemperatur for å tillate suspendert stoff sette seg. (A) Sentrifugering ekstraksjon, (b) Sonikering ekstrahering, (c) EDTA ekstraksjon, (d) Formamid - NaOH ekstraDette skjer, (e) Formaldehyd - NaOH avstamning, (f) Høy temperatur -. Na 2 CO 3 utvinning Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
EPS-utbytte med hensyn til VS fraksjonen for hver metode er illustrert i figur 2. Utbyttet er presentert i mg VS EPS per g opprinnelig VS granule. Mengden av EPS oppnådd ved formaldehyd + NaOH, formamid + NaOH og Na CO 2 3 + + varme blanding var høyere enn den for sentrifugering, ultralydbehandling og EDTA ekstraksjon. Lignende resultater for disse ekstraksjonsteknikker ble også vist ved tidligere studier 11 - 13,15 som indikerer at alkaliske betingelser forbedre EPS oppløselighet 26,27. Mengden av EPS gjenvunnet ved Na 2 CO 3 var den høyeste, mer enn 20 ganger av det som oppnås bare ved sentrifugering. I tillegg kan det totale utbyttet av EPS Na 2 CO 3 ekstraksjon bli ytterligere forbedret ved flere ekstraksjoner. En andre ekstraksjon ved hjelp av pelleten kastet i trinn 1.6.8 (protokoll seksjon) av den første ekstraksjon øker det totale utbytte av 28%, en firedoble ekstraksjon med økt totalutbyttet med 46%.
Figur 2. Resultater av alle utvinningsmetoder med hensyn til VS utbytte og askeinnhold. For hver ekstraksjon den første linjen representerer VS utbyttet i mg VS EPS per g innledende VS granulat. Den andre linjen representerer vektprosenten av aske i de utpakkede TS. Feilstolpene illustrerer standardavviket av de tre ekstraksjoner utført for hver enkelt ekstraksjon teknikk."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Alginat-lignende ekstracellulære polymer (ALE) ekstraksjon
Etter at pH-verdien av EPS ekstrahert med Na 2 CO 3 ekstraksjon ble regulert til 2,2, ble 63% av den totale VS utfelt. Bunnfallet er sure ALE 25. Den gjenværende fraksjon var sannsynlig EPS som kan bli oppløst under ekstraksjonsbetingelsene, men kan ikke danne et bunnfall ved pH 2,2.
Formasjonstest Ionic hydrogel
Aerobe granuler har blitt beskrevet som å være lik en hydrogel. Granuleringen prosessen har vært ansett som en gel-dannende fenomen med glykosider som geleringsmiddel 4,9,25,28. Normalt, Ca2 + er en av de mest vanlige kationene i avløpsvann. I tillegg er det binder seg lett med sure polysakkarider (f.eksalginater og poly-galakturonsyre), antagelig som et motion å megle gelering 29. Således resulterer i en ionisk tverrbundet hydrogel. Det ble observert at tilsetning av Ca 2 + -ioner kan akselerere aerob slam granulering 30. Derfor kunne Ca 2 + -EPS (ionisk hydrogel) spiller en viktig rolle i å bygge opp den gel-matrisestruktur i aerobe granulert slam. I denne sammenheng hvorvidt de ekstraherte EPS danner et ionisk hydrogel med Ca 2 + -ioner kan brukes som en test for å undersøke om den ekstraherte EPS er en strukturell polymer som bidrar til dannelsen av gelmatriksen i aerobe granulert slam 9.
I denne forskning, for EPS ekstrahert fra AGS (figur 3a) ved hjelp av forskjellige metoder, er det bare EPS uttrukket av Na 2 CO 3 holdes i form av en dråpe i 2,5% (w / v) CaCl2-oppløsning og dannet stabile ioniske hydrogel-kuler .Videre natrium ALE hentet fra denne EPS av flere trinn (ALE polymer utvinning, figur 3b) vises samme eiendom også. Fargen og morfologi av Ca 2 + -ALE gelperler (figur 3c) er lik aerobe granulert slam (figur 3a). Tilsynelatende, EPS ekstrahert med Na 2 CO 3. Fremgangsmåte bidrar til dannelsen av gelmatriksen i aerobe granulert slam. ALE, som er en hovedkomponent av denne EPS er strukturelle polymerer, i stand til å danne en ionisk hydrogel.
Stabilitetstesten av den ioniske hydrogel
Det ble observert at under EPS utvinning, aerobic granulater holdt sin sfærisk form i EDTA, formaldehyd + NaOH og formamide + NaOH (figur 1). For å forstå dersom de uttrukne strukturelle polymerene spille en rolle i stabiliteten av granulene, var Ca 2 + -ALE perlerble behandlet på nøyaktig samme måte som aerobe granuler under ekstraksjonen. Interessant, Ca 2+ -ALE perler vises lignende stabilities som at av AGS (Figur 3d - 3f), dvs. Ca 2+ -ALE perler var ekstremt stabil i EDTA. Det var liten mengde av ALE løsrevet fra overflaten av Ca 2 + -ALE kuler (lite brunaktig fnokk i Figur 3e og 3f), når Ca 2 + -ALE perler hadde blitt fuktet med formaldehyd + NaOH og formamid + NaOH i tre timer hhv. Denne likheten i form av stabilitet mellom Ca 2+ -ALE perler og aerobic granulater indikerer at ALE er en del av de viktige strukturelle polymerer som danner AGS gel matrix.
Figur 3. Aerobic granulater og ekstrahert ALE. (A) granuler i demineralisert vann prior utvinning. (B) Syre ALE (ekstrahert i henhold til avsnittene 1.6 og 2) etter sentrifugering ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min. Resultater av stabilitetstest av ionisk hydrogel. (C) Ca 2+ -ALE-perler som er lagret i demineralisert vann i 4 timer ved 4 ° C. (D) Ca 2+ -ALE-perler som er lagret i 2% EDTA, i 3 timer ved 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-perler som er lagret i formamid + NaOH i 4 timer ved 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-perler som er lagret i formaldehyd + NaOH i 4 timer ved 4 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Merknader til protokollen seksjon
Utvinningen av EPS / ALE er beskrevet for et volum på 50 ml og 3 g granuler. Disse verdiene er veiledende. Ekstraksjoner med høyere granule konsentrasjoner kan redusere utbyttet av de ekstraherte EPS. Ved utvinning av ALE temperaturen bør holdes konstant ved 80 ° C i 30 minutter. Den tid som kreves for blandingen til å varme opp (ca. 5 min) er inkludert i protokollen. Dessuten er ekstraksjon effekten forsterkes ved hjelp av en magnetisk rørestav av samme størrelse som diameteren av kolben bunnen. Dette vil resultere i gode blandeegenskaper og frese effekter, fremme utvinning av EPS.
Senere i protokollen delen, er TS og VS avkastning av alle utdrag (supernatant samlet i trinn 1,1-1,6) bestemt. Dialyse må utføres før TS og VS måling for å redusere mulige feil på grunn av tilstedeværelsen av kjemikalier som benyttes for ekstraksjon. ENMWCO av 3500 Da er anbefalt å fjerne disse kjemikaliene og samtidig beholde de EPS makromolekyler innenfor dialyse bag. Dialyseposen skal ha et større volum enn volumet av ekstraktet. Dette er nødvendig, fordi volumet av ekstraktet vil øke under dialyse (for eksempel for utvinning EDTA inntil 40% økning av volum). Graden av kjemisk fjerning ved dialyse kan bestemmes ved å måle pH-verdien i prøven før og etter dialyse. Alternativt kan konduktivitetsmålinger av dialyse vann vise omfanget av ione-fjerning.
For å få ALE fra den totale hentet EPS (trinn 1,6 og 2) dialyse trinnet er valgfritt. Ikke desto mindre har dialyse tre fordeler: det reduserer mengden av HCl som er nødvendig for utfellingen, den forbedrer syre masseoverføring i ekstraktet og senker askeinnholdet i det oppnådde ALE. For utfelling av ALE anbefales det å bruke et glassbeger med et mye større volum enn extract. Na 2 CO 3 er normalt overdosert i utvinning. Den tilsatte HCl vil først reagere med Na 2 CO 3 venstre i ekstraktet, hvilket resulterer i karbondioksyd dannelse og, dersom prøven ikke ble dialysert før, i skumming. Under tilsetningen av HCl, bør ekstraktet røres langsomt med en magnetisk rørestav av samme størrelse som i bunnen av begerglasset. En rørestav av denne størrelse og langsom omrøring vil resultere i selv å blande uten å bryte strukturen av bunnfallet. Hvis sure gel-klumper dannes i ekstrakten, bør begerglasset blir virvlet svakt for hånd. Utfellingen gjennomføres med en syrekonsentrasjon på 1 M til å unngå en stor volumøkning av ekstraktet, mens det fremdeles oppnås en homogen fordeling av syren i prøven. Høyere syrekonsentrasjoner kan resultere i en regional pH reduksjon og sure gel klumper formasjon. En pH lavere enn 2,0 reduserer mengden ALE som kan utvinnes, sannsynligvis på grunn av strukturelle endringerav polymerene ved lavere pH. Det er derfor viktig å holde den endelige pH-verdi på 2,20 ± 0,05.
begrensninger
Den ALE utvinning metoden tar sikte på å trekke strukturelle ekstracellulære polymerer av EPS fra AGS eller biofilm generelt og er ikke ment å trekke ut alle nåværende EPS. For å trekke ut alle EPS, er det nødvendig med en kombinasjon av mer enn én utvinningsmetoden. Dessuten, som vist med økningen av VS EPS utbyttet ved å bruke en dobbel og firedoble utvinning, en enkelt utvinning vil ikke trekke ut alle strukturelle EPS. ALE utvinning er en hard EPS utvinning metode som kombinerer konstant blanding med varme og alkaliske forhold. Av denne grunn er det mulig at noe intracellulært materiale ekstraheres sammen med EPS. Selv om cellelyse kan være forårsaket av fysiske og kjemiske utvinning teknikker (ultralyd 31,32, NaOH 31,32, EDTA 11,32, CER 32, varme 32 og høy skjærhastigheter ved mblanding 19), trenger fortsatt tilstedeværelse av intracellulært materiale i gjenvinnes EPS som skal verifiseres. Den ioniske gel dannende tilhører de utpakkede EPS er hovedfokus for denne forskningen, om gjenvunnet EPS inneholder intracellulært materiale ble ikke analysert. Fremtidig forskning vil fokusere på å identifisere intracellulært materiale i de utpakkede EPS.
Solubiliserende hydrogelen matrise av AGS er avgjørende for å trekke ut strukturelle EPS
EPS danner en tett og kompakt hydrogel matrise i AGS. Selv om EPS inneholder forskjellige klasser av organiske makromolekyler så som polysakkarider, proteiner, nukleinsyrer, (fosfo) lipider, humusstoffer og noen intercellulære polymerer 7,5,8, ikke alle av dem danner en gel. Bare de gel-dannende polymerer er her betraktet som strukturelle polymerer i EPS.
Formålet med EPS ekstraksjoner er først å oppløse EPS, og deretter å samle solubiliserte EPS. Dersom de strukturelle EPS (dvs. than EPS danne en hydrogel) er målet for ekstraksjonen, har den gel-matrise av AGS for å bli oppløst først. Eneste metoder som kan oppløse den gel-matrisen er i stand til å utvinne strukturelle EPS. I denne forskningen, noen brukte EPS utvinning metoder som sentrifugering 10 - 15, ultralyd 10,14,15, EDTA 10 - 12,14,15, formaldehyd + NaOH 10 - 15 og formamide + NaOH 13 ikke kan effektivt isolere den strukturelle EPS. Dette skyldes det faktum at hydrogelen matrise av aerobe granuler ble ikke solubilisert ved hjelp av disse metodene. Av denne grunn ble stabilitetstester i § 4 bare utføres med forholdene til stede i EDTA, formamide + NaOH og formaldehyd + NaOH utvinning. Disse tre ekstraksjoner var ikke i stand til å isolere strukturelle EPS, men likevel oppnås det høyeste utbytte VS EPS foruten Na 2 CO 3 ekstraksjon. forhold of Na 2 CO 3 uttrekking ikke ble påført, da dette utvinning metoden klart oppløst AGS matrisen. Derav de anvendte forholdene under stabilitetstesten ble ansett representant.
Ekstraksjon med kationbytterharpiks (CER), en annen hyppig brukt EPS utvinning metoden, ble ikke ansett for denne sammenligningen, som tidligere studier på EPS ekstraksjon med CER ikke ga bedre resultater enn de kjemiske utdrag brukt her.
Gel-dannende EPS i AGS
Gel-dannende EPS er ansett som de strukturelle EPS i hydrogelmatriks av AGS. Det er verdt å påpeke at det finnes ulike typer hydrogeler som ioniske geler, temperaturinduserte gels og pH indusert gels. Denne studien fokuserer bare på EPS som danner ioniske geler. Når det gjelder stor fraksjon av strukturell gelmateriale trukket ut, er dette sannsynligvis vil være dominerende strukturelle EPS. Det er absolutt muligheter for at andre typer EPSsom danner forskjellige typer hydrogeler (for eksempel pH-induserte gel 28) foreligger i det samme eller andre typer aerobe granuler. Likevel, uansett hva slags hydrogel er målrettet, oppløsende EPS gel matrix er det viktigste steget for å trekke gel-forming EPS.
Foreløpig har lite forskning er gjort på strukturelle EPS på kornet slam. Den ALE ekstraksjon som er beskrevet i denne protokollen er i stand til å trekke ut geldannende EPS fra AGS og vil bli benyttet i fremtidige studier for å karakterisere strukturelle EPS. Mer forskning må gjøres på AGS, strukturelle EPS og ikke-strukturelle EPS for å bedre forstå prosessen og funksjon av korning og EPS. Spesielt de følgende tre punkter må undersøkes: hvorfor mikroorganismer fremstille en så stor mengde av EPS, hva som er den nøyaktige sammensetning av EPS, og hvor sammensetningen av EPS endres avhengig av miljøendringer. Oppdage og analysere alle involverte forbindelser og deres interaktivons vil bidra til å forstå biofilmer og hvordan du bruker dem til vår fordel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
| 1,000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
| RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
| sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
| 50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
| Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | - | |
| hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
| 250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
| calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
| 1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |
References
- Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment. Water Res. 84, 207-217 (2015).
- Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. Aerobic granular sludge - state of the art. Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnol. Adv. 26, 411-423 (2008).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Understanding the properties of aerobic sludge granules as hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1483-1493 (2009).
- Flemming, H. -C., Wingender, J.
- Seviour, T., Yuan, Z., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. Aerobic sludge granulation: A tale of two polysaccharides? Water Res. 46 (15), 4803-4813 (2012).
- Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. -C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 27-53 (1999).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS Matrix: The "House of Biofilm Cells.". J. Bacteriol. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Lin, Y. M., Sharma, P. K., van Loosdrecht, M. C. M. The chemical and mechanical differences between alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic flocculent sludge and aerobic granular sludge. Water Res. 47 (1), 57-65 (2013).
- Fang, H. H. P., Jia, X. S. Extraction of extracellular polymer from anaerobic sludges. Biotechnol. Tech. 10 (11), 803-808 (1996).
- Liu, H., Fang, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256 (2002).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Effect of extraction method on EPS from activated sludge: An HPSEC investigation. J. Hazard. Mater. 140 (1-2), 129-137 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120-1126 (2008).
- Pan, X., Liu, J., Zhang, D., Chen, X. I., Li, L., Song, W., Yang, J. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy. Water SA. 36 (1), 111-116 (2010).
- D'Abzac, P., Bordas, F., Van Hullebusch, E., Lens, P. N. L., Guibaud, G. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic granular sludges: Comparison of chemical and physical extraction protocols. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1589-1599 (2010).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties: Part I. Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods. Enzyme Microb. Technol. 38 (1-2), 237-245 (2006).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Tay, J. H. Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule. Water Res. 42, 1644-1650 (2008).
- Caudan, C., Filali, A., Lefebvre, D., Spérandio, M., Girbal-Neuhauser, E. Extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludges: Extraction, fractionation, and anionic properties. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (7), 1685-1702 (2012).
- Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 30 (8), 1749-1758 (1996).
- Nielsen, P. H., Jahn, A.
- Lin, Y. M., Nierop, K. G. J., Girbal-Neuhauser, E., Adriaanse, M., van Loosdrecht, M. C. M. Sustainable polysaccharide-based biomaterial recovered from waste aerobic granular sludge as a surface coating material. Sustain. Mater. Technol. 4, 24-29 (2015).
- Lin, Y. M., Wang, L., Chi, Z. M., Liu, X. Y. Bacterial Alginate Role in Aerobic Granular Bio-particles Formation and Settleability Improvement. Sep. Sci. Technol. 43 (7), 1642-1652 (2008).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , American Public Health Association. Washington DC. (1998).
- Mchugh, D. J. A guide to the seaweed industry. , FAO Fish. Tech. Pap. 441. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, Italy. (2003).
- Lin, Y., de Kreuk, M., van Loosdrecht, M. C. M., Adin, A. Characterization of alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic granular sludge in pilot-plant. Water Res. 44 (11), 3355-3364 (2010).
- Zorel, J. A., Aquino, S. F., Sanson, aL., Castro-Borges, W., Silva, S. Q. Evaluation of EPS extraction protocols from anaerobic sludge for gel-based proteomic studies. Water Sci. Technol. 72 (4), 535 (2015).
- Ruiz-Hernando, M., Cabanillas, E., Labanda, J., Llorens, J. Ultrasound, thermal and alkali treatments affect extracellular polymeric substances (EPSs) and improve waste activated sludge dewatering. Process Biochem. 50 (3), 438-446 (2015).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Gel-forming exopolysaccharides explain basic differences between structures of aerobic sludge granules and floccular sludges. Water Res. 43, 4469-4478 (2009).
- de Kerchove, A. J., Elimelech, M. Formation of polysaccharide gel layers in the presenceof Ca2+ and K+ ions: Measurements and mechanisms. Biomacromolecules. 8 (1), 113-121 (2007).
- Jiang, H. L., Tay, J. H., Liu, Y., Tay, S. T. L. Ca2+ augmentation for enhancement of aerobically grown microbial granules in sludge blanket reactors. Biotechnol. Lett. 25 (2), 95-99 (2003).
- Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge. Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).
- Guo, X., Liu, J., Xiao, B. Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge. J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).
