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Immunology and Infection

मापने एंजाइम से जुड़ी Lectin परख द्वारा इन्फ्लुएंजा neuraminidase निषेध एंटीबॉडी titers

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54573
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Products, CBER, Food and Drug Administration

Abstract

neuraminidase के लिए एंटीबॉडी (एनए), इन्फ्लूएंजा वायरस पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की सतह, इन्फ्लूएंजा के खिलाफ संरक्षण की ओर योगदान करते हैं। पारंपरिक तरीकों NA बाधा को मापने के लिए (एनआई) प्रतिरक्षी titers दिनचर्या सीरम विज्ञान के लिए व्यावहारिक नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल एंजाइम से जुड़ी लेक्टिन परख (एला), एनआई titers कि 96 अच्छी तरह प्लेटें एक बड़ी ग्लाइकोप्रोटीन सब्सट्रेट, fetuin के साथ लेपित में किया जाता है को मापने के लिए एक व्यावहारिक विकल्प विधि का वर्णन है। एनए cleaves fetuin से टर्मिनल सियालिक एसिड होता है, अंत से पहले चीनी उजागर, गैलेक्टोज। मूंगफली agglutinin (PNA) गैलेक्टोज के लिए विशिष्टता और इसलिए desialylation की हद के साथ एक लेक्टिन एक PNA-हॉर्सरैडिश peroxidase साधना, एक chromogenic peroxidase सब्सट्रेट के अलावा द्वारा पीछा का उपयोग मात्रा जा सकती है। ऑप्टिकल घनत्व कि मापा जाता है NA गतिविधि के लिए आनुपातिक है। एनआई एंटीबॉडी titers मापने के लिए, सीरा के धारावाहिक dilutions 37 डिग्री सीओ पर incubated हैं / एन ओ के साथ एक निश्चित राशि fetuin में लिपटे प्लेटों परएफ NA। उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने कि एनए गतिविधि के ≥50% निषेध में परिणाम के पारस्परिक एनआई एंटीबॉडी अनुमापांक के रूप में नामित किया गया है। ELLA इन्फ्लूएंजा संक्रमण या टीकाकरण के बाद मानव प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं की दिनचर्या मूल्यांकन के लिए एक व्यावहारिक स्वरूप प्रदान करता है।

Introduction

Neuraminidase (एनए) एक ग्लाइकोप्रोटीन इन्फ्लूएंजा virions की सतह पर व्यक्त की है। इसके एंजाइम गतिविधि संक्रमित कोशिकाओं 1,2 से नवगठित वायरस कणों की रिहाई के लिए आवश्यक है। एंटीबॉडी कि गतिविधि को बाधित NA पशु मॉडल 3 में वायरस titers और रोग के लक्षणों को कम करने और मनुष्यों 4 में रोग के खिलाफ प्रतिरोध के साथ सहसंबंधी। एनए निषेध (एनआई) titers निम्नलिखित टीकाकरण में वृद्धि हुई है इसलिए वैक्सीन की प्रभावकारिता का सूचक सेवा कर सकते हैं, लेकिन कई अतीत इन्फ्लूएंजा प्रतिरक्षाजनकता अध्ययनों से यह अंत बिंदु शामिल नहीं किया था क्योंकि पारंपरिक परख एनआई एंटीबॉडी titers को मापने के लिए दिनचर्या सीरम विज्ञान के लिए अव्यावहारिक है।

एनआई titers को मापने के लिए पारंपरिक विधि सियालिक एसिड की मात्रा है कि एनए 1 से glycoconjugates से cleaved है बढ़ाता पर आधारित है। इस विधि अक्सर thiobarbituric एसिड (टीबीए) पद्धति के रूप में भेजा, खतरनाक रसायनों का उपयोग करता सियालिक एसी परिवर्तित करने के लिएएक क्रोमोफोर कि स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है करने के लिए आईडी। परख नमूनों की बड़ी संख्या का परीक्षण क्योंकि व्यक्तिगत ग्लास ट्यूब इस्तेमाल कर रहे हैं, परख बोझिल बनाने के लिए उपयुक्त नहीं है। एक साथ 96 प्लेटों के लिए परख के miniaturization, एक और अधिक व्यावहारिक प्रारूप 5 प्रदान करता है लेकिन इस परख अभी भी जहरीले रसायनों के उपयोग की आवश्यकता है और इसलिए आदर्श नहीं है।

एनआई एंटीबॉडी titers को मापने के लिए एक वैकल्पिक परख Lambré एट अल। 6 से विकसित किया गया था। इस परख ग्लाइकोप्रोटीन, गैलेक्टोज के अंत से पहले चीनी, जो जब सियालिक एसिड NA द्वारा जारी की है उजागर हो जाता है की राशि को मापने के द्वारा एंजाइम गतिविधि quantifies। चूंकि मूंगफली-agglutinin (PNA) गैलेक्टोज करने के लिए विशेष रूप से बांधता है, एक PNA-हॉर्सरैडिश peroxidase (HRPO) साधना एक वर्णमिति पढ़ने के लिए बाहर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऑप्टिकल घनत्व कि मापा जाता है इसलिए NA गतिविधि नमूने में करने के लिए आनुपातिक है। एनआई titers उच्चतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करने से मापा जाता हैसीरम कि एनए गतिविधि के कम से कम 50% रोकता की। इस एंजाइम से जुड़ी लेक्टिन परख (एला) एनए के लिए सब्सट्रेट के रूप में, 96 अच्छी तरह प्लेटें fetuin, एक उच्च ग्लाइकोसिलेटेड सीरम प्रोटीन के साथ लेपित में किया जाता है।

assays कि एनआई titers को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार, एनए का स्रोत है। इसका कारण यह है टीका या संक्रमित व्यक्तियों से सीरा एनए को hemagglutinin (हेक्टेयर) के लिए एंटीबॉडी के साथ ही एंटीबॉडी होते हैं। एंटीबॉडी कि हा करने के लिए बाध्य NA गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और इसलिए, हा विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा गैर विशिष्ट निषेध, शुद्ध NA या पूरे वायरस एक antigenically-बेमेल हा युक्त परख में इस्तेमाल किया जाना चाहिए से बचने के लिए। ये वायरस क्लासिक reassortment द्वारा या रिवर्स आनुवंशिकी द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है; उद्देश्य वायरस है कि अध्ययन किया जा रहा है एक वायरस है कि एक उपप्रकार है कि लक्ष्य तनाव से संबंधित नहीं है की हा शामिल बचाव करने के लिए है, और एनए। परख इस आलेख में वर्णित इन्फ्लूएंजा वायरस जो रेव द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं को रोजगारआनुवंशिकी ERSE इन्फ्लूएंजा वायरस, उपप्रकार H1N1 और H3N2 5 से उप प्रकार H6 की हा और लक्षित एनए को रोकने के लिए।

Ella से उत्पन्न परिणामों और छोटी टीबीए assays दिखाने के इन तरीकों समान उप प्रकार विशिष्टता और संवेदनशीलता 7 के साथ तुलनीय, कर रहे हैं। ELLA खतरनाक रसायनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और इसलिए एनआई titers को मापने के लिए पसंदीदा तरीका है। इसे पूरा करने के लिए आसान है, केवल कुछ ही कदम (चित्रा 1) के साथ है: नमूने पतला और एक fetuin लेपित थाली करने के लिए जो वायरस (एनए के स्रोत) से जोड़ा जाता है करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। प्लेट incubated हे / एन और PNA-HRPO जोड़ने से पहले धोया जाता है। एक 2 घंटा ऊष्मायन के बाद, प्लेट धोया जाता है और peroxidase सब्सट्रेट जोड़ा जाता है; रंग प्रतिक्रिया बंद कर दिया जाता है और अंत में ऑप्टिकल घनत्व मापा जाता है और कि एनए गतिविधि के कम से कम 50% निषेध के परिणामस्वरूप नमूना कमजोर पड़ने के पारस्परिक 50% अंत बिंदु अनुमापांक के रूप में सूचना दी है। एक इंट्रा-प्रयोगशाला अध्ययन reproducibili आकलन करने के लिएELLA की Ty, पता चला है कि प्लेट से प्लेट परिवर्तनशीलता कम है और ऑपरेटर के लिए ऑपरेटर repeatability अनुमापांक 7 में कोई अधिक से अधिक 2 गुना मतभेद में हुई। ELLA परिवर्तनशीलता के एक बाद अंतर-प्रयोगशाला अध्ययन से पता चला परख अच्छा reproducibility है कि जब विभिन्न प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया और एक मानक के उस शामिल किए जाने के आगे के परिणामों 8 में परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं। ELLA preclinical और नैदानिक ​​फ्लू के टीके के अध्ययन से 7 सीरम पैनलों में एनआई एंटीबॉडी titers मापने के लिए उपयुक्त है और यह भी इन्फ्लूएंजा वायरस 9 के NAS के बीच मतभेद प्रतिजनी मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

एवियन घटकों के साथ सभी को लाइव reassortant वायरस जैव सुरक्षा स्तर का उपयोग कर 2 (BSL2) एक प्रयोगशाला कृषि के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग (यूएसडीए) और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा उपयोग के लिए मंजूरी दे दी में बढ़ी प्रथाओं नियंत्रित किया जाना चाहिए।

1. अभिकर्मकों और सामग्री शुरू की तैयारी

नोट: सभी अभिकर्मकों के स्रोत प्राप्त करने के लिए सामग्री तालिका देखें।

  1. Fetuin में लिपटे प्लेटों
    1. 90 मिलीलीटर के साथ 10 मिलीलीटर 10x कोटिंग बफर मिश्रण से कोटिंग बफर तैयार विआयनीकृत एच 2 ओ
    2. एक शेयर -20 डिग्री सेल्सियस पर 1x कोटिंग बफर और 500 μl aliquots में दुकान में 25 मिलीग्राम / एमएल पर fetuin का समाधान तैयार है।
    3. शेयर समाधान 1x कोटिंग बफर में 1,000 गुना गिराए द्वारा fetuin (25 माइक्रोग्राम / एमएल) के तुरंत कोटिंग प्लेटों से पहले का काम कर रहे एक समाधान तैयार है।
    4. अल में fetuin का काम कर समाधान के 100 μl बांटना एक multichannel विंदुक का प्रयोग करेंएक 96 अच्छी तरह से थाली उच्च प्रोटीन बाध्यकारी क्षमता है कि एल के कुओं।
    5. एक थाली मुहर के साथ एक थाली कवर तो 10 के समूह में प्लेटों के ढेर और उन्हें पन्नी में लपेट।
    6. एक परख के प्रदर्शन से पहले एक रेफ्रिजरेटर (2-8 डिग्री सेल्सियस) के लिए कम से कम 18 घंटे में प्लेटें प्लेस।
      नोट: प्लेट्स अग्रिम में लिपटे और अप करने के लिए 2 महीने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर कोटिंग समाधान के साथ संग्रहित किया जा सकता है।
  2. diluents
    1. वायरस और नमूना dilutions (2- (एन -morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस), पीएच 6.5, 20 मिमी 2 CaCl, 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.5% बीच 20) बनाने के लिए मंदक तैयार करने के लिए, 94.2 मिलीलीटर मिश्रण 1X एमईएस, 2 मिलीलीटर 2 CaCl (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पीएच 6.5, 3.3 मिलीग्राम 30% BSA और 0.5 मिलीलीटर बीच 20।
    2. PNA-HRPO (एमईएस, 20 मिमी 2 CaCl और 1% BSA के साथ पीएच 6.5) के लिए मंदक तैयार करने के लिए, मिश्रण 94.7 मिलीलीटर 1x एमईएस, पीएच 6.5 2 मिलीलीटर 2 CaCl (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ, और 3.3 एमएल 30% बीएसए ।
  3. Neuraminidase (एनए)
    नोट: H6Nx वायरस reassortants (इन H6 उप प्रकार की हा और ब्याज की NA है), उत्पन्न कर रहे हैं प्रकाशित तरीकों 5,10 के बाद। निष्क्रिय reassortant वायरस की शीशियों एक सहयोगी से अनुरोध करते हैं कि वे घर में उपलब्ध नहीं हैं। निष्क्रिय वायरस का उपयोग करते हैं, इस बात की पुष्टि है कि तैयारी प्रदर्शन के माध्यम से Ella में उपयोग कि निष्क्रियता प्रक्रिया NA गतिविधि पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था के लिए उपयुक्त है।
    1. संस्कृति embryonated चिकन अंडे 11 में H6Nx वायरस के एक शेयर और -80 डिग्री सेल्सियस पर साफ द्रव्य के 0.5 मिलीलीटर aliquots की दुकान।
    2. प्रत्येक परख के लिए वायरस की एक नई विभाज्य का प्रयोग करें। स्थिर और aliquots गल मत करो।
  4. सीरम नमूनों और नियंत्रण
    1. सभी सीरा गर्मी निष्क्रिय (परीक्षण के नमूने जैसे, पूर्व और बाद टीकाकरण सीरा, साथ ही नियंत्रण, जैसे, ज्ञात एनआई अनुमापांक के साथ नमूना) 45-60 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में। पहले या गर्मी उपचार के बाद -20 -70 डिग्री सेल्सियस पर सीरा स्टोर। samp हैंलेस, बार बार परीक्षण किया जा सकता है तो ठंड है कि नमूना बार बार स्थिर और thawed नहीं है इससे पहले कई aliquots बना रहे हैं।
    2. कि उचित मात्रा में उपलब्ध हैं (> 5 मिलीलीटर) मानव सीरा की नी titers को मापने के लिए एक उच्च अनुमापांक के साथ कम से कम और कम अनुमापांक के साथ एक दूसरे को पहचानने के लिए ELLA का प्रयोग करें। के रूप में स्टोर 100 μl aliquots ≤ -20 डिग्री सेल्सियस तो यह है कि एक ही नमूना आदेश परख प्रदर्शन को ट्रैक करने में कई assays में एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. मूंगफली agglutinin (PNA) -Horseradish peroxidase (HRPO)
    1. PNA-HRPO मंदक (एमईएस, CaCl 2 और 1% BSA के साथ 6.5 पीएच) तैयार करें।
    2. मंदक के 1 मिलीलीटर में PNA-HRPO के 1 मिलीग्राम भंग द्वारा एक PNA-HRPO शेयर समाधान तैयार है। दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर 20-200 μl aliquots।
    3. 500, 1: 750, 1: 1000 और 1: एक नया PNA-HRPO बहुत कुछ है, परीक्षण 1 उपयोग करने से पहले इस अभिकर्मक राशि है कि सकारात्मक नियंत्रण के साथ अधिक से अधिक ओवर ड्राफ्ट में यह परिणाम की पहचान करने के 2000 dilutions (वायरस केवल) और एक पृष्ठभूमि ( कोई वायरस) टीटोपी <सकारात्मक संकेत के 10% है।
      1. धारा 2.1 में वर्णित के रूप में चार प्रतियों वायरस dilutions बनाओ।
      2. धारा 2.2 में वर्णित के रूप में एक fetuin लेपित थाली करने के लिए dilutions स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
      3. 16-18 घंटा के बाद में प्लेट धोने और 1 जोड़ें: 500, 1: 750, 1: 1000 और 1: PNA-HRPO के 2,000 dilutions (100 μl / अच्छी तरह से) प्लेट की पंक्तियों नकल करने के लिए।
      4. परख को पूरा करने के लिए कदम 2.3.9 2.3.4 में वर्णित है।
      5. कमजोर पड़ने लगता है कि एक अधिकतम संकेत है कि> 10 बार पृष्ठभूमि में हुई चयन करने के लिए डेटा की समीक्षा करें।
    4. तुरंत उपयोग करने से पहले, PNA-HRPO का इष्टतम कमजोर पड़ने 1.5.3 में पहचान तैयार करते हैं।
  6. धो बफर (0.01 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.4, 0.05% के बीच 20 (पीबीएस-टी)) की एक बड़ी मात्रा में तैयार करें। आरटी पर स्टोर।
  7. peroxidase सब्सट्रेट (ओ-Phenylenediamine dihydrochloride (ओपीडी)) तैयार करें: नोट: इस तरह के 3,3 के रूप में वैकल्पिक peroxidase substrates ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), इस्तेमाल किया जा सकता है
    1. परख के दिन 100 मिलीलीटर DH 2 हे में 1 कैप्सूल भंग द्वारा फॉस्फेट साइट्रेट बफर तैयार करें।
    2. तुरंत उपयोग करने से पहले फॉस्फेट साइट्रेट बफर के 20 मिलीलीटर में 1 ओपीडी टैबलेट (10 मिलीग्राम) भंग।
  8. स्थान पर समाधान (1 राष्ट्रीय राजमार्ग 2 अतः 4) तैयार: अतः 4 973 मिलीलीटर DH 2 ओ को 27.2 मिलीलीटर शेयर 98% एच 2 जोड़ने मिक्स और फिर आरटी पर दुकान।

2. एनए की राशि का निर्धारण Ella में प्रयोग करने के लिए

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली में वायरस dilutions तैयार
    1. कॉलम कमजोर पड़ने की थाली के 1-11 में बांटना 120 μl नमूना मंदक (धारा 1.2)।
    2. स्तंभ के लिए 1, एक अतिरिक्त 96 μl नमूना मंदक जोड़ें।
    3. गला लें और फिर कॉलम 1 में कुओं नकल करने की इस वायरस का एक 1:10 कमजोर पड़ने देता है 24 μl जोड़ने से पहले वायरस की शीशी भंवर।
    4. नमूना मंदक में वायरस के धारावाहिक 2 गुना dilutions बनाओ, हस्तांतरण सेएक से अच्छी तरह से प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए अगले साफ पिपेट युक्तियों का उपयोग करने के लिए 120 μl।
  2. एक Fetuin लेपित थाली करने के लिए वायरस dilutions स्थानांतरण
    1. पीबीएस-टी (1.6 खंड) के साथ fetuin लेपित प्लेट 3 बार धोएं और फिर शोषक कागज तौलिया पर एक थाली दाग ​​धोने के किसी भी अतिरिक्त बफर हटा दें।
    2. नमूना मंदक (धारा 1.2.1) के 50 μl fetuin लेपित प्लेट में से 11 के लिए 1 कॉलम में एक अच्छी तरह से जोड़ें।
    3. स्तंभ से 12 नमूना मंदक के 100 μl (इन कुओं नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं) जोड़ें।
    4. स्थानांतरण कॉलम fetuin लेपित थाली की इसी कुओं को कमजोर पड़ने की थाली के 1-11 से पतला वायरस के 50 μl।
    5. एक थाली मुहर के साथ प्लेट कवर और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में जगह है।
    6. जिस पर समय शेष चरणों का प्रदर्शन किया जाएगा (16-18 घंटा के बाद) के नोट करें।
  3. पूरा NA निर्धारण
    1. जब ऊष्मायन पूरा हो गया है (16-18 घंटा), हस्तांतरणबेंच के लिए थाली और थाली मुहर हटा दें।
    2. पीबीएस-टी (धारा 1.7) के साथ थाली धो 6 बार और फिर पलटना और शोषक कागज तौलिए पर पैट सुनिश्चित करने के लिए सभी तरल कुओं से हटा दिया गया है।
    3. सभी कुओं के लिए (1.5.3 में निर्धारित कमजोर पड़ने पर) 100 μl / अच्छी तरह से PNA-HRPO समाधान जोड़ें और आरटी पर 2 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
    4. कम से कम 15 मिनट पहले ऊष्मायन अंत करने के लिए है, ओपीडी समाधान खंड 1.7 में वर्णित के रूप में तैयार करते हैं।
    5. परीक्षण प्लेटों 3 गुना PNA-HRPO को हटा दें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ओपीडी सब्सट्रेट के 100 μl जोड़ने से पहले सूखी दाग ​​को धो लें।
    6. आरटी पर ठीक 10 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
    7. 100 μl / 1N सल्फ्यूरिक एसिड की अच्छी तरह से जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    8. 0.1 सेकंड के लिए 490 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने के लिए एक प्लेट रीडर का प्रयोग करें।
    9. बचाने के लिए और सभी डेटा फ़ाइलों को निर्यात।
  4. कि सीरम विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा वायरस कमजोर पड़ने का चयन करें
    1. एक ग्राफ कि आयुध डिपो 490nm भूखंडों ड्रा (यानी, वक्र के रेखीय क्षेत्र) के लिए आनुपातिक है में परिणाम।
    2. वायरस के कमजोर पड़ने के संकेत है कि अधिक से अधिक का लगभग 90% देता है और रैखिक सीमा के भीतर है का चयन करें। इस बात की पुष्टि है कि चयनित कमजोर पड़ने पर आयुध डिपो में कम से कम पृष्ठभूमि संकेत से अधिक से अधिक 10 गुना है। सभी assays कि इस विशेष वायरस शेयर को रोजगार के लिए चुना वायरस के कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, वायरस के एनए गतिविधि को मापने और एला में उपयोग ~ 15-20 μU NA गतिविधि / मिलीलीटर।

3. एंजाइम से जुड़ी Lectin परख

नोट: चित्रा 2 थानेदारकमजोर पड़ने और परख प्लेटों के सेटअप WS।

  1. नमूना dilutions बनाओ
    1. बर्फ पर गर्मी निष्क्रिय नमूने रखें।
      नोट: 8 सीरा प्रत्येक थाली में पतला किया जा सकता।
    2. एक थाली भर में 1:10 पर शुरू dilutions का उपयोग कर सेट अप के लिए, कॉलम 3-11 में सभी कुओं के लिए 120 μl नमूना मंदक जोड़ें।
    3. स्तंभ 2, नमूना मंदक के 216 μl और प्रत्येक नमूने की 24 μl जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा और 3 बार नीचे कुएं में नमूना मिक्स और फिर अगले स्तंभ के लिए 120 μl हस्तांतरण।
    4. विंदुक युक्तियाँ बदलने के बाद, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह की सामग्री का मिश्रण है और फिर अगले स्तंभ के लिए 120 μl हस्तांतरण।
    5. नमूना जब तक दोहराएँ कदम 3.1.4 स्तंभ 11 को हस्तांतरित कर दिया गया है और शेष 120 μl खारिज कर दिया।
  2. नमूने और वायरस Fetuin लेपित प्लेट में जोड़े
    1. वायरस, भंवर की एक शीशी पिघलना और मंदक कमजोर पड़ने पर (धारा 1.2) चरण 2 में चयनित किया गया था में वायरस resuspend।4.2। प्रत्येक परख प्लेट के लिए वायरस का कम से कम 5 मिलीलीटर की तैयारी। जब तक प्लेटें धो रहे हैं और सीरम नमूनों की थाली के लिए जोड़ दिया गया है बर्फ पर पतला वायरस रखें।
    2. fetuin में लिपटे प्लेटों कि परख के लिए आवश्यक हैं की संख्या पर फैसला (आम तौर पर प्रति प्लेट 4 सीरा लागू)। पीबीएस-टी के साथ fetuin लेपित प्लेट 3 बार धोएं और फिर एक प्लेट पलटना और शोषक कागज तौलिया पर दाग धोने के लिए अतिरिक्त बफर हटा दें।
    3. कॉलम 2-11 में डुप्लिकेट कुओं में कमजोर पड़ने की थाली से प्रत्येक सीरम नियंत्रण या नमूना कमजोर पड़ने के 50 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण (स्तंभ 12) को छोड़कर सभी कुओं को पतला वायरस के 50 μl जोड़ें।
    5. 1 कॉलम में कुओं के लिए नमूना मंदक के 50 μl जोड़ें और स्तंभ से 12 नमूना मंदक के 100 μl जोड़ें।
    6. एक थाली मुहर के साथ कुओं को कवर किया और फिर धीरे थाली के किनारों दोहन या 10 सेकंड के लिए मध्यम गति से एक थाली प्रकार के बरतन पर रखकर मिश्रण।
    7. एक humidif में थाली प्लेस16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आईईडी इनक्यूबेटर।
  3. PNA-HRPO जोड़ें और धारा 2.3 में वर्णित के रूप परख पूरा

4. डेटा विश्लेषण

  1. की परख परिणाम वैधता निर्धारित
    1. पुष्टि करें कि पृष्ठभूमि मूल्यों (कोई वायरस) सकारात्मक नियंत्रण (वायरस और कोई सीरम) के कम से कम 10% हैं।
    2. पुष्टि करें कि एक ही परिस्थितियों का उपयोग कर विभिन्न assays में नियंत्रण सीरा रन की titers मंझला अनुमापांक का 2 गुना के भीतर हैं।
    3. पुष्टि नियंत्रण कुओं की कि आयुध डिपो माप संगत (≤20%) अलग कर रहे हैं और डुप्लिकेट नमूना कुओं की कि आयुध डिपो माप संगत (≤10% अलग) कर रहे हैं।
    4. अवैध परिणामों के मूल कारण का निर्धारण करते हैं और परख दोहराने यदि 4.1.1, 4.1.2 या 4.1.3 में सूचीबद्ध मापदंड, नहीं मिले हैं। जब समस्याओं का निवारण करने की कोशिश कर तालिका 1 में प्रस्तुत कारकों पर विचार करें।
  2. एक 50% अंत बिंदु टिटर निरुपित
    1. प्रत्येक परख की थाली, सु के लिएसभी रीडिंग से औसत पृष्ठभूमि (कोई प्रतिजन कुओं में जोड़ा) btract।
    2. सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक सीरम कमजोर पड़ने पर प्रतिशत निषेध की गणना: 100 x (ओवर ड्राफ्ट वायरस केवल नियंत्रण - आयुध डिपो परीक्षण नमूना) / आयुध डिपो वायरस केवल नियंत्रण।
    3. उच्चतम कमजोर पड़ने कि अधिकतम संकेत के कम से कम 50% निषेध के परिणामस्वरूप पहचानें।
    4. 50% अंत बिंदु अनुमापांक के रूप में इस कमजोर पड़ने के पारस्परिक रिपोर्ट।
      नोट: 50% निषेध किसी भी कमजोर पड़ने पर हासिल नहीं था, तो अनुमापांक, पहले कमजोर पड़ने से परीक्षण की तुलना में कम है जैसे, <10 जब 01:10 पहली कमजोर पड़ने का परीक्षण किया है।
  3. 50% निरोधात्मक एकाग्रता की गणना (आईसी 50)
    1. इस प्रकार के रूप आईसी 50 अनुमापांक निर्धारित करने के लिए चार पैरामीटर रसद प्रतिगमन का उपयोग करें: सभी रीडिंग से औसत पृष्ठभूमि घटाना और फिर एक प्रोग्राम है कि प्रतिगमन विश्लेषण करता है के लिए परिणामों को हस्तांतरण।
    2. गैर रेखीय प्रतिगमन का प्रयोग करें, अधिकतम सेट के साथवायरस को नियंत्रित करने और केवल न्यूनतम कमजोर पड़ने लगता है कि वास्तव में 50% निषेध के साथ मेल खाती है निर्धारित करने के लिए शून्य करने के लिए निर्धारित किया है।
    3. आईसी 50 अनुमापांक के रूप में इस कमजोर पड़ने के पारस्परिक रिपोर्ट।

Representative Results

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत परख चित्र 1 में रेखचित्र दिखाया गया है। चित्रा 2 96 अच्छी तरह से थाली लेआउट दिखाता है, और इंगित करता है कि सीरम नमूनों के धारावाहिक dilutions उन्हें fetuin लेपित थाली करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले एक कमजोर पड़ने की थाली में तैयार कर रहे हैं। परख का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि परख में प्रयोग किया जाता है neuraminidase की राशि है; इस reassortant वायरस का अनुमापन के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। H6N1 और H6N2 वायरस अनुमापन के उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है। H6N1 1:10, 1:20 और 1:40 dilutions में ऑप्टिकल घनत्व समान था, यह दर्शाता है कि स्थिति ऐसी है कि एक अधिकतम पढ़ने प्राप्त हुई थी थे। एक 1:80 कमजोर पड़ने पर, पढ़ने के लिए बाहर अधिकतम का लगभग 90% था और इसलिए वायरस के इस कमजोर पड़ने बाद assays में इस्तेमाल किया गया था। सीरम अनुमापन के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया जाता है। आंकड़ा एक मानव सीरम नमूना था कि तिवारी से पता चलता हैH6N1 और H6N2 वायरस के खिलाफ trated। प्रत्येक डेटा बिंदु NA गतिविधि है कि सीरम के धारावाहिक dilutions द्वारा प्राप्त किया गया था के प्रतिशत निषेध पता चलता है; H6N1 परख में पहली सीरम कमजोर पड़ने 1:80 था; H6N2 परख में सीरम के पहले कमजोर पड़ने 5. था के बाद से उच्चतम कमजोर पड़ने कि ≥50% निषेध में परिणाम एनआई एंटीबॉडी अनुमापांक, सीरम इस उदाहरण में दिखाया गया है अनुमापांक है नेकां के ना / 99 (एन 1) के खिलाफ 640 है और WI के एनए / 05 (एन 2) के खिलाफ 160।

आकृति 1
। चित्रा 1. ELLA प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध (ए) प्रतिजन (वायरस) के कमजोर पड़ने का निर्धारण परख (प्रोटोकॉल का चरण 2) में उपयोग करने के लिए: वायरस dilutions एक fetuin लेपित प्लेट और एनए गतिविधि द्वारा मापा से जुड़ जाते हैं PNA-HRPO के बंधन के माध्यम से टर्मिनल गैलेक्टोज अवशेषों बढ़ाता प्रोटोकॉल के कदम 2.3 में वर्णित के रूप में; (बी जी>) सीरम एनआई एंटीबॉडी titers (प्रोटोकॉल के चरण 3) का निर्धारण। नमूने पतला और फिर एक fetuin लेपित प्लेट जहां वायरस जोड़ा जाता है करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। प्लेट incubated है हे / एन PNA-HRPO जोड़ने और कदम एक रंग प्रतिक्रिया उत्पन्न करने की जरूरत पूरा करने से पहले। अंत में, रंग प्रतिक्रिया बंद कर दिया जाता है और ऑप्टिकल घनत्व मापा जाता है। नमूना कमजोर पड़ने कि एनए गतिविधि के कम से कम 50% निषेध में परिणाम के पारस्परिक 50% अंत बिंदु अनुमापांक के रूप में सूचना दी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. आरेख ELLA थाली सेट दिखाने के लिए। सीरम नमूनों के सीरियल dilutions एक कमजोर पड़ने की थाली में किया जाता है और फिर एक fetuin लेपित थाली करने के लिए स्थानांतरित कर दिया। 3fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. H6N1 और H6N2 वायरस अनुमापन के उदाहरण हैं। H6N1 बीआर / 07 के सीरियल dilutions H6N2 यू.आर. / 07 (ए के एनए (ए के ना / ब्रिस्बेन / 59/2007 (H1N1) नीले प्रतीकों में दिखाया गया है) और / उरुग्वे / 716 / 2007 (H3N2) लाल प्रतीकों में दिखाया गया है) fetuin में लिपटे प्लेटों में 18 घंटा और के रूप में वर्णित चुना गया PNA-HRPO साथ जेट के लिए incubated रहे थे। औसत 2 कुओं के आयुध डिपो 490nm वायरस कमजोर पड़ने के पारस्परिक के खिलाफ साजिश रची है। Ella में उपयोग के लिए चयनित H6N1 के कमजोर पड़ने 1:80 था और क्योंकि ये dilutions में अधिकतम ऑप्टिकल घनत्व का लगभग 90% हुई और रैखिक सीमा के भीतर थे चुने गए H6N2 के कमजोर पड़ने 01:40 था।3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एन 1 के एनए (लाल प्रतीकों) और एन 2 के खिलाफ सीरम (नीला प्रतीकों) उपप्रकार का अनुमापन। एनए निषेध titers reassortant वायरस के खिलाफ मापा गया H6N1 नेकां / 99 (जिसमें एक की ना / न्यू कैलेडोनिया / 20/1999 (H1N1) ) और H6N2 WI / 05 (जिसमें एक की ना / विस्कॉन्सिन / 67/2005 (H3N2))। सीरम के धारावाहिक dilutions के लिए प्रतिशत एंजाइम निषेध धराशायी क्षैतिज रेखा 50% निषेध का संकेत के साथ दिखाया गया है। एक के NAS के खिलाफ NA निषेध titers / न्यू कैलेडोनिया / 20/1999 (H1N1) (नेकां / 99) और ए / विस्कॉन्सिन / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) 2 9.3 (640) और 2 7.3 थे ( 160), क्रमशः। एक बड़ा ve देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की rsion।

मुसीबत संभावित कारण) उपाय
कमजोर संकेत या कोई पठार वायरस अनुमापन में पहुँच i) कम NA एंजाइम गतिविधि
ii) वायरस शेयर इष्टतम परिस्थितियों में भंडारित नहीं 		i) इस बात की पुष्टि मंदक पीएच कि एनए गतिविधि के लिए इष्टतम है कि; यदि पीएच इष्टतम है, एक नया वायरस शेयर तैयार है या वायरस ध्यान केंद्रित
ii) Regrow और विभाज्य शेयर; सूखी बर्फ पर स्नैप-फ्रीज शीशियों -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले
सकारात्मक सेल नियंत्रण कुओं में कमजोर या कोई रंग i) वायरस कमजोर पड़ने गलत तरीके से सौंपा
ii) जमे हुए वायरस aliquots में शीशी करने वाली शीशी परिवर्तनशीलता
iii) PNA- HRPO विकृत या बहुत ज्यादा पतला
iv) ओपीडी गलत तरीके से तैयार 		मैं); दोहराएँ वायरस अनुमापन
ii) एक ही बैच से कई शीशियों titrate सुनिश्चित करने के लिए कोई परिवर्तनशीलता है। महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता, तो ताजा aliquots तैयार
iii) PNA- HRPO retitrate करने के लिए इष्टतम वायरस कमजोर पड़ने का उपयोग
iv) ओपीडी की ताजा तैयारी के साथ दोहराएँ
सकारात्मक नियंत्रण सीरा द्वारा कमजोर या कोई निषेध मैं) बहुत ज्यादा परख में इस्तेमाल वायरस
ii) सीरम बिगड़ी 		i) दोहराएँ वायरस अनुमापन
द्वितीय) नई antisera चेक भंडारण की स्थिति प्राप्त करें
नकारात्मक नियंत्रण सीरा द्वारा निषेध मैं) अपर्याप्त सीरम की गर्मी उपचार
ii) बहुत कम परख में इस्तेमाल वायरस 		i) दोहराएँ सीरम की गर्मी निष्क्रियता
ii) दोहराएँ वायरस अनुमापन
उच्च पृष्ठभूमि i) प्लेटों के संभावित संक्रमण
ii) PNA- HRPO एकाग्रता बहुत अधिक / बहुत कम 		i) हौसले लेपित प्लेट का उपयोग कर दोहराएँ
ii) PNA-HRPO titrate का उपयोग करने के लिए सही कमजोर पड़ने की पहचान करने के लिए
वायरस अनुमापन कम dilutions पर एनए गतिविधि का स्पष्ट निषेध से पता चलता i) द्रव्य एनए के लिए सब्सट्रेट हो सकती है द्वितीय) का प्रयोग करें वायरस है कि एक सुक्रोज तकिया के माध्यम से pelleted कर दिया गया है

Assays कि प्रदर्शन मापदंड को पूरा नहीं करते तालिका 1. मूल कारण का विश्लेषण। इस तालिका में समस्या है कि जब ELLA प्रदर्शन उत्पन्न हो सकता है के लिए संभावित कारणों और समाधान प्रदान करता है।

Discussion

एंजाइम से जुड़ी लेक्टिन परख सीरा में एनआई एंटीबॉडी titers को मापने के लिए एक व्यावहारिक तरीका है। हालांकि ELLA 1990 में से Lambre एट अल।, वर्णित किया गया था, एक मानक serologic परख के रूप में अपनी स्वीकृति अधिक हाल ही में किया गया है, नैदानिक ​​नमूने 12-16 की नी एंटीबॉडी titers को मापने के लिए परख प्रदर्शन कई प्रयोगशालाओं के साथ। कुछ संशोधनों के एनआई titers कि मापा जाता है के लिए एक बड़ा प्रभाव के बिना प्रोटोकॉल कदम के लिए बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीबीएस मंदक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, यह बहुत मददगार सिफारिश बफर में वायरस अनुमापन घटता (एमईएस, पीएच 6.5) और तुलना करने के लिए है पीबीएस से पहले एक निर्णय लिया है, कुछ NA उपप्रकार काफी कम एंजाइम की गतिविधि कम कर दिया है के रूप में पीएच> 7.0। जब इष्टतम पीएच नहीं किया जाता है, वायरस के अधिकतम संकेत को कम किया जा सकता है, परख में प्रतिजन (यानी, वायरस) का एक अत्यधिक राशि के उपयोग में जिसके परिणामस्वरूप; इन परिस्थितियों में, परख कम संवेदनशीलता हो सकता है।

कुछ नहींजब इलाज सीरा Ella में परीक्षण कर रहे हैं एन विशिष्ट निषेध मनाया जाता है। यह, गर्मी उपचार (45 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस) से निकाल दिया जाता है thermolabile β-अवरोधकों की उपस्थिति का संकेत है। अन्य गैर विशिष्ट अवरोधकों (α और γ-वर्ग) इन्फ्लूएंजा हा का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से H3N2 वायरस hemagglutination और संक्रामकता के संबंध में। दरअसल, गैर विशिष्ट निषेध भी जब H3N2 वायरस एनए के स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं Ella में मनाया जाता है; इस निषेध sialidase 9 की एक छोटी राशि के साथ सीरम नमूनों के उपचार से निकाल दिया जाता है।

अन्य serologic assays के लिए के रूप में, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण परख प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने के लिए प्रत्येक परख में शामिल किया जाना चाहिए। परख स्वीकृति मानदंडों को पूरा नहीं किया गया है, कारण की पहचान की जानी चाहिए। तालिका 1 परख में संभावित कदम है कि समस्याओं का निवारण करने के लिए संबोधित किया जा सकता है की एक सूची प्रदान करता है।

ELLA प्रोटोकॉल नीतिइस रिपोर्ट में ided reassortant वायरस है कि एक एवियन वायरस से हा उद्भव शामिल उपयोग करता है, एनए के स्रोत के रूप में। इस परख प्रदर्शन क्योंकि एक परमिट कम रोगजनक एवियन वायरस के साथ काम करने के लिए आवश्यक है करने के लिए एक सीमा प्रस्तुत करता है। बाद में वे निष्क्रिय कर दिया है H6Nx reassortant वायरस प्रयोगशालाओं के बीच साझा किया जा सकता है। इसलिए परख सहयोग के माध्यम से एक बार प्रयोगशाला reassortant वायरस पैदा करने का प्रदर्शन किया है निष्क्रियता पूरा हो गया है कि आयोजित किया जा सकता है और तैयारी अपने NA गतिविधि को बरकरार रखा है। H6Nx reassortant वायरस का उपयोग करने की बाधा एनए के गैर-संक्रामक स्रोतों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कुछ प्रयोगशालाओं, शुद्ध पुनः संयोजक एनए 17 का इस्तेमाल किया है, जबकि दूसरों को वायरस की तरह कणों (VLPs) 15 का इस्तेमाल किया है। लेकिन, न तो पुनः संयोजक एनए और न ही VLPs आसानी से उपलब्ध हैं और इसलिए हम एक-antigenically बेमेल एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस हा के साथ प्रयोग जारी है।

परंपरागतएनआई एंटीबॉडी titers को मापने के लिए विधि कई कारणों के लिए व्यावहारिक नहीं है; सबसे अधिक चिंता की हानिकारक रसायन है कि एक रंग प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, नमूना की बड़ी मात्रा की जरूरत है और परख प्रदर्शन करने के लिए बोझिल है। इसके विपरीत, एला प्रदर्शन करने के लिए आसान है और एक प्रारूप है कि नमूनों की एक उचित संख्या का अनुमापन की अनुमति देता है। अध्ययनों से डेटा है कि जांच की ELLA परिवर्तनशीलता चलता है कि परख पैदावार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों 7.8। ELLA फलस्वरूप एनआई एंटीबॉडी संभव titers की दिनचर्या माप बना दिया है, और यह अनुमान है कि यह serologic अध्ययनों का आयोजन प्रयोगशालाओं से अधिक बार इस्तेमाल किया जाएगा।

वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम जब ELLA प्रदर्शन कर विचार करने की आवश्यकता है कि कर रहे हैं। सबसे पहले, एनए गतिविधि की गैर विशिष्ट अवरोधकों को हटा दिया जाना चाहिए। इन अवरोधकों को आम तौर पर कर रहे हैं thermolabile और 45 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी उपचार द्वारा नष्ट कर रहे हैं। गर्मी उपचार गैर विशिष्ट दूर करने के लिए पर्याप्त हैएफआईसी के नमूनों से अवरोधकों जब H6 reassortant वायरस एनए के स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, हालांकि, जब H3N2 वायरस Ella में उपयोग किया जाता है, सीरम कारक है कि hemagglutinin करने के लिए बाध्य भी एला के साथ हस्तक्षेप और sialidase की एक छोटी राशि के साथ इलाज से हटा दिया जाना चाहिए उपचार 9 गर्मी से पहले। दूसरा, प्रतिजन, यानी, reassortant H6Nx वायरस का एक अत्यधिक राशि के रूप में इस परख की संवेदनशीलता को कम कर देता है के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। वायरस से सावधान अनुमापन इसलिए एक आवश्यक कदम है; प्रत्येक परख में इस्तेमाल प्रतिजन की राशि एक संकेत अच्छी तरह से पृष्ठभूमि के ऊपर है कि प्रदान करनी चाहिए, और अनुमापन वक्र, यानी की रैखिक सीमा के भीतर होना चाहिए, सिग्नल (ऑप्टिकल घनत्व) वायरस के कमजोर पड़ने के लिए आनुपातिक होना चाहिए।

दिनचर्या सीरम विज्ञान के अलावा, एला मौसमी इन्फ्लूएंजा वायरस के NAS के बीच मतभेद प्रतिजनी मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह जानकारी बहुत उपयोगी हो सकता है जब शामिल किए जाने के एक के लिए वायरस उपभेदों का चयनएस वैक्सीन उम्मीदवारों और प्रतिरक्षा दबाव है कि एनए के प्रतिजनी बहाव में परिणाम का एक बड़ा समझ की सुविधा होगी। इसके अलावा, सूअर या एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस से Nas के प्रतिजनी विश्लेषण उभरते उपभेदों की महामारी क्षमता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध करा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5x MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
Phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
Chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
Multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
Water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
Water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
Refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
Incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models

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References

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Gao, J., Couzens, L., Eichelberger,… More

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).

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