Method Article

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가 생체은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

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조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

Abstract

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Microglia는 중추신경계(CNS)의 조직에 상주하는 대식세포로, 손상된 시냅스 또는 세포, 파편 및/또는 침입하는 병원체의 식세포작용을 포함하여 CNS 항상성을 지원하는 다양한 기능을 수행합니다. 손상된 식세포 기능은 알츠하이머병 및 노화 관련 황반 변성과 같은 질병의 발병기전과 관련이 있으며, 각각 아밀로이드 플라크와 드루젠이 축적β. 그 중요성에도 불구하고 미세아교세포작용은 in vivo에서 평가하기가 까다롭습니다. 여기에서는 망막 미세아교세포의 생체 내 식세포 전위를 정확하게 모니터링하고 정량화하기 위한 간단하면서도 강력한 기술에 대해 설명합니다. 이전 방법은 면역조직화학 염색 및 이미징 기술에 의존했습니다. 당사의 방법은 유세포 분석을 사용하여 살아있는 설치류에서 유리체강내 전달이 눈으로 전달된 후 형광 표지된 입자의 미세아교세포 흡수를 측정합니다. 이 방법은 힘든 조직 절편, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 기존 방법을 대체하여 6시간 이내에 미세아교세포 기능을 보다 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 절차는 생리학적 환경에서 다양한 화합물이 미세아교세포작용(microglial phagocytosis)을 어떻게 변화시키는지 테스트하기 위해 적용할 수도 있습니다. 이 기술은 눈에서 개발되었지만 그 사용은 시력 연구에만 국한되지 않습니다.

Introduction

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이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 (1)을 포함한다. 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 6, 7의 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변.

소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 ....

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Protocol

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모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다.

사출 용 재료 1. 준비

  1. 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다.
  2. 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. 칼슘 / 마그네슘 2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용액을 준비합니다.
    참고 : 식균 작용 분석을위한 검증 된 곰팡이 원산지 AF488 표지 입자는이 프로토콜 21-23에 사용됩니다. 최적의 흡수를 들어, 신선하고 즉시 주입하기 전에 입자를 준비합니다.
    주 2 : 입자 농도는 각각의 특정 실험을 위해 최적화 될 수있다.

구슬 솔루션 2. 유리체 강내 주입

참고 : 두 페이지eople 방식으로, 주입을 수행하기 위해 요구되도록 다른 사람이로드 된 주사기를 통과하고, 상기 플런저를 가압하는 동안, 마우스를 길게 안구의 초점을 유지할 수있는 주입을 수행하는 사람.

  1. 20 μL / 체중 10 g의 투여 량으로 100 ㎎ ....

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Results

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다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수있다. 리포 폴리 사카 라이드 다양한 선량 (LPS)의 복강 내 투여 하였다. 24 시간 LPS 챌린지 후, 여기에 설명 된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포 기능 (도 3A)을 평가하기 위해 사용되었다. (26) 예상되는 바와 같이, 차량 제어부 (도 3B)에 비해 1.42 mg의 복용량은 / kg의 LPS를 탐식 미세 아교 세포의 퍼센트.......

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Discussion

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이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유리체 강내 주사는 도전하고 수행이되지 않을 경우 제대로 편견과 변수의 결과로 이어질 것입니다. 가난한 사출 기술과 관련된 일반적인 문제는 출혈과 염증이 발생할 수 있습니다 망막에 렌즈 및 / 또는 손상의 천공 있습니다. 안구 외상의 위험을 최소화하기 위해, 설치류 최소한 헤드 운동 안정된 위치에 있어야한다. 안구 침투 주사기 천천히 삽입 타격하지 않도록 너무 멀리 가압되어야렌즈. 또 다른 일반적인 합병증은 눈 밖으로 주입 물질의 역류이다. 이를 방지하기 위해 상기 플런저 사출 후에 안구는 눈구멍으.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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Salome Murinello는 미국 당뇨병 협회 보조금 #1-16-PDF-072의 지원을 받습니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, National Eye Institute EY11254 and EY22025)과 로위 의학 연구소(Lowy Medical Research Institute)의 마틴 프리들랜더(Martin Friedlander)의 보조금으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
실체현미경니콘단종
해밀턴  주사기, 600 시리즈Sigma26702
33 게이지, 스몰 허브 RN NDL, 0.5 인치, 포인트 스타일 4 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisher ScientificZ-23373주사 직전에 준비하십시오
DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35두 개의
Dumont #5SF 펜치필요 Fine Science Tools11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-10Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – 산후 뉴런Miltenyi Biotec130-094-802
5 ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브Falcon352054
96 웰 U-바닥 플레이트Falcon353077
얼룩 완충액(BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 항체BioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
프로피듐 요오드BD Biosciences556463
정제된 안티 마우스 CD16/32 항체BioLegend101301
. 128025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with ....

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Retinal MicrogliaPhagocytic FunctionFlow CytometryIntravitreal InjectionFluorescent ParticlesTissue DissociationCell SuspensionFc Receptor BlockingViability DyeLPS Challenge

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