Method Article

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가 생체은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia는 중추신경계(CNS)의 조직에 상주하는 대식세포로, 손상된 시냅스 또는 세포, 파편 및/또는 침입하는 병원체의 식세포작용을 포함하여 CNS 항상성을 지원하는 다양한 기능을 수행합니다. 손상된 식세포 기능은 알츠하이머병 및 노화 관련 황반 변성과 같은 질병의 발병기전과 관련이 있으며, 각각 아밀로이드 플라크와 드루젠이 축적β. 그 중요성에도 불구하고 미세아교세포작용은 in vivo에서 평가하기가 까다롭습니다. 여기에서는 망막 미세아교세포의 생체 내 식세포 전위를 정확하게 모니터링하고 정량화하기 위한 간단하면서도 강력한 기술에 대해 설명합니다. 이전 방법은 면역조직화학 염색 및 이미징 기술에 의존했습니다. 당사의 방법은 유세포 분석을 사용하여 살아있는 설치류에서 유리체강내 전달이 눈으로 전달된 후 형광 표지된 입자의 미세아교세포 흡수를 측정합니다. 이 방법은 힘든 조직 절편, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 기존 방법을 대체하여 6시간 이내에 미세아교세포 기능을 보다 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 절차는 생리학적 환경에서 다양한 화합물이 미세아교세포작용(microglial phagocytosis)을 어떻게 변화시키는지 테스트하기 위해 적용할 수도 있습니다. 이 기술은 눈에서 개발되었지만 그 사용은 시력 연구에만 국한되지 않습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 (1)을 포함한다. 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 6, 7의 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변.

소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 CD200R 및 CX3CR1을 표현하면서 뉴런은 구조적으로, 이러한 CD200 및 CX3CL1 등 여러 가지 세포 표면 리간드를 표현한다. 이 수용체는 세포 내 부분에 면역 수용체 티로신 기반 금지 모티브 (ITIMs)를 포함한다. 이러한 수용체는 신경 염증에 기여할 수있는 미세 아교 세포의 과도한 자극을 방지하기위한 중요한 억제제. 따라서, 정상적인 생리적 조건 하에서, 뉴런 및 미세 아교 세포 간의 세포 - 세포 상호 작용은 정지 상태에서 미세 아교 세포를 유지한다. 조직 손상 동안, 그러나, 뉴런 EXP을 하향 조절할 수있다이러한 리간드 ression, 미세 아교 세포 활성에 미치는 억제 효과를 제거하는 단계를 포함한다. (식균 작용 포함) 소교 기능 따라서 밀접하게 자신의 미세 환경 (8)에 연결되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 생리 학적 맥락에서 또는 완전히 자신의 CNS의 미세 환경을 복제하는 방식으로 미세 아교 세포의 식세포 작용을 연구하는 표준화 된 시험 법이 없습니다.

여러 분석은 차 미세 아교 또는 소교 세포주 표적 세포 (예를 들면, 신경 세포 사멸) 또는 형광 표지 구슬 배양 시험관에 미세 아교 세포의 탐식 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 목표 흡수 후 형광 현미경 영상을 사용하거나 계측법 9-12 흐름 평가된다. 이러한 분석은 약물이나 유전자 조작이 유익한 동안, 완전히 생체 내 환경에서 복잡한을 복제하는 데 실패, 소교 식균 작용에 영향을 미칠 수있는 방법의 테스트를 할 수 있습니다. 소교 식균 작용을 검사하는 간접 방법생체 내에서보고되었다 : 이들은 미세 아교 세포 및 대상 식균 작용에 대한 (예를 들어, 손상된 신경 세포 나 시냅스 요소)의 물리적 인 근접성을 평가, 식세포 작용 (예를 들어, CD68)에 관여하는 것으로 생각 분자의 염색에 의해 수행, 또는 식세포의 면역 검출로되어있다 소교 세포 내 표적 (예를 들면, Aβ) 13-17. 두 연구는 생체 내에서 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하기 위해보다 직접적인 방법을 사용했다. 휴즈와 동료들은 두개 내 경로 (18)를 통해 전달 구슬의 소교 흡수를 측정하는 이미징 기술을 사용했다. 시에라는 등. 정량적으로 복잡한 이미징 기술 4를 사용 사멸 세포의 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하는 세련된 방법을 개발했다. 그러나 이러한 방법은 조직 준비, 절편, 이미징 및 분석을위한 복잡한 프로토콜을 포함한다. 우리는 이전에 알아 감광체의 식균 작용을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한문화 19 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 어 세그먼트. 여기서 우리는 신속하게 생체 내 미세 아교 세포의 식균 작용의 정량적 측정으로 망막 미세 아교 세포로의 형광 표지 된 입자 흡수를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다.

형광 표지 된 입자 (1) 체내 전달, (2) 수확 및 망막 조직의 준비, (3) 흐름 : 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수있는 정량적 세 가지 중요한 단계의 바로 아래 6 시간 망막 미세 아교 식균 작용의 측정이 가능 세포 계측 분석. 우리가 개발 한 방법은 망막 소교 식균 작용을 평가하기위한 강력한 방법이며, 성공적으로 다양한 화합물 또는 유전자 조작 생리 설정이 키 소교 기능을 변경하는 방법을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 중추 신경계의 전문 영역으로, 망막 미세 아교 세포 기능 (20)을 연구 쉽게 접근 할 수있는 모델 시스템입니다. 이 방법은 t에서 개발되었지만그는 눈에, 우리는 미세 아교 세포의 식세포 기능을 조사하는 모든 신경 과학자에 유용 할 수 있다고 생각합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다.

사출 용 재료 1. 준비

  1. 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다.
  2. 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. 칼슘 / 마그네슘 2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용액을 준비합니다.
    참고 : 식균 작용 분석을위한 검증 된 곰팡이 원산지 AF488 표지 입자는이 프로토콜 21-23에 사용됩니다. 최적의 흡수를 들어, 신선하고 즉시 주입하기 전에 입자를 준비합니다.
    주 2 : 입자 농도는 각각의 특정 실험을 위해 최적화 될 수있다.

구슬 솔루션 2. 유리체 강내 주입

참고 : 두 페이지eople 방식으로, 주입을 수행하기 위해 요구되도록 다른 사람이로드 된 주사기를 통과하고, 상기 플런저를 가압하는 동안, 마우스를 길게 안구의 초점을 유지할 수있는 주입을 수행하는 사람.

  1. 20 μL / 체중 10 g의 투여 량으로 100 ㎎ / ㎖ 케타민 10 ㎎ / ㎖의 자일 라진 복강 내 주사하여 쥐를 마취. 주입 전에 마취의 수준을 평가하기 위해 발가락 핀치를 사용합니다.
    참고 : 아이소 플루 란은 골수 세포 기능에 큰 효과가있다, 따라서,이 분석을 통해 그것의 사용은 24, 25을 피해야한다.
  2. 0.5 μL의 형광 표지 된 입자 용액과로드 바늘.
  3. 옆으로 수술 현미경 (그림 1A-B)에서 마우스를 놓습니다. 마우스의 더 나은 위치에 대한 부드러운 소재, 예를 들면, 젤 팩을 사용합니다. 눈이 아직 열려 있지있는 젊은 쥐를 들어, 부드럽게 fissu을 만들어 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀을 엽니 다이로부터 눈꺼풀 것이다 결국 오픈 슬릿을 따라 다시.
    1. 안구가 소켓에서 약간 튀어 있도록 각도 오 (45) 미세 집게의 도움으로 조심스럽게, 눈꺼풀 주위에 압력을 적용합니다. 그냥 귀 위의 두 손가락과 턱으로 머리를 잡고 조심스럽게 소켓에서 약간 눈을 유지하기 위해 눈꺼풀에 병렬로 피부를 스트레칭. 목 (그림 1B)에 너무 가까이 파악하지 않도록주의하십시오.
  4. (각막과 공막을 연결하는 지점) 각막 윤부에서 주사기의 바늘을 삽입, 안구 천공합니다. 이 색소 마우스의 회색 원으로 표시됩니다. 유리 체액의 작은 볼륨을 추방하고 주입하기 위해 약간의 바늘을 철회. 부드럽게 한 손으로 다른과 바늘로 마우스를 보유해야 주입을 수행하는 사람; 두 번째 사람은 천천히 플런저를 밀어해야합니다.
  5. 천천히 주사기를 철회. 적용을 눈 보습은 수화 눈을 유지하기 위해 삭제합니다.
  6. 설치류는 열 패드를 통해 새장에 복구하고 동물을 계속 모니터링 할 수 있습니다. 새끼와 함께 작업을하면, 호흡과 자발적 운동 할 때까지 다른 경고 동물 케이지에 동물을 반환하지 않습니다. 성인과 함께 작업하는 경우가 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지, 다른 경고 동물 케이지에 쥐를 반환하지 않습니다.

망막 조직의 3 수확

주 : 형광 표지 된 입자 주입하지 눈의 망막 조직을 유세포 분석 대조군으로 수집되어야한다. 분석은 단일 망막을 사용하여 수행 될 수 있지만, 최적의 성능을 위해 두 개의 망막 함께 풀링한다.

  1. 형광 표지 된 입자의 유리체 강내 주입 후 망막 조직 3 시간을 수집합니다.
    참고 : 입자 용액의 주입 후 시간이 각각의 특정 실험에 최적화 될 수 있지만, 우리는 3 시간 주사 후, 입자의 흡수는 O 대부분의 계층에서 볼 수 있다는 것을 발견망막 (그림 1C-D) 바.
  2. 경추 탈구로 쥐를 희생.
  3. 부드럽게 안구를 proptose하기 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀에 눌러 안구를 수집합니다. 안구 및 풀 뒤 집게를 놓습니다.
  4. 해부 현미경으로 망막을 해부하다. 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 소량을 함유하는 페트리 접시에 안구 전송. 페트리 접시의 건조 지역에서 극상 집게의 끝 각막 윤부에서 안구를 관통.
  5. 각막 윤부 둘레의 약 절반이 절단 될 때까지, 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 안구를 잡고 각막 윤부 주위에 잘라 봄 가위를 사용합니다.
  6. 벌금 45 오 각도 집게로 안구를 잡고 PBS로 안구를 가져온다. 좋은 45 오 각도 집게의 두 번째 쌍으로 떨어져 각막과 공막 눈물. 렌즈와 망막이 나올 나는 것의 ntact.
  7. 렌즈와 망막을 분리합니다. 망막 모아서 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 2 ㎖을 함유하는 5.4 ml의 폴리스티렌 시험관에 옮긴다.

4. 단일 세포 현탁액을 준비

  1. 제조업체의 지침에 약간의 수정과 신경 조직 분리 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 요약하면, 최대 피펫 팅 및 P1000 피펫과 함께 아래로 흔들어없이 37 ℃로 효소 소화를 수행하여 씹다 망막.

유세포 분석 5. 염색 단일 세포 현탁액

  1. 염색 완충액 200 μL에 재현 탁 셀은 U 바닥 96 웰 플레이트 및 전사 (0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 가진 둘 베코 인산염 완충 염수). 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
    참고 : 나트륨 아 지드는 인간과 환경에 유해한입니다. 적절한 개인 보호 장비 a를 사용하여차 지역 규정에 따라 폐기물을 폐기합니다.
  2. 상층 액을 버리고 싱크대 위에 접시를 반전. 5 ㎍ / 항 - 마우스 CD16 / CD32 항체 ml의 웰 당을 포함하는 얼룩 버퍼의 25 μL로 된 Fc 수용체에 resuspend 세포를 차단합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
  3. 항 - 마우스 Ly6C-APC-Cy7 0.5 ㎍ / ml의 항 - 마우스 Ly6G-PE-Cy7 0.5 ㎍ / ㎖의 항 - 마우스 CD11b를-AF650의 2.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
  4. 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 버리고 접시를 반전. 염색 버퍼의 200 μl의 세포를 재현 탁하여 씻으십시오.
  5. 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 요오드화 프로피 듐 (PI), 0.5 ㎍ / ml를 함유 염색 완충액 200 μL에 재현 탁. 1.2 ml의 마이크로 타이 튜브에 전송합니다.
  6. 의 이전 200 μL와 PI 및 수영장 0.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 추가 100 μL와 우물을 씻으십시오1.2 ml의 마이크로 타이 튜브. 염색 된 세포 300 μl의 총 부피를 얻을 수있다.

6. 유세포 분석

  1. 기존의 세 가지 레이저 (보라색, 파란색과 빨간색 레이저)를 사용하여, PE,를 PerCP-Cy5.5, BV510, 그리고 매우 밝은 형광 AF488 입자에서 상당한 파급에 의한 PI 염료을 피하십시오. 그것은 (대신를 PerCP-Cy5.5 채널의 mCherry 채널)은 PE 표지 항체 및 PI 수 있습니다로 (그림 2)를 사용,이 분석을 최적화하기 위해 네 번째 (노란색) 레이저를 사용합니다.
    참고 : 옐로우 레이저를 사용할 수없는 경우, 다른 채널에서 죽은 세포 제외 염료를 사용합니다.
  2. PI 부정적인 세포 (PI-)에 게이트 죽은 세포 (그림 2B)를 제외합니다.
  3. 죽은 세포, CD11b를 양성 세포 (CD11b를 +)에 게이트를 제외하면이 모든 골수 세포 (그림 2C)를 포함한다.
  4. Ly6C에 CD11b를 + 인구, 게이트 내 - / Ly6G는 - 제외 할호중구 (CD11b를 + / Ly6G +)와 단핵구 (CD11b를 + / Ly6C +도 2D). 미세 아교 세포 (- / Ly6G - 여기 CD11b를 + / Ly6C로 정의 단순화를 위해)에 게이팅 후,이 명확 인구가 볼 수 있어야합니다; 음 하나는 형광 표지 된 입자 긍정적. 식세포 입자를 촬영 한 것입니다 AF488 + (그림 2E)는 그러므로 있습니다.
    주 : 양수 또는 Ly6C Ly6G 양성 집단의이 염색 방법을 사용하여 입자의 흡수를 측정하기 위하여 분석 될 수있다. 식세포는 CD11b + 세포의 비율은 식세포 미세 아교 세포의 비율 (그림 2 층)과 잘 상관 관계. 이 균성 호중구 및 단핵 세포뿐만 아니라, 미세 아교 세포를 포함 불구 유세포 경험이없는 연구자 단독는 CD11b 염색과 간단한 분석이 수행 될 수있다. / Ly6G - -이 CD11b를 + / Ly6C 내 </ SUP> 인구, 마커 F4 / 80과 CX3CR1 염색에 의해 판단 이러한 세포가> 99 % 미세 아교 세포이다; 이러한 마커를 추가하지만 우리의 손에 필요하지 않습니다 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수있다. 리포 폴리 사카 라이드 다양한 선량 (LPS)의 복강 내 투여 하였다. 24 시간 LPS 챌린지 후, 여기에 설명 된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포 기능 (도 3A)을 평가하기 위해 사용되었다. (26) 예상되는 바와 같이, 차량 제어부 (도 3B)에 비해 1.42 mg의 복용량은 / kg의 LPS를 탐식 미세 아교 세포의 퍼센트...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유리체 강내 주사는 도전하고 수행이되지 않을 경우 제대로 편견과 변수의 결과로 이어질 것입니다. 가난한 사출 기술과 관련된 일반적인 문제는 출혈과 염증이 발생할 수 있습니다 망막에 렌즈 및 / 또는 손상의 천공 있습니다. 안구 외상의 위험을 최소화하기 위해, 설치류 최소한 헤드 운동 안정된 위치에 있어야한다. 안구 침투 주사기 천천히 삽입 타격하지 않도록 너무 멀리 가압되어야렌즈. 또 다른 일반적인 합병증은 눈 밖으로 주입 물질의 역류이다. 이를 방지하기 위해 상기 플런저 사출 후에 안구는 눈구멍으...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salome Murinello는 미국 당뇨병 협회 보조금 #1-16-PDF-072의 지원을 받습니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, National Eye Institute EY11254 and EY22025)과 로위 의학 연구소(Lowy Medical Research Institute)의 마틴 프리들랜더(Martin Friedlander)의 보조금으로 지원되었습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
실체현미경니콘단종
해밀턴  주사기, 600 시리즈Sigma26702
33 게이지, 스몰 허브 RN NDL, 0.5 인치, 포인트 스타일 4 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisher ScientificZ-23373주사 직전에 준비하십시오
DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35두 개의
Dumont #5SF 펜치필요 Fine Science Tools11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-10Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – 산후 뉴런Miltenyi Biotec130-094-802
5 ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브Falcon352054
96 웰 U-바닥 플레이트Falcon353077
얼룩 완충액(BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 항체BioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
프로피듐 요오드BD Biosciences556463
정제된 안티 마우스 CD16/32 항체BioLegend101301
. 128025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527(2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196(2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501(2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636(2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal MicrogliaPhagocytic FunctionFlow CytometryIntravitreal InjectionFluorescent ParticlesTissue DissociationCell SuspensionFc Receptor BlockingViability DyeLPS Challenge

Related Articles