망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가

본 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 망막 미세아교세포의 식세포 작용 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 화합물이 생리적 환경에서 미세아교세포의 식세포 작용 기능을 변화시키는지와 같은 안과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석법을 사용하여 미세아교세포의 식세포 작용을 빠르고 정밀하게 정량 분석할 수 있다는 점입니다.

제 실험실의 박사후 연구원인 Susumu Sakimoto가 절차 시연을 도와줄 것입니다. 먼저 33-gauge 바늘과 주사기에 0.5 µL의 형광 표지 입자 용액을 채웁니다. 그다음 마취된 마우스를 수술 현미경 아래의 부드러운 소재 위에 옆으로 눕히고, 발가락 꼬집기에 반응이 없는지를 확인하여 적절한 진정 상태인지 확인합니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 한쪽 눈꺼풀 주변에 조심스럽게 압력을 가해 안구가 안와 밖으로 약간 돌출되게 합니다. 그런 다음 두 손가락으로 귀 바로 윗부분과 동물의 턱 부분을 잡아, 눈꺼풀과 평행하게 피부를 부드럽게 당겨 안구가 안와 밖으로 약간 돌출된 상태를 유지합니다. 유리체 내 주사는 까다로운 작업이며, 정확하게 수행되지 않을 경우 결과에 편향이 생기거나 변동성이 커질 수 있습니다.

안구 외상을 줄이기 위해 머리 움직임을 최소화하여 동물을 안정적인 자세로 고정합니다. 안구를 천자하려면 한 손으로 마우스를 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 각막과 공막이 연결되는 각막연(corneal limbus) 부위를 찾는데, 이는 색소가 있는 마우스의 경우 회색 원형으로 보입니다.

다른 손으로 주사기를 잡고, 바늘을 각막연(limbus)에 삽입합니다. 그런 다음 바늘을 약간 뒤로 빼서 소량의 유리체액을 배출하고, 플런저를 천천히 눌러 입자를 주입합니다. 모든 비드를 주입한 후에는 주입된 물질의 역류를 방지하기 위해 주사기를 천천히 뽑아내고, 안구가 원래 위치로 돌아오면 보습제를 점안하여 안구의 수분을 유지합니다.

그 후 동물을 개별 케이지 내의 가열 패드 위에 놓고 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 유리체 내 주입 3시간 후, 45도 각도 핀셋을 사용하여 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 안구를 돌출시킵니다. 핀셋을 안구 뒤쪽에 위치시킨 후 잡아당깁니다.

그다음, 해부 현미경 하에서 칼슘과 마그네슘이 포함된 소량의 PBS가 들어 있는 페트리 접시의 건조한 영역으로 안구를 옮깁니다. 그리고 초미세 핀셋의 한쪽 끝을 사용하여 각막 연주 부위의 눈을 천공합니다. 이어서, 45도 각도의 미세 핀셋으로 안구를 잡고, 스프링 가위로 각막 연주 주변을 원둘레의 약 절반 정도까지 절개합니다.

안구를 PBS로 옮기고, 두 번째 미세 45도 각도 핀셋을 사용하여 각막과 공막을 찢어 분리합니다. 그러면 수정체와 망막이 손상되지 않은 상태로 나옵니다. 수정체와 망막이 분리되었는지 확인한 후, 망막을 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 2 mL가 들어 있는 5.4 mL 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다.

망막 세포의 단일 세포 현탁액을 얻으려면, 제조사의 지침에 따라 신경 조직 해리 키트를 사용하고 세포를 200 µL의 염색 버퍼에 재현탁하십시오. 그런 다음 샘플을 96-웰 U-바닥 플레이트의 한 웰로 옮기십시오. 원심 분리 후, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거하고 웰당 CD16, CD32 항체가 포함된 염색 버퍼 25 µL를 사용하여 실온에서 5분 동안 FC 수용체를 블로킹하십시오.

다음으로, 관심 항체를 사용하여 실온의 암소에서 15분 동안 세포를 표지합니다. 그 후 세포를 원심 분리하여 펠릿을 형성하고, 웰당 200 µL의 신선한 염색 버퍼로 세척합니다. 이제 펠릿을 200 µL의 염색 버퍼와 생존 염료에 재부유시킨 후, 샘플을 1.2 mL 마이크로타이터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 웰을 100 µL의 추가 염색 버퍼와 생존 염료로 세척하고, 세척액을 해당 샘플과 합쳐 유세포 분석으로 분석합니다. 이 방법은 생후 10~20일 된 마우스 또는 성체 마우스에 사용할 수 있으며, 화합물의 효과 및/또는 미세아교세포 포식 작용의 유전적 조작을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 본 실험에서 다양한 용량의 LPS를 복강 내 투여한 후, 대조군과 비교했을 때 1.42 mg/kg 용량의 LPS가 포식성 미세아교세포의 비율을 통계적으로 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에 세포 분류 후 qPCR 또는 단백질 분석과 같은 다른 방법들을 사용하여 망막 내 식세포성 미세아교세포와 비식세포성 미세아교세포 간의 차이에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술을 개발함으로써, 시각 및 신경 과학자들이 생체 내(in situ) 및 생리학적으로 유의미한 맥락에서 미세아교세포의 식세포 기능을 더욱 심도 있게 탐구하는 것이 가능해질 것으로 기대합니다.