망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가 생체은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여
October 18th, 2016
조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.
이 절차의 전반적인 목표는 in vivo에서 망막 미세아교세포의 식세포 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 화합물이 생리학적 환경에서 미세아교세포 기능을 변경하는지 여부와 같은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석을 사용하여 미세아교세포작용에 대한 빠르고 정확한 정량 분석이 가능하다는 것입니다.
절차를 시연하는 데 도움을 준 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Susumu Sakimoto입니다. 33게이지 바늘과 주사기에 0.5마이크로리터의 형광 표지된 입자 용액을 로드하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 마취된 마우스를 수술용 현미경 아래의 부드러운 물질 위에 옆으로 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 적절한 진정 수준을 확인합니다.
그런 다음 집게를 사용하여 한쪽 눈꺼풀 주위에 조심스럽게 압력을 가하여 안구가 눈구멍에서 약간 튀어나오도록 합니다. 그런 다음 두 손가락으로 귀 바로 위와 동물의 턱을 잡고 피부를 눈꺼풀과 평행하게 부드럽게 펴서 눈구멍에서 눈이 약간 튀어나오지 않도록 합니다. 유리체강 내 주사는 까다롭고, 올바르게 시행하지 않으면 편향되고 가변적인 결과를 초래할 수 있습니다.
눈에 대한 외상을 줄이려면 머리를 최소한으로 움직이면서 동물을 안정된 자세로 잡으십시오. 안구에 구멍을 뚫으려면 한 손으로 마우스를 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 각막과 공막이 연결되는 각막 가장자리를 찾는데, 이는 색소가 있는 쥐에서 회색 원으로 볼 수 있습니다.
다른 한 손에는 주사기를 잡고 바늘을 변리막에 삽입합니다. 그런 다음 바늘을 약간 집어넣어 소량의 유리체를 배출하고 플런저를 천천히 눌러 입자를 주입합니다. 모든 구슬이 전달되면 주사기를 천천히 빼서 주입된 물질의 역류를 방지하고 눈이 제자리로 돌아간 후 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 보습 방울을 바르십시오.
그런 다음 동물이 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 자체 케이지의 가열 패드에 동물을 놓습니다. 유리체강내 주사 3시간 후 45도 각도의 집게를 사용하여 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 안구를 고정합니다. 집게를 안구 뒤에 놓고 당깁니다.
그런 다음 해부 현미경으로 칼슘과 마그네슘이 함유된 소량의 PBS가 들어 있는 페트리 접시의 건조한 부분으로 안구를 옮깁니다. 그리고 극세미 집게의 한 끝을 사용하여 각막 가장자리의 눈을 천공합니다. 다음으로, 45도 각도의 미세한 집게로 안구를 잡고 스프링 가위를 사용하여 각막 가장자리 주위를 둘레의 약 절반이 잘릴 때까지 자릅니다.
안구를 PBS로 옮기고 두 번째 45도 각도의 미세한 집게를 사용하여 각막과 공막을 찢습니다. 수정체와 망막이 그대로 나옵니다. 수정체와 망막이 분리되었는지 확인하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 2ml가 들어 있는 5.4ml 폴리스티렌 시험관에 망막을 옮깁니다.
망막 세포의 단일 세포 현탁액을 얻으려면 제조업체의 지침에 따라 신경 조직 해리 키트를 사용하고 200마이크로리터의 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 96웰 U자형 바닥 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 원심분리 후 plate를 뒤집어 상층액을 버리고 실온에서 5분 동안 웰당 CD16, CD32 항체를 함유한 25마이크로리터의 염색 완충액으로 FC 수용체를 차단합니다.
다음으로, 관심 있는 항체로 세포를 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 라벨링합니다. 그런 다음 세포를 펠릿화하고 웰당 200마이크로리터의 새로운 염색 완충액으로 세척합니다. 이제 펠릿을 200마이크로리터의 염색 완충액 및 생존도 염료에 재현탁시키고 샘플을 1.2ml 마이크로타이터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 추가로 100마이크로리터의 염색 완충액과 생존도 염료로 웰을 세척하고 유세포 분석을 위해 해당 샘플로 세척물을 풀링합니다. 이 방법은 생후 10일에서 20일 된 출생 후 또는 성체 마우스에 사용할 수 있으며 화합물의 효과 및/또는 미세아교세포 형성작용의 유전자 조작을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 다양한 용량의 LPS를 사용한 복강내 챌린지 후 이 실험에서 LPS의 킬로그램당 1.42mg 용량은 차량 챌린지 대조군에 비해 식세포 미세아교세포의 백분율을 통계적으로 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었습니다.
이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 세포 분류 후 qPCR 또는 단백질체 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 망막의 식세포 미세아교세포와 비식식세포 미세아교세포의 차이점에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 개발함에 있어 우리는 이제 시각 및 신경 과학자들이 생리학적으로 관련된 맥락에서 현장에서 미세아교세포 식세포 기능을 더 탐구
할 수 있도록 할 수 있기를 기대합니다.View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
개요
이 기사는 체내에서 망막 미세아교세포의 식균 기능을 평가하는 새로운 기술을 소개합니다. 연구자들은 유세포 분석을 활용하여 미세아교세포의 식균 과정에 대한 빠르고 정확한 정량적 분석을 달성할 수 있으며, 이는 조직 항상성 및 병리학을 이해하는 데 필수적입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 안과학
- 세포 생물학
배경
- 미세아교세포의 식균 과정은 조직 항상성을 유지하는 데 매우 중요합니다.
- 부적절한 식균 기능은 다양한 병리와 연결되어 있습니다.
- 체내 미세아교세포 기능 평가는 기술적 도전을 안겨줍니다.
- 유세포 분석은 분석을 위한 견고한 방법을 제공합니다.
연구 목적
- 생리학적 환경에서 망막 미세아교세포의 식균 기능을 평가합니다.
- 특정 화합물이 미세아교세포의 식균 과정에 미치는 영향을 결정합니다.
- 안과학 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 형광 표지된 입자 용액을 33게이지 바늘에 넣습니다.
- 정밀 관찰을 위해 수술 현미경을 사용합니다.
- 마취된 쥐를 모니터링하여 적절한 진정을 확인합니다.
- 정량적 분석을 위해 유세포 분석을 활용합니다.
주요 결과
- 이 기술은 미세아교세포의 식균 과정을 정확하게 측정할 수 있게 합니다.
- 유세포 분석은 전통적인 방법에 비해 빠른 결과를 제공합니다.
- 화합물이 식균 기능에 미치는 잠재적 영향을 평가할 수 있습니다.
- 이 방법은 건강 및 질병에서 미세아교세포의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.
결론
- 개발된 기술은 미세아교세포 기능 연구를 위한 중요한 발전입니다.
- 신경염증 및 망막 건강 연구에 새로운 방향을 엽니다.
- 미래 연구에서는 이 방법을 활용하여 치료 중재를 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of retinal microglial phagocytic function using flow cytometry addresses a critical gap in CNS target validation and mechanistic de-risking for neuroinflammatory and neurodegenerative disease pipelines. This approach enables precise, reproducible measurement of microglial activity in physiologically relevant settings, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's adaptability and speed facilitate robust compound evaluation and portfolio triage for CNS and ophthalmology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial phagocytic function in vivo for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying functional responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates predictive confidence in CNS and retinal disease models by providing quantitative readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant microglial systems for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative phagocytosis measurements via flow cytometry.
- Enables rapid assessment of compound effects on microglial function, supporting scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development in neurodegeneration and retinal disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo functional assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microglial activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, compound screening, and translational research in CNS and ophthalmology pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies microglial phagocytosis to clarify pathway function and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated in vivo systems.
- Analytics: Generates statistically robust measurements for comparing experimental conditions and compound effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling functional biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various CNS and retinal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microglial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and scalable phagocytosis assays for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and ophthalmology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular procedures and flow cytometry analysis.
- Needs access to surgical microscopes, flow cytometers, and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of injection and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to different rodent ages and potentially other CNS tissues with protocol optimization.
- Dependent on precise intravitreal injection technique to minimize variability and bias.
