Name: 망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가 생체은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 생체 내 망막 미세 아교 식세포의 탐식 기능을 유동 세포 계측법으로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 안과학 및 신경과학 연구에서 조직 항상성과 병리 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

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Salome Murinello는 미국 당뇨병 협회 보조금 #1-16-PDF-072의 지원을 받습니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, National Eye Institute EY11254 and EY22025)과 로위 의학 연구소(Lowy Medical Research Institute)의 마틴 프리들랜더(Martin Friedlander)의 보조금으로 지원되었습니다.

모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다. 사출 용 재료 1. 준비 <ol><li> 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다. </li><li> 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. 칼슘 / 마그네슘 2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용액을 준비합니다. 참고 : 식균 작용 분석을위한 검증 된 곰팡이 원산지 AF488 표지 입자는이 프로토콜 21-23에 사용됩니다. 최적의 흡수를 들어, 신선하고 즉시 주입하기 전에 입자를 준비합니다. 주 2 : 입자 농도는 각각의 특정 실험을 위해 최적화 될 수있다. </li></ol> 구슬 솔루션 2. 유리체 강내 주입 참고 : 두 페이지eople 방식으로, 주입을 수행하기 위해 요구되도록 다른 사람이로드 된 주사기를 통과하고, 상기 플런저를 가압하는 동안, 마우스를 길게 안구의 초점을 유지할 수있는 주입을 수행하는 사람. <ol><li> 20 μL / 체중 10 g의 투여 량으로 100 ㎎ / ㎖ 케타민 10 ㎎ / ㎖의 자일 라진 복강 내 주사하여 쥐를 마취. 주입 전에 마취의 수준을 평가하기 위해 발가락 핀치를 사용합니다. 참고 : 아이소 플루 란은 골수 세포 기능에 큰 효과가있다, 따라서,이 분석을 통해 그것의 사용은 24, 25을 피해야한다. </li><li> 0.5 μL의 형광 표지 된 입자 용액과로드 바늘. </li><li> 옆으로 수술 현미경 (그림 1A-B)에서 마우스를 놓습니다. 마우스의 더 나은 위치에 대한 부드러운 소재, 예를 들면, 젤 팩을 사용합니다. 눈이 아직 열려 있지있는 젊은 쥐를 들어, 부드럽게 fissu을 만들어 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀을 엽니 다이로부터 눈꺼풀 것이다 결국 오픈 슬릿을 따라 다시. <ol><li> 안구가 소켓에서 약간 튀어 있도록 각도 오 (45) 미세 집게의 도움으로 조심스럽게, 눈꺼풀 주위에 압력을 적용합니다. 그냥 귀 위의 두 손가락과 턱으로 머리를 잡고 조심스럽게 소켓에서 약간 눈을 유지하기 위해 눈꺼풀에 병렬로 피부를 스트레칭. 목 (그림 1B)에 너무 가까이 파악하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> (각막과 공막을 연결하는 지점) 각막 윤부에서 주사기의 바늘을 삽입, 안구 천공합니다. 이 색소 마우스의 회색 원으로 표시됩니다. 유리 체액의 작은 볼륨을 추방하고 주입하기 위해 약간의 바늘을 철회. 부드럽게 한 손으로 다른과 바늘로 마우스를 보유해야 주입을 수행하는 사람; 두 번째 사람은 천천히 플런저를 밀어해야합니다. </li><li> 천천히 주사기를 철회. 적용을 눈 보습은 수화 눈을 유지하기 위해 삭제합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 설치류는 열 패드를 통해 새장에 복구하고 동물을 계속 모니터링 할 수 있습니다. 새끼와 함께 작업을하면, 호흡과 자발적 운동 할 때까지 다른 경고 동물 케이지에 동물을 반환하지 않습니다. 성인과 함께 작업하는 경우가 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지, 다른 경고 동물 케이지에 쥐를 반환하지 않습니다. </li></ol> 망막 조직의 3 수확 주 : 형광 표지 된 입자 주입하지 눈의 망막 조직을 유세포 분석 대조군으로 수집되어야한다. 분석은 단일 망막을 사용하여 수행 될 수 있지만, 최적의 성능을 위해 두 개의 망막 함께 풀링한다. <ol><li> 형광 표지 된 입자의 유리체 강내 주입 후 망막 조직 3 시간을 수집합니다. 참고 : 입자 용액의 주입 후 시간이 각각의 특정 실험에 최적화 될 수 있지만, 우리는 3 시간 주사 후, 입자의 흡수는 O 대부분의 계층에서 볼 수 있다는 것을 발견망막 (그림 1C-D) 바. </li><li> 경추 탈구로 쥐를 희생. </li><li> 부드럽게 안구를 proptose하기 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀에 눌러 안구를 수집합니다. 안구 및 풀 뒤 집게를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경으로 망막을 해부하다. 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 소량을 함유하는 페트리 접시에 안구 전송. 페트리 접시의 건조 지역에서 극상 집게의 끝 각막 윤부에서 안구를 관통. </li><li> 각막 윤부 둘레의 약 절반이 절단 될 때까지, 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 안구를 잡고 각막 윤부 주위에 잘라 봄 가위를 사용합니다. </li><li> 벌금 45 오 각도 집게로 안구를 잡고 PBS로 안구를 가져온다. 좋은 45 오 각도 집게의 두 번째 쌍으로 떨어져 각막과 공막 눈물. 렌즈와 망막이 나올 나는 것의 ntact. </li><li> 렌즈와 망막을 분리합니다. 망막 모아서 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 2 ㎖을 함유하는 5.4 ml의 폴리스티렌 시험관에 옮긴다. </li></ol> 4. 단일 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 약간의 수정과 신경 조직 분리 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 요약하면, 최대 피펫 팅 및 P1000 피펫과 함께 아래로 흔들어없이 37 ℃로 효소 소화를 수행하여 씹다 망막. </li></ol> 유세포 분석 5. 염색 단일 세포 현탁액 <ol><li> 염색 완충액 200 μL에 재현 탁 셀은 U 바닥 96 웰 플레이트 및 전사 (0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 가진 둘 베코 인산염 완충 염수). 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 참고 : 나트륨 아 지드는 인간과 환경에 유해한입니다. 적절한 개인 보호 장비 a를 사용하여차 지역 규정에 따라 폐기물을 폐기합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 싱크대 위에 접시를 반전. 5 ㎍ / 항 - 마우스 CD16 / CD32 항체 ml의 웰 당을 포함하는 얼룩 버퍼의 25 μL로 된 Fc 수용체에 resuspend 세포를 차단합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 항 - 마우스 Ly6C-APC-Cy7 0.5 ㎍ / ml의 항 - 마우스 Ly6G-PE-Cy7 0.5 ㎍ / ㎖의 항 - 마우스 CD11b를-AF650의 2.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. </li><li> 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 버리고 접시를 반전. 염색 버퍼의 200 μl의 세포를 재현 탁하여 씻으십시오. </li><li> 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 요오드화 프로피 듐 (PI), 0.5 ㎍ / ml를 함유 염색 완충액 200 μL에 재현 탁. 1.2 ml의 마이크로 타이 튜브에 전송합니다. </li><li> 의 이전 200 μL와 PI 및 수영장 0.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 추가 100 μL와 우물을 씻으십시오1.2 ml의 마이크로 타이 튜브. 염색 된 세포 300 μl의 총 부피를 얻을 수있다. </li></ol> 6. 유세포 분석 <ol><li> 기존의 세 가지 레이저 (보라색, 파란색과 빨간색 레이저)를 사용하여, PE,를 PerCP-Cy5.5, BV510, 그리고 매우 밝은 형광 AF488 입자에서 상당한 파급에 의한 PI 염료을 피하십시오. 그것은 (대신를 PerCP-Cy5.5 채널의 mCherry 채널)은 PE 표지 항체 및 PI 수 있습니다로 (그림 2)를 사용,이 분석을 최적화하기 위해 네 번째 (노란색) 레이저를 사용합니다. 참고 : 옐로우 레이저를 사용할 수없는 경우, 다른 채널에서 죽은 세포 제외 염료를 사용합니다. </li><li> PI 부정적인 세포 (PI-)에 게이트 죽은 세포 (그림 2B)를 제외합니다. </li><li> 죽은 세포, CD11b를 양성 세포 (CD11b를 +)에 게이트를 제외하면이 모든 골수 세포 (그림 2C)를 포함한다. </li><li> Ly6C에 CD11b를 + 인구, 게이트 내 - / Ly6G는 - 제외 할호중구 (CD11b를 + / Ly6G +)와 단핵구 (CD11b를 + / Ly6C +도 2D). 미세 아교 세포 (- / Ly6G - 여기 CD11b를 + / Ly6C로 정의 단순화를 위해)에 게이팅 후,이 명확 인구가 볼 수 있어야합니다; 음 하나는 형광 표지 된 입자 긍정적. 식세포 입자를 촬영 한 것입니다 AF488 + (그림 2E)는 그러므로 있습니다. 주 : 양수 또는 Ly6C Ly6G 양성 집단의이 염색 방법을 사용하여 입자의 흡수를 측정하기 위하여 분석 될 수있다. 식세포는 CD11b + 세포의 비율은 식세포 미세 아교 세포의 비율 (그림 2 층)과 잘 상관 관계. 이 균성 호중구 및 단핵 세포뿐만 아니라, 미세 아교 세포를 포함 불구 유세포 경험이없는 연구자 단독는 CD11b 염색과 간단한 분석이 수행 될 수있다. / Ly6G - -이 CD11b를 + / Ly6C 내 &lt;/ SUP&gt; 인구, 마커 F4 / 80과 CX3CR1 염색에 의해 판단 이러한 세포가&gt; 99 % 미세 아교 세포이다; 이러한 마커를 추가하지만 우리의 손에 필요하지 않습니다 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유리체 강내 주사는 도전하고 수행이되지 않을 경우 제대로 편견과 변수의 결과로 이어질 것입니다. 가난한 사출 기술과 관련된 일반적인 문제는 출혈과 염증이 발생할 수 있습니다 망막에 렌즈 및 / 또는 손상의 천공 있습니다. 안구 외상의 위험을 최소화하기 위해, 설치류 최소한 헤드 운동 안정된 위치에 있어야한다. 안구 침투 주사기 천천히 삽입 타격하지 않도록 너무 멀리 가압되어야렌즈. 또 다른 일반적인 합병증은 눈 밖으로 주입 물질의 역류이다. 이를 방지하기 위해 상기 플런저 사출 후에 안구는 눈구멍으...

이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 (1)을 포함한다. 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 6, 7의 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변. 소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 CD200R 및 CX3CR1을 표현하면서 뉴런은 구조적으로, 이러한 CD200 및 CX3CL1 등 여러 가지 세포 표면 리간드를 표현한다. 이 수용체는 세포 내 부분에 면역 수용체 티로신 기반 금지 모티브 (ITIMs)를 포함한다. 이러한 수용체는 신경 염증에 기여할 수있는 미세 아교 세포의 과도한 자극을 방지하기위한 중요한 억제제. 따라서, 정상적인 생리적 조건 하에서, 뉴런 및 미세 아교 세포 간의 세포 - 세포 상호 작용은 정지 상태에서 미세 아교 세포를 유지한다. 조직 손상 동안, 그러나, 뉴런 EXP을 하향 조절할 수있다이러한 리간드 ression, 미세 아교 세포 활성에 미치는 억제 효과를 제거하는 단계를 포함한다. (식균 작용 포함) 소교 기능 따라서 밀접하게 자신의 미세 환경 (8)에 연결되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 생리 학적 맥락에서 또는 완전히 자신의 CNS의 미세 환경을 복제하는 방식으로 미세 아교 세포의 식세포 작용을 연구하는 표준화 된 시험 법이 없습니다. 여러 분석은 차 미세 아교 또는 소교 세포주 표적 세포 (예를 들면, 신경 세포 사멸) 또는 형광 표지 구슬 배양 시험관에 미세 아교 세포의 탐식 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 목표 흡수 후 형광 현미경 영상을 사용하거나 계측법 9-12 흐름 평가된다. 이러한 분석은 약물이나 유전자 조작이 유익한 동안, 완전히 생체 내 환경에서 복잡한을 복제하는 데 실패, 소교 식균 작용에 영향을 미칠 수있는 방법의 테스트를 할 수 있습니다. 소교 식균 작용을 검사하는 간접 방법생체 내에서보고되었다 : 이들은 미세 아교 세포 및 대상 식균 작용에 대한 (예를 들어, 손상된 신경 세포 나 시냅스 요소)의 물리적 인 근접성을 평가, 식세포 작용 (예를 들어, CD68)에 관여하는 것으로 생각 분자의 염색에 의해 수행, 또는 식세포의 면역 검출로되어있다 소교 세포 내 표적 (예를 들면, Aβ) 13-17. 두 연구는 생체 내에서 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하기 위해보다 직접적인 방법을 사용했다. 휴즈와 동료들은 두개 내 경로 (18)를 통해 전달 구슬의 소교 흡수를 측정하는 이미징 기술을 사용했다. 시에라는 등. 정량적으로 복잡한 이미징 기술 4를 사용 사멸 세포의 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하는 세련된 방법을 개발했다. 그러나 이러한 방법은 조직 준비, 절편, 이미징 및 분석을위한 복잡한 프로토콜을 포함한다. 우리는 이전에 알아 감광체의 식균 작용을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한문화 19 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 어 세그먼트. 여기서 우리는 신속하게 생체 내 미세 아교 세포의 식균 작용의 정량적 측정으로 망막 미세 아교 세포로의 형광 표지 된 입자 흡수를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다. 형광 표지 된 입자 (1) 체내 전달, (2) 수확 및 망막 조직의 준비, (3) 흐름 : 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수있는 정량적 세 가지 중요한 단계의 바로 아래 6 시간 망막 미세 아교 식균 작용의 측정이 가능 세포 계측 분석. 우리가 개발 한 방법은 망막 소교 식균 작용을 평가하기위한 강력한 방법이며, 성공적으로 다양한 화합물 또는 유전자 조작 생리 설정이 키 소교 기능을 변경하는 방법을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 중추 신경계의 전문 영역으로, 망막 미세 아교 세포 기능 (20)을 연구 쉽게 접근 할 수있는 모델 시스템입니다. 이 방법은 t에서 개발되었지만그는 눈에, 우리는 미세 아교 세포의 식세포 기능을 조사하는 모든 신경 과학자에 유용 할 수 있다고 생각합니다.

<table><tbody><tr><td>실체현미경</td><td>니콘</td><td>단종</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴&nbsp; 주사기, 600 시리즈</td><td>Sigma</td><td>26702</td><td></td></tr><tr><td>33 게이지, 스몰 허브 RN NDL, 0.5 인치, 포인트 스타일 4 - 12o</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Z-23373</td><td>주사 직전에 준비하십시오</td></tr>. <tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>두 개의</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 펜치</td><td>필요 Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td>Curved</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit &ndash; 산후 뉴런</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-802</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 U-바닥 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>얼룩 완충액(BSA)</td><td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV650 항체</td><td>BioLegend</td><td>101259</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C-APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>128025</tr><tr><td>Ly6G-PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드</td><td>BD Biosciences</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>정제된 안티 마우스 CD16/32 항체</td><td>BioLegend</td><td>101301</td><td></td></tr></tbody></table>

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia는 중추신경계(CNS)의 조직에 상주하는 대식세포로, 손상된 시냅스 또는 세포, 파편 및/또는 침입하는 병원체의 식세포작용을 포함하여 CNS 항상성을 지원하는 다양한 기능을 수행합니다. 손상된 식세포 기능은 알츠하이머병 및 노화 관련 황반 변성과 같은 질병의 발병기전과 관련이 있으며, 각각 아밀로이드 플라크와 드루젠이 축적β. 그 중요성에도 불구하고 미세아교세포작용은 in vivo에서 평가하기가 까다롭습니다. 여기에서는 망막 미세아교세포의 생체 내 식세포 전위를 정확하게 모니터링하고 정량화하기 위한 간단하면서도 강력한 기술에 대해 설명합니다. 이전 방법은 면역조직화학 염색 및 이미징 기술에 의존했습니다. 당사의 방법은 유세포 분석을 사용하여 살아있는 설치류에서 유리체강내 전달이 눈으로 전달된 후 형광 표지된 입자의 미세아교세포 흡수를 측정합니다. 이 방법은 힘든 조직 절편, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 기존 방법을 대체하여 6시간 이내에 미세아교세포 기능을 보다 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 절차는 생리학적 환경에서 다양한 화합물이 미세아교세포작용(microglial phagocytosis)을 어떻게 변화시키는지 테스트하기 위해 적용할 수도 있습니다. 이 기술은 눈에서 개발되었지만 그 사용은 시력 연구에만 국한되지 않습니다.

다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수있다. 리포 폴리 사카 라이드 다양한 선량 (LPS)의 복강 내 투여 하였다. 24 시간 LPS 챌린지 후, 여기에 설명 된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포 기능 (도 3A)을 평가하기 위해 사용되었다. (26) 예상되는 바와 같이, 차량 제어부 (도 3B)에 비해 1.42 mg의 복용량은 / kg의 LPS를 탐식 미세 아교 세포의 퍼센트...

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

본 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 망막 미세아교세포의 식세포 작용 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 화합물이 생리적 환경에서 미세아교세포의 식세포 작용 기능을 변화시키는지와 같은 안과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석법을 사용하여 미세아교세포의 식세포 작용을 빠르고 정밀하게 정량 분석할 수 있다는 점입니다.제 실험실의 박사후 연구원인 Susumu Sakimoto가 절차 시연을 도와줄 것입니다. 먼저 33-gauge 바늘과 주사기에 0.5 µL의 형광 표지 입자 용액을 채웁니다. 그다음 마취된 마우스를 수술 현미경 아래의 부드러운 소재 위에 옆으로 눕히고, 발가락 꼬집기에 반응이 없는지를 확인하여 적절한 진정 상태인지 확인합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 한쪽 눈꺼풀 주변에 조심스럽게 압력을 가해 안구가 안와 밖으로 약간 돌출되게 합니다. 그런 다음 두 손가락으로 귀 바로 윗부분과 동물의 턱 부분을 잡아, 눈꺼풀과 평행하게 피부를 부드럽게 당겨 안구가 안와 밖으로 약간 돌출된 상태를 유지합니다. 유리체 내 주사는 까다로운 작업이며, 정확하게 수행되지 않을 경우 결과에 편향이 생기거나 변동성이 커질 수 있습니다.안구 외상을 줄이기 위해 머리 움직임을 최소화하여 동물을 안정적인 자세로 고정합니다. 안구를 천자하려면 한 손으로 마우스를 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 각막과 공막이 연결되는 각막연(corneal limbus) 부위를 찾는데, 이는 색소가 있는 마우스의 경우 회색 원형으로 보입니다.다른 손으로 주사기를 잡고, 바늘을 각막연(limbus)에 삽입합니다. 그런 다음 바늘을 약간 뒤로 빼서 소량의 유리체액을 배출하고, 플런저를 천천히 눌러 입자를 주입합니다. 모든 비드를 주입한 후에는 주입된 물질의 역류를 방지하기 위해 주사기를 천천히 뽑아내고, 안구가 원래 위치로 돌아오면 보습제를 점안하여 안구의 수분을 유지합니다.그 후 동물을 개별 케이지 내의 가열 패드 위에 놓고 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 유리체 내 주입 3시간 후, 45도 각도 핀셋을 사용하여 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 안구를 돌출시킵니다. 핀셋을 안구 뒤쪽에 위치시킨 후 잡아당깁니다.그다음, 해부 현미경 하에서 칼슘과 마그네슘이 포함된 소량의 PBS가 들어 있는 페트리 접시의 건조한 영역으로 안구를 옮깁니다. 그리고 초미세 핀셋의 한쪽 끝을 사용하여 각막 연주 부위의 눈을 천공합니다. 이어서, 45도 각도의 미세 핀셋으로 안구를 잡고, 스프링 가위로 각막 연주 주변을 원둘레의 약 절반 정도까지 절개합니다.안구를 PBS로 옮기고, 두 번째 미세 45도 각도 핀셋을 사용하여 각막과 공막을 찢어 분리합니다. 그러면 수정체와 망막이 손상되지 않은 상태로 나옵니다. 수정체와 망막이 분리되었는지 확인한 후, 망막을 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 2 mL가 들어 있는 5.4 mL 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다.망막 세포의 단일 세포 현탁액을 얻으려면, 제조사의 지침에 따라 신경 조직 해리 키트를 사용하고 세포를 200 µL의 염색 버퍼에 재현탁하십시오. 그런 다음 샘플을 96-웰 U-바닥 플레이트의 한 웰로 옮기십시오. 원심 분리 후, 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거하고 웰당 CD16, CD32 항체가 포함된 염색 버퍼 25 µL를 사용하여 실온에서 5분 동안 FC 수용체를 블로킹하십시오.다음으로, 관심 항체를 사용하여 실온의 암소에서 15분 동안 세포를 표지합니다. 그 후 세포를 원심 분리하여 펠릿을 형성하고, 웰당 200 µL의 신선한 염색 버퍼로 세척합니다. 이제 펠릿을 200 µL의 염색 버퍼와 생존 염료에 재부유시킨 후, 샘플을 1.2 mL 마이크로타이터 튜브로 옮깁니다.그런 다음 웰을 100 µL의 추가 염색 버퍼와 생존 염료로 세척하고, 세척액을 해당 샘플과 합쳐 유세포 분석으로 분석합니다. 이 방법은 생후 10~20일 된 마우스 또는 성체 마우스에 사용할 수 있으며, 화합물의 효과 및/또는 미세아교세포 포식 작용의 유전적 조작을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 본 실험에서 다양한 용량의 LPS를 복강 내 투여한 후, 대조군과 비교했을 때 1.42 mg/kg 용량의 LPS가 포식성 미세아교세포의 비율을 통계적으로 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에 세포 분류 후 qPCR 또는 단백질 분석과 같은 다른 방법들을 사용하여 망막 내 식세포성 미세아교세포와 비식세포성 미세아교세포 간의 차이에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술을 개발함으로써, 시각 및 신경 과학자들이 생체 내(in situ) 및 생리학적으로 유의미한 맥락에서 미세아교세포의 식세포 기능을 더욱 심도 있게 탐구하는 것이 가능해질 것으로 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 생쥐의 눈에서 유리체강내 전달 후 형광 생체 입자의 미세아교세포 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석을 보여줍니다. 유세포분석법은 CD11b를 발현하는 살아있는 세포를 검출하고 녹색 형광을 보이는 식세포 미세아교세포를 Ly6C 발현 단핵구 및 Ly6G 발현 호중구를 포함한 다른 골수성 세포와 구별합니다.

유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

출처: Bosco, A., et al. In vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma(신경 퇴행 중 망막 미세아교세포 활성화의 생체 내 역학: 마우스 녹내장의 컨포칼 안과 영상 및 세포 형태 측정).   J. Vis. 특급 (2015년) 이 비디오는 녹내장의 마우스 모델에서 망막 미세아교세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 형광 단백질 발현 망막 미세아교세포를 가진 형질전환 마우스가 검안경 아래에 위치합니다. 적외선 조명은 시신경두(ONH)를 찾는 데 사용되며, 초점면은 망막 혈관을 랜드마크로 사용하여 설정됩니다. 그런 다음 형광 미세아교세포를 시각화하기 위해 형광 이미징을 사용합니다. 세포체가 커지고 분지 복잡성이 감소하는 것을 특징으로 하는 활성화된 미세아교세포를...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

본 프로토콜은 미세아교세포의 미세세포세포 파편에 대한 반복적인 자기 자극의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다. 이를 위해 체외 미세아교세포와 미엘린 파편 공동 배양 시스템이 구축되었습니다.

반복되는 자기 자극 하에서 체외 에서 Myelin 파편의 미세아교세포 형성 평가

본 논문은 회전 원반 공초점 현미경을 사용하여 망막에서 미세아교세포 운동성과 시냅스 후 눈점과의 접촉을 시각화하고 정량화하는 방법을 시연합니다.

병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스와의 상호작용에 대한 실시간 영상 및 특성 분석

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

대부분의 감염은 강력한 CTL 반응을 이끌어내는,하지만 가끔 응답 세포의 수량은 병원균 제어 상관 관계를하지...

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

배우세요 생체 내 망막 미세 아교 식세포의 탐식 기능을 유동 세포 계측법으로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 안과학 및 신경과학 연구에서 조직 항상성과 병리 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가

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