망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가 생체은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 in vivo에서 망막 미세아교세포의 식세포 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 화합물이 생리학적 환경에서 미세아교세포 기능을 변경하는지 여부와 같은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석을 사용하여 미세아교세포작용에 대한 빠르고 정확한 정량 분석이 가능하다는 것입니다.

절차를 시연하는 데 도움을 준 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Susumu Sakimoto입니다. 33게이지 바늘과 주사기에 0.5마이크로리터의 형광 표지된 입자 용액을 로드하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 마취된 마우스를 수술용 현미경 아래의 부드러운 물질 위에 옆으로 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 적절한 진정 수준을 확인합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 한쪽 눈꺼풀 주위에 조심스럽게 압력을 가하여 안구가 눈구멍에서 약간 튀어나오도록 합니다. 그런 다음 두 손가락으로 귀 바로 위와 동물의 턱을 잡고 피부를 눈꺼풀과 평행하게 부드럽게 펴서 눈구멍에서 눈이 약간 튀어나오지 않도록 합니다. 유리체강 내 주사는 까다롭고, 올바르게 시행하지 않으면 편향되고 가변적인 결과를 초래할 수 있습니다.

눈에 대한 외상을 줄이려면 머리를 최소한으로 움직이면서 동물을 안정된 자세로 잡으십시오. 안구에 구멍을 뚫으려면 한 손으로 마우스를 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 각막과 공막이 연결되는 각막 가장자리를 찾는데, 이는 색소가 있는 쥐에서 회색 원으로 볼 수 있습니다.

다른 한 손에는 주사기를 잡고 바늘을 변리막에 삽입합니다. 그런 다음 바늘을 약간 집어넣어 소량의 유리체를 배출하고 플런저를 천천히 눌러 입자를 주입합니다. 모든 구슬이 전달되면 주사기를 천천히 빼서 주입된 물질의 역류를 방지하고 눈이 제자리로 돌아간 후 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 보습 방울을 바르십시오.

그런 다음 동물이 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 자체 케이지의 가열 패드에 동물을 놓습니다. 유리체강내 주사 3시간 후 45도 각도의 집게를 사용하여 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 안구를 고정합니다. 집게를 안구 뒤에 놓고 당깁니다.

그런 다음 해부 현미경으로 칼슘과 마그네슘이 함유된 소량의 PBS가 들어 있는 페트리 접시의 건조한 부분으로 안구를 옮깁니다. 그리고 극세미 집게의 한 끝을 사용하여 각막 가장자리의 눈을 천공합니다. 다음으로, 45도 각도의 미세한 집게로 안구를 잡고 스프링 가위를 사용하여 각막 가장자리 주위를 둘레의 약 절반이 잘릴 때까지 자릅니다.

안구를 PBS로 옮기고 두 번째 45도 각도의 미세한 집게를 사용하여 각막과 공막을 찢습니다. 수정체와 망막이 그대로 나옵니다. 수정체와 망막이 분리되었는지 확인하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 2ml가 들어 있는 5.4ml 폴리스티렌 시험관에 망막을 옮깁니다.

망막 세포의 단일 세포 현탁액을 얻으려면 제조업체의 지침에 따라 신경 조직 해리 키트를 사용하고 200마이크로리터의 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 96웰 U자형 바닥 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 원심분리 후 plate를 뒤집어 상층액을 버리고 실온에서 5분 동안 웰당 CD16, CD32 항체를 함유한 25마이크로리터의 염색 완충액으로 FC 수용체를 차단합니다.

다음으로, 관심 있는 항체로 세포를 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 라벨링합니다. 그런 다음 세포를 펠릿화하고 웰당 200마이크로리터의 새로운 염색 완충액으로 세척합니다. 이제 펠릿을 200마이크로리터의 염색 완충액 및 생존도 염료에 재현탁시키고 샘플을 1.2ml 마이크로타이터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 추가로 100마이크로리터의 염색 완충액과 생존도 염료로 웰을 세척하고 유세포 분석을 위해 해당 샘플로 세척물을 풀링합니다. 이 방법은 생후 10일에서 20일 된 출생 후 또는 성체 마우스에 사용할 수 있으며 화합물의 효과 및/또는 미세아교세포 형성작용의 유전자 조작을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 다양한 용량의 LPS를 사용한 복강내 챌린지 후 이 실험에서 LPS의 킬로그램당 1.42mg 용량은 차량 챌린지 대조군에 비해 식세포 미세아교세포의 백분율을 통계적으로 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었습니다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 세포 분류 후 qPCR 또는 단백질체 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 망막의 식세포 미세아교세포와 비식식세포 미세아교세포의 차이점에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 개발함에 있어 우리는 이제 시각 및 신경 과학자들이 생리학적으로 관련된 맥락에서 현장에서 미세아교세포 식세포 기능을 더 탐구