Zika Virus Infektiøs Cell Culture System og<em> In vitro</em> Profylaktiske virkning af interferoner
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) er en ny patogen, der er knyttet til føtale udviklingsmæssige abnormaliteter såsom mikrocefali, øje defekter, og nedsat vækst. ZIKV er et RNA-virus af Flaviviridae-familien. ZIKV hovedsageligt overføres af myg, men kan også spredes ved moderens til føtal vertikal transmission og seksuel kontakt. Til dato er der ingen pålidelige behandling eller vaccine muligheder for at beskytte dem, inficeret med virus. Udviklingen af en reproducerbar, effektiv Zika virus infektiøs cellekultursystem er kritisk for at studere de molekylære mekanismer i ZIKV replikation samt lægemiddel og vaccineudvikling. I denne henseende er en protokol, der beskriver en pattedyr celle-baserede in vitro Zika virus kultur for viral produktion og vækst analyse rapporteret her. Nærmere oplysninger om dannelsen af plaques af Zika virus på en cellemonolaget, og plaque-analyse til måling virustiter præsenteres. Viral genomreplikation kinetikog dobbeltstrengede RNA-genom replicatory mellemprodukter bestemmes. Denne kultur platform blev anvendt til screening mod et bibliotek af et lille sæt af cytokiner resulterer i identifikationen af interferon-α (IFN-α), IFN-β og IFN-γ som potente inhibitorer af Zika viral vækst. Sammenfattende er en in vitro infektiøs Zika viral kultur-system og forskellige virologiske analyser påvist i denne undersøgelse, som har potentiale til at få stor gavn forskersamfundet i at belyse yderligere mekanismerne i viral patogenese og udviklingen af viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan yderligere vurderes som et profylaktisk, post-eksponering profylaktisk, og mulighed for Zika virusinfektioner i højrisikogrupper, herunder smittede gravide kvinder behandling.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) er en vigtig humant patogen forbundet med mikrocefali og dårlig graviditetsudfald 1,4. ZIKV hører til sættet af medicinsk relevante flavivirus, som kan forårsage neurologiske defekter såsom dengue, West Nile og St. Louis encephalitis virus. Den vigtigste form for viral transmission er ved myg vektor Aedes aegypti, og derudover har seksuel overførsel også rapporteret 5,6. ZIKV er blevet et stort globalt sundhedsproblem på grund af den voksende geografiske fordeling af myg vektor og dens stærk korrelation med fosterskader. ZIKV blev først isoleret i 1947 fra en skildvagt rhesus abe i Zika skoven, blev Uganda og det første menneske tilfælde rapporteret i 1952 7,8. Personer, der bliver smittet med ZIKV stede med milde symptomer som feber, udslæt, hovedpine, conjunctivitis, og muskel / ledsmerter. Inficerede gravide kvinder kan overføre ZIKV til det udviklende foster en. ZIKV infektion har også været forbundet med Guillain-Barre syndrom, en perifer nerve autoimmun demyelinisering disorder 9.
Den Zika virale genom består af en positiv sense, enkeltstrenget RNA-molekyle, som er ca. 10,8 kilobaser i længden. Genomet struktur er organiseret som 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med ikke-kodende områder (NCR) flankerer et protein-kodende region 6. En enkelt polyprotein (3419 aa) oversættes som er co- og posttranslationelt kløvet i 10 mindre peptider. Både 5'NCR og 3'NCR RNA stem-loop strukturer spiller en afgørende rolle i begyndelsen af virale genom oversættelse og replikation. De strukturelle komponenter af genomet består af capsid, membran og kappeproteiner. De ikke-strukturelle proteiner er kritisk for genom replikation.
I øjeblikket er Zika virusstammer grupperet i tre overordnede genotyper: vestafrikanske, Østafrikanske og asiatiske 6,10-13. Det er blevet foreslået, at Østafrikanske afstamning spredt sig til Vestafrika og Asien, hvor det senere videreudviklet 12. Den asiatiske genotype er ansvarlig for de aktuelle udbrud i Amerika. Zika virus kan dyrkes i både myg og pattedyrceller. Primære dermale fibroblaster, umodne dendritiske celler, corticale neurale progenitorceller og Vero-celler er modtagelige for Zika virusinfektion 10,14,15. Både type I og type II interferoner har vist sig at begrænse ZIKV vækst i hudfibroblaster 15. Formålet med denne undersøgelse er at give en trinvis, detaljeret protokol for produktion og analysering af den asiatiske genotype Zika virusstamme PRVABC59 i et pattedyrs cellekultur-system og til at demonstrere anvendeligheden af denne smittende kultur system som lægemiddeludvikling platform. Denne ressource har potentiale til stor gavn for Zika viral og neurologisk forskning samfund til yderligere at belyse its mekanismer af viral patogenese og udviklingen af viral virulens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her er en strømlinet protokol til dyrkning Zika-virus in vitro præsenteret. Kritiske trin, herunder, identificere optimale slutpunkter for at udvide virus kultur, måling titer, og kvantificere genom replikation blev leveret. Zika-virus er et humant patogen, så, mens håndtering smitstoffer, biosikkerhed procedurer der følges nøje. En abe nyre cellelinje, Vero, blev anvendt til at påvise forskellige virologiske assays. Zika viral replikation kinetik kan variere i celler af forskellige væv og arter. Yderl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
