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생물학

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Langzeitstudie des Herzens bei Kleintieren trägt eine Vielzahl von menschlichen verwandte kardiovaskuläre Erkrankungen zu verstehen, wie Gen – 1,2 angeborener Herzfehler bezogen. In den vergangenen Jahrzehnten von verschiedenen Tiermodellen, wie Maus 3,4, Xenopus 5,6, Zebrabärbling 7,8, Vogel- 9 und Drosophila 10-16, wurden verwendet , das menschliche Herz-Entwicklung im Zusammenhang mit Forschung zu betreiben. Das Maus – Modell wurde in großem Umfang mit dem menschlichen Herzen 3,4 studieren normalen und abnormalen Herzentwicklung und Herzfehler Phänotypen aufgrund ihrer Ähnlichkeiten verwendet. Der Embryo Xenopus ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Herzentwicklung aufgrund seiner einfachen Handhabung und Teiltransparenz 5,6. Die Transparenz des Embryos und der frühen Larve des Zebrabärbling – Modell ermöglicht eine einfache optische Beobachtung der Herzentwicklung 7,8. Das aviäre Modell ist ein gemeinsames Thema Entwicklungsherz Studien because kann das Herz leicht , nachdem sie die Eischalen Entfernen zugegriffen werden und die morphologische Ähnlichkeit der aviären Herzen auf den Menschen 9. Das Drosophila – Modell hat einige einzigartige Eigenschaften , die es ideal für die Durchführung Längsschnittstudien des Herzens zu machen. Erstens ist das Herz Rohr Drosophila ~ 200 & mgr; m unterhalb der dorsalen Oberfläche, die Bequemlichkeit für den optischen Zugang und die Beobachtung des Herzens liefert. Zusätzlich sind viele molekulare Mechanismen und genetischen Pfade zwischen Drosophila und Wirbeltieren konserviert. Die Orthologe von über 75% der menschlichen Krankheitsgene wurden in Drosophila gefunden , die es weithin 11,13 in transgenen Studien gemacht. Darüber hinaus hat sie eine kurze Lebensdauer und geringe Wartungskosten und 14-16 für Entwicklungsbiologie Forschung häufig verwendet als Mustermodell wurde.

In früheren Berichten beschrieben , die Protokolle zur Überwachung Drosophila Herzfunktionen wie erArtbeat. Jedoch wurden Verfahren Dissektion erforderlich 17,18. Optisches Abbildungs ​​bietet einen effektiven Weg Herzentwicklung bei Tieren aufgrund seiner nicht-invasive Natur zu visualisieren. Unterschiedliche optische Bildgebungsverfahren wurden bei der Durchführung von Tierherzstudie, wie Zwei-Photonen – Mikroskopie 19, konfokale Mikroskopie 20,21, Lichtbogenmikroskopie 22 und die optische Kohärenztomographie (OCT) 16,23-26 angewendet. Vergleichsweise ist Oktober der Lage große Bildtiefe in Kleintierherzen Bereitstellung ohne Kontrastmittel verwendet werden, während eine hohe Auflösung und das einen extrem hohen Bildgebungsgeschwindigkeit zu halten, die für die Bildgebung wichtig sind lebende Tiere. Darüber hinaus hat die niedrige Kosten ein OCT-System für die Entwicklung dieser Technik zur optischen Abbildung von Proben populär. Oktober wurde für die Langzeitstudie von Drosophila erfolgreich eingesetzt. Unter Verwendung Oktober hat Herz-morphologische und funktionelle Bildgebung der Herzstrukturen zu studieren, die Func ausgeführt worden isttionale Rollen von Genen, und die Mechanismen kardiovaskulärer Defekte in mutant Modelle während der Herzentwicklung. Zum Beispiel altersabhängige Abnahme der Herzfunktion wurde mit herunterreguliert Angiotensin-Converting – Enzym-bezogenen (ACER) Gen in Drosophila mit 27. Oktober bestätigt. Phänotypisierung von Gen im Zusammenhang mit Kardiomyopathie wurde in Drosophila mit Oktober 28-33 demonstriert. Forschung unter Verwendung von Oktober zeigte auch die funktionelle Rolle des menschlichen SOX5 Gen im Herzen von Drosophila 34. Im Vergleich zu Oktober verwendet OCM ein Objektiv mit einer höheren numerischen Apertur bessere Quer Auflösung bereitzustellen. In der Vergangenheit führte die Fehlfunktion des Herzens durch ein Ortholog menschlichen zirkadianen Gen dCry / dclock Silencing wurde mit einem benutzerdefinierten OCM – System 15,16 studierte, sowie den Effekt der fett-Diät auf Kardiomyopathien in Drosophila Fettleibigkeit induzierten Mensch zu verstehen Herzerkrankungen. 15

Hier the experimentelle Protokoll wird auf den zweiten Häutungsstadium (L2), dritten Häutungsstadium (L3), puppen Tag 1 (PD1), puppen Tag 2 (PD2), puppen Tag 3 (PD3) für Langzeitstudie der Herz morphologische und funktionelle Veränderungen in Drosophila zusammengefasst , Puppe Tag 4 (PD4), Puppe Tag 5 (PD5) und Erwachsenen (Abbildung 1) mit OCM Untersuchung der menschlichen bezogenen kongenitalen Herzerkrankungen zu erleichtern. Herzfunktionsparameter, wie HR und GAP wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien quantitativ analysiert, um die Herzentwicklung Merkmale offenbaren.

Protocol

1. Herstellung von OCM – System für die optische Bildgebung von Drosophila 16 Wählen Sie ein Spektrometer und ein Hochgeschwindigkeits – Zeilenkamera , die eine Bildrate von mindestens 80 Bilder / s bereitstellt , so wird das OCM System in der Lage sein , den Herzschlag von Drosophila zu lösen. Verwenden , um eine Breitbandlichtquelle , die axiale Auflösung von 2 & mgr; m , um sicherzustellen , das Herz Struktur Drosophila zu identifizieren. Ve…

Representative Results

Die Längsherzbildgebung wurde mit dem 24B-GAL4 / + Dehnung bei Raumtemperatur mit OCM mit den Fruchtfliegen durchgeführt. Messungen wurden bei L2, L3, und bei 8 Stunden Intervallen von PD1 bis PD4 und Erwachsenen Tag 1 durchgeführt (AD1) die Metamorphose – Verfahren (Tabelle 1) zu verfolgen. Larve, früh puppen, späte Puppe und erwachsenen Fliegen wurden auf den Glasobjektträger aufgebracht , wie in 1A gesehen. Die Segmentmerkmale des Herzens für Larven und erwachsenen Fliegen wur…

Discussion

Die schnellen Herzschlag von Drosophila, mit einem Maximum HR rund 400 bpm bei Larven und adulte Stadien, erfordert eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit der Herz Diastolen und Extrasystolen (nicht weniger als 80 Bilder / s auf den Erfahrungen basiert) zu lösen. Aufgrund der geringen Größe und Herzkammer micron Skala Herzwanddicke (von 5 bis 10 & mgr; m), eine hohe räumliche Auflösung (besser als 2 & mgr; m) wird zur Lösung der Herzrohrstrukturen erforderlich. In dieser Studie wurde eine hohe Auflö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
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References

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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
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