Summary
Restenose etter kardiovaskulære prosedyrer (bypass kirurgi, angioplastikk eller stenting) er et betydelig problem som reduserer holdbarheten av disse prosedyrene. En ideell terapi vil hemme proliferasjon av glatt muskelcelle mens den fremmer regenerering av endotelet. Vi beskriver en modell for samtidig vurdering av VSMC proliferasjon og endotelfunksjon in vivo.
Abstract
Arteriell rekonstruksjon, enten angioplastikk eller bypass-kirurgi, involverer iatrogen trauma som forårsaker endotelavbrudd og vascular glatt muskelcelle (VSMC) proliferasjon. Vanlige murine modeller studerer små fartøy som karoten og femorale arterier. Her beskriver vi et in vivo system hvor både VSMC proliferasjon og endotelbarrierefunksjonen kan vurderes samtidig i en stor beholder. Vi studerte infrarenal aorta respons på skade i C57BL / 6 mus. Aorta ble skadet fra venstre renalvein til aorta-bifurkasjon med 30 transmurale knusninger med 5 sekunder lang varighet med en bomullstipsapplikator. Morfologiske endringer ble vurdert med konvensjonell histologi. Aorta-veggtykkelsen ble målt fra luminalflaten til adventitia. EdU-integrasjon og tellerfarvning med DAPI og alpha-actin ble brukt til å demonstrere VSMC-proliferasjon. Aktivering av ERK1 / 2, en kjent moderator for intimal hyperplasi-dannelse, ble avskrekketUtvunnet av Western Blot-analyse. Effekten av betennelse ble bestemt ved immunhistokjemi for B-celler, T-celler og makrofager . En ansiktsseksjoner av endotelet ble visualisert med skanningelektronmikroskopi (SEM). Endotelbarrierefunksjonen ble bestemt med Evans Blue-farging. Transmural skade resulterte i aorta veggtykkelse. Denne skaden induserte VSMC proliferasjon, mest fremtredende ved 3 dager etter skade, og tidlig aktivering av ERK1 / 2 og redusert p27 kip1 ekspression. Skade resulterte ikke i økte B-celler, T-celler eller makrofager infiltrering i kargen veggen. Skade forårsaket delvis endotelcelle denudasjon og tap av cellecellekontakt. Skade resulterte i et signifikant tap av endotelbarrierefunksjonen, som returnerte til baseline etter syv dager. Den murine transmurale slanke aorta-skademodellen gir et effektivt system for samtidig å studere både VSMC-proliferasjon og endotelbarrierefunksjon i en stor beholder.
Introduction
restenose Følgende kardiovaskulære prosedyrer (bypass kirurgi, angioplastikk eller stenting) er et betydelig problem som reduserer holdbarheten av disse prosedyrene. Alle revaskulariseringsprosedyrer plages av restenose. Nåværende strategier for å hindre restenose (legemiddeleluerende stenter og medikamentbelagte ballonger) hemmer både vaskulær glattmuskelcelle (VSMC) og endotelcelleproliferasjon (EC). Følgelig forhindrer disse intervensjonene VSMC-mediert restose, men forhindrer også regenerering av endotelet. Uten intakt endotel skal pasienter være på potente antiplatelet midler for å redusere risikoen for in situ trombose med risiko for blødningskomplikasjoner. En ideell terapi vil hemme VSMC-proliferasjon samtidig som det fremmer regenerering av endotelet. Dermed er det et behov for samtidig å studere VSMC proliferasjon og endotelbarrierefunksjon i n vivo .
For tiden er det alvorligAl musemodeller av restenose 1 . Disse modellene inkluderer carotidligasjon og femoralt arterie ledningsskade 2 . Aorta modeller inkluderer stent plassering 3 , ballong skade 4 og aorta allograft 5 . Alle de nåværende modellene er begrenset. Carotidligering genererer en strømningsmediert neointimal lesjon og har ikke endotelskader. I tillegg har begge karotid- og femorale arterier mange ganger færre cellelag enn menneskeskap, og begrenser deres translasjonsverdi. Musaortaen som er ca. 1,3 mm i diameter, er det eneste fartøyet som tilnærmer seg en klinisk relevant (kransartet) menneskearterie (3).
Til tross for det translasjonelle potensialet for muse-aorta-modeller av sykdom, har nåværende modeller begrensninger. Disse modellene krever avanserte mikrokirurgiske ferdigheter og spesialisert utstyr som angioplastikkballonger og stenter. Her presenterer viEn roman, reproduserbar teknikk for samtidig å indusere VSMC proliferasjon og forstyrre endotelbarrierefunksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikkerklæring: Protokollene for dyrehåndtering ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC) ved University of Maryland (protokollnummer 0416009) og utført i henhold til AAALAC-internasjonale standarder.
1. Kirurgisk Prosedyre
- Anestetisk teknikk
- Steriliser alle instrumenter som brukes i overlevelsekirurgi med dampsterilisering ved 121 ° C i 30 minutter.
- Induktor anestesi via en induksjonstank med 100% O2 og 2,5% isofluran levert via presisjonsfordampning. Post-induksjon, avbryte isofluran og skyll kammeret med O2. Oppretthold anestesi med 1,5-2% isofluran via ansiktsmaske og 1 L / min O 2 ved innånding.
- Fest både induksjonskammeret og ansiktsmasken til en kullavleser for avgassadsorpsjon for å beskytte personell. Sørg for et tilstrekkelig bedøvelsesplan ved demonstrasjonAting at det ikke er noe svar på skadelige stimuli (tå klemme).
- Opprett et operativt felt som består av en kirurgisk skuff med isotermisk pute for å gi termisk støtte under operasjonen. En ekstra isotermisk pute vil gi termisk støtte til dyr i gjenvinningsburet.
- Dyrepreparasjon
- Utfør følgende undersøkelse på 10-12 uker gamle mannlige C57BL / 6-mus.
- Fjern håret på den ventrale abdominale overflaten av dyret fra brystbenet til inngangsregionen med et avskallingsmiddel eller en elektrisk klipper med et nummer 40 blad.
- I tilfelle depilatory agent, bruk denne forbindelsen til kirurgisk område i 2-3 minutter og fjern den deretter med bomull. Vi bruker en kommersielt tilgjengelig forbindelse av kalsiumhydroksyd og natriumhydroksyd.
- Forbered området over skulderen med 70% alkohol og injiser carprofen (5 mg / kg) med en 25 gauge eller mindre boringsnål. DetteBehandling vil gi postoperativ analgesi for dyret.
- Overfør dyret til det kirurgiske feltet og posisjon i dorsal recumbency.
- Forbered det kirurgiske stedet ved å skru 8-12% providone-jod med en ren bomullsapplikator eller bomullsgass. Skyll deretter huden to ganger med 70% alkohol.
- Plasser okulært smøremiddel i begge øynene for å redusere forekomsten av hornhindefortynding. Dekk det kirurgiske området med en steril drap.
- Operativ teknikk
- Lag et median abdominal laparotomi snitt ca 2-2,5 cm i lengden med en skalpell begynnelse umiddelbart caudal xiphoid prosessen og strekker seg mot bekkenet.
- Mobiliser tarm og tolvfingertarmen og reflekterer lateralt til høyre. Rull opp en strikke med steril bomull som er gjennomsyret og gjennomvåt med steril saltvann til injeksjon for å tillate pakking av viskelen for å forbedre eksponeringen.
- Med tynntarm mobilisert til høyre side avMage, eksponere retroperitoneum og eksponere abdominal aorta fra venstre renalven til aorta-bifurkasjonen ( Figur 1 ).
- Med en steril bomullstipsapplikator, lever 30 påfølgende knusninger, hver fem sekunder i varighet.
- Fjern pakningen og la viskaen gå tilbake til sin opprinnelige posisjon.
- Lukk fascia med en løpende 4-0 absorberbar monofilament sutur (polydioxanon). Hud er lukket med en løpende 6-0 ikke-absorberbar monofilament sutur (nylon).
- Gjenoppretting og etterbehandling
- Etter prosedyren legger du dyret i en gjenvinningsbur med rent sengetøy på en isotermisk pute for å fortsette termisk støtte til dyret kan ambulere normalt. Ikke la dyret være uten tilsyn før det demonstrerer evnen til å opprettholde sternal recumbency.
- Overvåk dyret hver time for de første 4 t etter operasjonen. Når dyret er ambulerende, returnerer jeg normalt jeg T til det tildelte oppdrettsrommet. Dyret vil ikke bli plassert i selskap med et annet dyr til det er fullstendig gjenopprettet.
- Overvåk dyret to ganger daglig i de første 72 timer etter operasjonen og minst 3 ganger i uken etterpå. Overvåking inkluderer veiing dyret tre ganger i uka.
- Administrer karpofen (5 mg / kg) subkutant to ganger daglig i de første 72 timer etter operasjonen.
2. Anskaffelse av væv
- Metoden for eutanasi
- Euthanize dyrene på forhåndsbestemte tidspunkter.
- Induktor anestesi via en induksjonstank med 100% O2 og 2,5% isofluran levert via presisjonsfordampning.
- For å studere integriteten til endotelet, administrer Evans Blue farge til dyret.
MERK: Evans Blue er et negativt ladet azo-fargestoff med høy bindingsaffinitet for albumin og kan bare flekke blodkar i fravær av intakt endotelS = "xref"> 6. - For endotel-integritetsstudier, på tidspunktet for eutanasi, perfeksjonere dyrene med 5 ml 0,3% Evans Blue-farge etterfulgt av 5 mL PBS ved fysiologisk trykk i 5 min. Dyret opprettholdes i et kirurgisk plan av anestesi under perfusjonsprosedyren.
- For å studere integriteten til endotelet, administrer Evans Blue farge til dyret.
- Etter å ha oppnådd et dyp bedøvelsesplan, åpne brystet med sternotomi. Lag en lacerasjon i det høyre atriumet for å tillate drenering av blod fra dyret og tilgang til venstre ventrikkel er tilgjengelig med en 21 G nål og injiser fosfatbuffet saltløsning (PBS) til avløp fra høyre atrium er klart.
- Etter perfusjon med PBS, gå inn i magen gjennom en midtlinje snitt.
- Nok en gang mobiliser tynntarmen til høyre side av abdomen som eksponerer infrarenal aorta, skar disser aorta fra tilstøtende vev og fjerner det fra venstre renalven til aorta-bifurkasjonen.
- Oppbevar excised aorta i en 4% paraformaldEhydopløsning inntil vevsbehandling skjer.
- For endotel-integritetstudier, åpne aorta i lengderetningen og pin den til et voksark som eksponerer helheten av luminaloverflaten 6 . Utfør en kvalitativ vurdering av endotelintegritet ved graden av farging med Evans Blue dye 6 .
- For andre histologiske analyser, del aorta på tvers og legg det inn i optimale skjære temperatur (OCT) forbindelser som diktert av den histologiske metoden som skal brukes 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tverrsnitt aorta innebygd i OCT ble snittet og farget med hematoksylin og eosin, og deretter tellert farget med Verhoeff-Van Gieson (VVG) flekk for å identifisere det indre og ytre elastiske laminat 7 . Kryssskade forårsaket aorta-veggtykkelse sammenlignet med aortaene av dyr behandlet med en sham-prosedyre (laparotomi og liten tarmmobilisering alene). Veggtykkelse, som vurderes av avstanden fra adventitia til lumen, var størst tre dager etter skade (42,2 ± 1,7 μm vs 22,1 ± 1,1 μm for laparotomi alene) ( Figur 2A-B ). Skade resulterte i at cellene hadde et mer avrundet utseende og en uregelmessig kontur av den luminale overflaten ( figur 2C ).
Økt veggtykkelse av den skadede aorta er i det minste delvis formidlet av økt proliferasjon av medial vaskulær glatt musCle celler. For å bevise at veggtykkelse skyldes økt proliferasjon i motsetning til cellehypertrofi, brukte vi en EdU-proliferasjonsanalyse. I denne analysen administreres tymidinanalogen 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) intravenøst til musen 24 timer før eutanasi. EdU er innarbeidet i DNA under syntesen. EdU detekteres ved en klikkreaksjon (kobberkatalysert azide-alkynesykloaddisjon ved bruk av grønt-fluorescerende fargestoff) 8 . Sham-mus utsatt bare for laparotomi hadde ingen observert fluorescens i et hvilket som helst lag av aorta. Conversley, mus som ble utsatt for aorta-skade, viste fluorescens i både media og intima av aorta ( figur 3 ).
Aortisk veggtykkelse etter crush-skade aktiverer cellesignalveier implisert i restenose hos mennesker. Den mitogenaktiverte proteinkinasen (MAP Kinase) ERK1 / 2 er en av prinsippens mediatorer for intimal hyperplasi-dannelseSom respons på stimulering fra et mitogen fosforyleres ERK1 / 2 og aktiveres 9 , 10 . Data fra laboratoriet har også vist at den syklin-avhengige kinaseinhibitoren p27 kip1 er redusert som respons på mitogene stimuli i kargenvegg 12 . Mus ble euthanisert på 1, 3, 7 dager og 1 måned etter aorta-knusskade. Infrarenal aorta ble isolert og proteinuttrykk av ERK1 / 2, fosfor-ERK1 / 2 (den aktiverte formen av ERK1 / 2), og den cyklinavhengige kinaseinhibitoren p27 kip1 ble bestemt ved Western blot-analyse ( Figur 4A ). Ingen endring ble observert i totalt ERK1 / 2 proteinuttrykk over tid. Imidlertid var fosfor-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) tre dager etter skade over 200% større enn baseline Pi-ERK1 / 2-ekspresjon. P27 kip1- uttrykket ble redusert ved tidlige tidspunkter og nådde en nadir på ca. 20% av baseline sju dager avTer skade. Både Pi-ERK1 / 2 og p27 kip1 ekspresjon tilnærmet baseline nivåer en måned etter skade ( figur 4B ). Således er den observerte fortykning av aortaväggen i det minste delvis på grunn av økt medial proliferasjon.
Aorta-skademodellen tillater samtidig vurdering av både medial glatt muskelproliferasjon og endotelbarrierefunksjon. Skanningelektronmikroskopi (SEM) ble brukt til å karakterisere effekten av crush-skaden på endotelets morfologi. Den luminale overflaten av aorta er foret med et sammenflytende endotel som forhindrer vedheft av blodfødte celler og molekyler ( Figur 5A , Skalestang = 100 μm). I motsetning hevder crush-skade i forstyrrelse av endotelceller og delvis denudasjon av endotelet ( Figur 5B , Scale bar = 100 μm). Som vist ved høyere forstørrelse, resulterer forstyrrelse av endotelet i adhesjonPå partikler som er konsistente i størrelse og form med blodplater. Adhesjon av disse partiklene skjer gjennom hele soneområdet, og er ikke begrenset til områder med brutal denudasjon observert ved lavere forstørrelse ( Figur 5C , Skala bar = 50 μm). Morfologien til den adherente partikkelen blir best observert ved høyere forstørrelse. Disse partiklene er konsistente med blodplater og fibrin ( Figur 5D , Scale bar = 10 μm).
I tillegg til endotelmorfologi, kan endotelens barrierefunksjon vurderes med denne modellen av vaskulær skade. Azo-fargestoffet Evans Blue kan ikke gjennomsyre det normale, intakte endotelet i den murale aorta. Skader på endotelens barrierefunksjon tillater farging av kjellermembranen med Evans Blue. Mus behandlet til en laparotomi alene (sham) opprettholdte barrierefunksjonen i endotelet og disse aortaene var hvite. Crush skade resulterte i aDiffust tap av endotelbarrierefunksjonen og disse aortaene er farget mørkblått. Intensiteten av flekker med Evans Blue ble redusert tre dager etter knusskade, og full barrierefunksjon ble gjenopprettet i uke etter skade ( figur 6A ). Endotelbarrierefunksjonen kan kvantifiseres ytterligere ved å veie prøvene og homogenisere i 10 ganger volum 50% trikloreddiksyreoppløsning. Fortynning av supernatanten i fire ganger etanol tillater bestemmelse av fluorescensintensitet (eksitasjon 620 nm og utslipp 680 nm) som beskrevet av Aoki et al . 11 . Mengden Evans Blue eluert fra infrarenal aorta var over tre ganger høyere i aorta umiddelbart etter skade sammenlignet med aorta utsatt for laparotomi (Skadet - Dag 0). Aorta fortsatte å plette med Evans Blue på en og tre dager etter skade, men mindre intens enn ved skade, noe som tyder på en gradvis gjenoppretting av endotelbarrierefunksjonen. En uke akterEr skade den skadde aorta hadde ekvivalent farging som en aorta behandlet med laparotomi alene ( figur 6B ).
Figur 1: Skade er opprettet ved å knuste aortaen helt fra venstre renalve til aortabifurkasjonen. Figur tilpasset med tillatelse fra Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Crush Injury Induces Aortic Wall Thickening. ( A ) Knusskade forårsaket morfologiske endringer i aorta. Representative 5 μm tverrsnitt ble farget med VVG ved 0,1, 3 og 7 dager etter skade. Skalestenger = 100 μm. ( B ) Veggtykkelsen var størst 3 dager etter skade, 42,2 ± 1,7 μm, og var signifikant større enn aorta av skjelvdyr utsatt for laparotomi alene, 22,1 ± 1,1 μm. Statistisk betydning ble bestemt ved Studentens to-hale t-test. * Betegner p <0.05, n = 3. ( C ) Knusskade forårsaket et avrundet utseende av mediale VSMCs (farget i grønt for a-glatt muskelaktin) og endring av celleorientering. Nuclei ble motstilt med DAPI (Blue). Skalestenger = 10 μm. Data presenteres som middel og standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Crush Injury inducerer Cell ProlifeRasjon i Aortic-veggen. Mus ble utsatt for enten laparotomi alene (sham) eller laparotomi med aorta crush skade. Thymidinanalog 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) ble administrert 24 timer før eutanasi. EdU er innarbeidet i DNA under syntesen. EdU detekteres ved en klikkreaksjon (kobberkatalysert azide-alkynesykloaddisjon ved bruk av grønt-fluorescerende fargestoff). Det var ingen påviselig EdU (grønn) i aorta-veggen av de skamdyrene. I dyrene som ble utsatt for knusskade, blåste EdU fremtredende i aorta og i noe mindre grad i intima. Vaskulære glatte muskelceller ble identifisert ved farging med a-glatt muskelaktinantistoff (rødt). Dette funnet antyder at den observerte veggtykkelsen observert i figur 2 skyldes en økning i celleproliferasjon. Skalestenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figurene.
Figur 4: Den Mitogen-aktiverte Proteinkinase (MAP Kinase) -banen er aktivert som svar på Crush Injury. ( A ) MAP Kinase ERK1 / 2 er fosforylert når aktivert og er assosiert med intimal hyperplasi og restenose. Mus ble euthanisert på 1, 3, 7 dager og 1 måned etter aorta-knusskade. Western blot-analyse ble brukt til å vurdere proteinuttrykk av totalt ERK1 / 2, fosfor-ERK1 / 2 og den cyklinavhengige kinaseinhibitoren p27 kip1 . Proteinuttrykk ble normalisert til et skamdyr behandlet med laparotomi alene. ( B ) Ingen endring ble observert i totalt ERK1 / 2 proteinuttrykk over tid. Imidlertid var fosfor-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) tre dager etter skade over 200% større enn baseline Pi-ERK1 / 2-ekspresjon. P27 kip1 uttrykk redusert ved tidlige tidspunkter anD nådde en nadir på ca. 20% av baseline sju dager etter skade. Både Pi-ERK1 / 2 og p27 kip1 ekspresjon tilnærmet baseline nivåer en måned etter skade. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Crush Skade forstyrrer aorta endotelceller. ( A ) Skanningelektronmikroskopi (SEM) ble brukt til å karakterisere effekten av crush-skaden på endotelets morfologi. Den luminale overflaten av normal aorta er foret med et sammenflytende endotel som forhindrer vedheft av blodfødte celler og molekyler. ( B ) Crush skade resulterer i forstyrrelsen av endotelceller og delvis denudasjon av endotelet. ( C ) Som sett på høyere magnificaForstyrrelse av endotelet resulterer i adhesjon av partikler som er konsistente i størrelse og form med blodplater. Adhesjon av disse partiklene skjer gjennom hele soneområdet, og er ikke begrenset til områder med brutal denudasjon observert ved lavere forstørrelse. ( D ) Ved høyere forstørrelse er disse partiklene konsistente med blodplater og fibrin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Blunt aorta-skaden tillater kvantifisering av endotelbarrierefunksjonen. ( A ) Skader på endotelens barrierefunksjon tillater farging av kjellermembranen med Evans Blue-fargestoff. Mus behandlet til en laparotomi alene (sham) opprettholdte barrierefunksjonen til endotelet og thEse aorta var hvite. Knusskade forårsaket et diffust tap av endotelbarrierefunksjonen og disse aortaene ble farget mørkblått. Intensiteten av flekker med Evans Blue ble redusert tre dager etter knusskade, og full barrierefunksjon ble restaurert i uke etter skade. ( B ) Binding av Evans Blue til infrarenal aorta ble kvantifisert ved å eluere Evans Blue fra prøven og kvantifisering ved fluorescensintensitet. Data presenteres som middel og standardavvik. Den mest Evans Blue ble eluert fra aorta umiddelbart etter knusskade. På skadetid bundet aorta tre ganger ganger mer Evans Blue enn aorta utsatt for laparotomi alene. Da aorta fikk lov til å gjenopprette, var det mindre bindende en og tre dager etter skade. En uke etter skade bundet aorta samme mengde Evans Blue som aortaene som ble utsatt for laparotomi alene. Statistisk betydning ble bestemt ved Studentens to-hale t-test. * DeNotater p <0,05, n = 3, NS betyr ikke signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har karakterisert effekten av en muse-aortisk skade modell som resulterer i medial hyperplasi og endotel barriere dysfunksjon. Delvis EC-frigjøring langs aorta-intima ledsaget av tap av cellecellekontakt og forbedring av cellefremspring. Tilsvarende var endotelbarrierefunksjonen signifikant svekket, noe som stimulerte de mitogenfølsomme signalveiene, noe som førte til proliferasjon av VSMC og fortykkelse av karvegveggen. Styrken i denne modellen er at det er teknisk lettere å lære og utføre enn andre aorta-modeller av sykdom og muliggjør samtidig vurdering av både proliferativ respons på skade og endotelfunksjon. Det kritiske trinnet i denne protokollen er den faktiske knusskade. Variabilitet i omfanget av crush skade kan resultere i varierende grader av skade og dermed variable mengder glatt muskel celle proliferation. Ett trinn som reduserer denne variabiliteten i laboratoriet vårt er å ha en sCientist, blindet til behandling eller eksperimentell tilstand, utfør alle de knuste skader.
En begrensning av denne modellen er dens generaliserbarhet til klinisk relevante humane sykdomsprosesser. Til tross for den tidlige robuste proliferative responsen av VSMCs i denne modellen, modelliserer den ikke senesendene av restenose, det vil si ingen neointima utviklet. Reduserte inflammatoriske mediatorer som cytokiner kan regulere denne prosessen. Dette funnet kunne skyldes den raske utvinningen av endotelet fra en delvis skade. I likhet med en tidligere rapportert vaskulær crush injury modell i kaniner 13 , var infiltrasjon av immunceller mindre. I den nåværende undersøkelsen evaluerte vi profilen av inflammatoriske cytokiner, skamdyrene og aorta-skadedyrene med profiler-gruppen. Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i cytokinprofilen som ville forklare forskjellen i den proliferative responsen mellom skam og skadede dyr (dataikke vist). Skaden beskrevet i denne rapporten er midlertidig begrenset. Mens andre modeller av aorta-skade og intimal hyperplasi som aorta-angioplastimodellen helt avslører endotelet, utelukker den foreliggende modellen bare delvis aorta. Fullstendig denudasjon av endotelet krever vesentlig lengre tid å gjenopprette, og disse dyrene opplever skadene i lengre tid.
Denne modellen produserer en rask respons av VSMC og EC til skade som muliggjør kvantifisering av morfologiske og biokjemiske endringer på en uke. Det er mer effektivt enn andre modeller som tar 14-28 dager før virkningen av intervensjon er tydelig. Denne modellen bruker den murine aorta som er det eneste murine karet som nærmer seg et klinisk relevant menneskefartøy. Den betydelige fordelen med denne teknikken sammenlignet med andre aortamodeller er at denne modellen er relativt lett å lære, og krever ikke dyrt eller vanskelig å skaffe ekvivalentUtlevering 2 , 3 , 4 , 5 . Som konklusjon gir den murine aorta-crush-skademodellen en teknisk enkel, billig og effektiv in vivo- plattform for samtidig å vurdere responsen av VSMC og EC til vaskulær skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble finansiert av Department of Veterans Affairs Career Development Award (1IK2BX001553-01) (TSM) og Vascular Cures EJ Wylie Scholarship (TSM).
Acknowledgments
Vi takker Hsia Ru-ching PhD, fra Electron Microscopy Core Facility ved University of Maryland School of Medicine, for hennes tekniske støtte i behandlingen av scannings elektroniske mikroskopi prøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
