이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 시험 관내 모델로서 널리 사용되어왔다. 그러나, CGN 배양에서 신경 교세포와 뉴런의 공존은 신경 세포 생존 능력의 정확한 평가에서 편차를 유발할 수있다. Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색법은 생존 및 사멸 세포를 동시에 평가함으로써 세포 생존력을 측정하는 데 사용되었습니다. 우리는 비색 분석법의 민감도를 향상시키고 CGNs의 신경 생존 능력을 평가하기 위해 FDA-PI 이중 염색법을 사용했습니다. 또한 정확도를 높이기 위해 청색 형광 DNA 얼룩 ( 예 : Hoechst)을 추가했습니다. 이 프로토콜은 CGN 문화에서 이러한 방법을 사용하여 연결 가능성의 평가의 정확성을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 형광 현미경을 사용하여 glial 세포의 수를 제외 할 수 있습니다. 비슷한 전략을 적용하여 원치 않는 gli를 구별 할 수 있습니다.대뇌 피질의 배양 및 해마 배양과 같은 다양한 혼합 세포 배양에서 뉴런의 알 세포.
서론
3- (4,5- 디메틸 -2- 티아 졸릴) -2,5- 디 페닐 -2-H- 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석과 같은 비색 세포 독성 분석은 일반적으로 시험 관내에서 세포 생존력을 측정하는 데 사용됩니다. 쥐의 일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 이온, 과산화수소 및 글루 탐 산염 1,2를 비롯한 다양한 신경 독소에 민감합니다. 따라서 CGN 배양 물은 신경 과학 분야 의 시험 관내 모델로 사용될 수 있습니다. CGN 배양 물은 CGN 배양에서 총 세포의 약 1 %를 차지할 수있는 뉴런 및 신경교 세포를 포함하는 다양한 세포를 함유 할 수있다. 그러나 신경 교세포는 뉴런에 비해 신경 독소에 다르게 반응하여 비색 분석 3 에 의해 측정 된 신경 세포 생존력에 편향을 일으 킵니다.
살아있는 세포에서 Fluorescein diacetate (FDA)는 에스 테라 제에 의해 플루 오레 신으로 전환 될 수 있습니다.Propidium Iodide (PI)는 죽은 세포를 통과 한 후 DNA와 상호 작용할 수 있으며 배양 물 내에서 세포 사멸을 나타내는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 FDA-PI 이중 염색은 생존 가능한 세포와 죽....
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프로토콜
모든 절차는 실험실 동물의 관리와 사용을위한 국립 보건원 (NIH) 안내서 (NIH Publications No. 80-23, 1996 년 개정)를 따르고 Ningbo University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) SYXK-2008-0110).
1. 솔루션 및 문화 미디어의 준비
참고 : 시약 및 스톡은 무균 조건에서 준비해야합니다. 구멍 크기가 0.22 μm 인 필터를 사용하여 필터링하여 소독하십시오.
- 이중 증류수 (ddH 2 O) 10 ML에 PLL 5 MG를 추가하여 Poly-L-Lysine (PLL) 스톡 솔루션을 준비하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 PLL 스톡 솔루션을 몇 달 동안 저장하십시오.
- Krebs 완충액에 NaCl 7.25g, KCl 0.4g, NaH2PO4 0.14g, D- 글루코스 2.6g 및 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 5.94g을 100mL의 ddH2 </ sub> O. 필터링을 통해 소독하십시오. 한 달 동안 4 ℃에서 Krebs 완충액을 보관하십시오.
- Mg2SO4 3.82 g을 dd....
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결과
GAP43 (적색)과 GFAP (녹색)의 이중 immunostaining는 각각 신경 세포와 glial 세포의 모양을 분석하는 데 사용되었다 2 , 5 . 두 뉴런과 glial 세포는 CGN 문화에 존재합니다. GFAP 양성 glial 세포는 이미지의 화살표로 표시된대로 크고 불규칙한 모양입니다 ( 그림 1 ). 세포 활력에 대한 전통적인 분석은 신경 생존력을 측정하는 데 사용되는 경우 신경 세포와 신경 세포를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 신경 세포와 구강 세포를 구별 할 수있는 FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 정확한 평가에 유리하다.
낮은 칼륨 도전은 CGN 문화에서의.......
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토론
이 프로토콜은 앞에서 설명한 절차 6 , 7 에서 수정되었습니다. 연구원은 체외에서 일차 뉴런 을 배양 할 때 조건을 개선하여 비 신경 세포 성장을 줄이기 위해 시간을 보냈습니다. 그러나, 개선 된 배양 조건으로도, 일부의 신경아 교세포가 남아있다. 또한, 그들은 신경 세포의 성장과 성숙을 도와주기 때문에 비 연결 세포가 기본 신경 세포 배양에 필요합니다. 이 연구에서, Ara-C는 glial 세포의 성장을 최소화하는 데 사용되었지만, CGN 배양에서 여전히 glial 세포의 존재가 약 1 ~ 5 %는 있음에도 불구하고. 이 문제는 다른 그룹의 연구에서도 나타난다 10 . CGN 문화에서 glial 세포의 크기와 모양은 크게 뉴런과 다릅니다. CGN의 직경은 약 10 μm이며, 성숙한 CGN은 뉴런을 연결하는 풍부한 과정을 가지고 있습니다. 하우ve.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 절강 성 자연 과학 재단 (LY15H310007), 절강 성 비영리 기술 응용 연구 프로젝트 (2016C37110), 중국 국립 자연 과학 재단 (U1503223, 81673407), 닝보 국제 과학 기술 협력 프로젝트 (2014D10019), 닝보시 생명 과학 및 건강 혁신 팀 (2015C110026), 과학 기술 광동성 국제 협력 프로젝트 (2013B051000038), 심천 기본 연구 프로그램 (JCYJ20160331141459373), 광동 홍 (GHP / 012 / 16GD), 홍콩 연구 기금위원회 (15101014), 홍콩 폴리 테크닉 대학 (G-YBGQ), 닝보 대학의 KC 웡 마그나 기금 등이있다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 폴리-L-라이신(PLL) | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| 사이토신 &베타;-D-아라비노푸라노사이드 | Sigma | C1768 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 10099141 | 고품질 FBS는 배양에 필수적입니다 |
| 100x 글루타민 | Gibco | 25030081 | |
| 100x 항생제: | Gibco | 15240062 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate (FDA) | Sigma | F7378 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 항체 | Abcam | ab75810 | |
| 마우스 Anti-GFAP 항체 | Cellsignaling | 3670 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | 전에 팁 라운드를 태울 수 있습니다. |
| 12웰 세포 배양 플레이트 | TPP | Z707783 | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | TPP | Z707759 | 고품질 세포 배양 플레이트는 배양에 필수적입니다 |
| 필터 | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 mL | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 mL | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect 현미경 | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | 311 | |
| 형광 현미경 | Nikon | TI-S | |
| 형광 필터 및 방출 큐브 | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| 사진 소프트웨어 | Nikon | NIS-Elements | |
| 그래픽 편집기 소프트웨어 | Adobe | Photoshop CS | |
| 이미지 처리 소프트웨어 | NIH | ImageJ |
참고문헌
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al.
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재인쇄 및 허가
