우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Filopodia는 이동 및 세포 - 세포 통신과 관련된 동적 인 손가락 모양의 세포 돌출부입니다. 섬유 유두의 개시, 연신율 및 후속 안정화 또는 수축의 근본적인 복잡한 신호 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 이러한 동적 구조에서 시공간 단백질 활성을 결정하는 것이 중요합니다. Filopodia에서 단백질 기능을 분석하기 위해 우리는 최근에 filopodial 모양 변화에 적응하는 반자동 추적 알고리즘을 개발하여 전체 filopodial 길이에 따른 돌출부 역학 및 상대 단백질 농도의 병렬 분석을 허용했습니다. 여기서는 최적화 된 셀 처리, 이미지 수집 및 소프트웨어 분석을위한 자세한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 또한 이미지 분석 및 데이터 표현 과정에서 옵션 기능을 사용하는 방법에 대한 지침과 함께 중요한 모든 단계에 대한 문제 해결 지침을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 또한 dfilopodia 부량을 위해 유효한 다른 프로그램을 가진 escribed 영상 분석 소프트웨어. 함께 제시된 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 유두 돌출에서 단백질 역학의 정확한 분석을위한 프레임 워크를 제공합니다.
서론
actin 조절 단백질의 시공간 조절은 filopodium dynamics 1 , 2 와 관련이있다. 시간에 따른 전체의 유두 길이에 따른 공간적으로 분석 된 단백질 농도를 추적하는 것은 이러한 동적 구조의 개시, 신장, 안정화 또는 붕괴의 기초가되는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 증진 시키는데 중요하다 3 , 4 . 세포 모양의 변화가 더 큰 규모에서 일어나는 세포질에서의 단백질 분석과는 달리, filopodia는 끊임없이 5 번 굴곡하여 선형 주사와 같은 간단한 접근법을 사용하여 분석을 방해하는 동적 인 미세 구조이다.
유두 모양 추적을위한 다양한 소프트웨어 솔루션을 사용할 수 있습니다 6 , 7 , 8 , 9 . 유사성ise, 세포 동체 내에서 단백질 동역학....
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프로토콜
1. 세포 배양
- 4.5g / L D- 글루코오스, L- 알라닌 -L- 글루타민 디 펩티드, 피루 베이트, 10 % 소 태아 혈청 및 10 유닛 / ml 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중의 HeLa 또는 COS 세포 배양. 0.5 mM L- 알라닌 -L- 글루타민 디 펩티드, 무 혈청 신경원 보충제 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 10 단위 / ml가 보충 된 L- 글루타민, 글루탐산 또는 아스파르트 산이없는 배지에서의 배양 뉴런.
- 40 %의 confluency가 도달되면 제조 업체의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 선택의 구조로 세포를 transfect하십시오. 37에서 배양기에 transfected 세포를 유지 ° C와 5 % CO 2 15-18 시간.
- 이미지 수집 중 산도와 삼투압의 변화를 줄이려면 37 ℃에서 미리 90 %까지 세포 배양 챔버를 채우십시오 (예 : 20 mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1) -1 (HEPES)를 포함한다. 밀봉뚜껑 안쪽에 얇은 진공 그리스를 묻혀 트랜 스펙 션 된 세포가 들어있는 배양기에서 가볍게 누릅니다.
2. 이미지 수집
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결과
섬유질 악틴 (f-tractin 18 , 빨간색)과 세포질 참조 (녹색)에 대한 마커로 형질 감염된 COS 세포를 사용하여 우리는 액틴 풍부 유두 돌출을 발견했습니다 ( 그림 3A , 상단 패널). 시계열은 filopodia가 빠르게 늘어나고 철회하는 것을 보여 주었다 ( 그림 3A , 가운데 패널). 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 우리는 개별적인 사상충을 추적했습니다. 손으로 측정 한 유두 길이와 이미지 분석 소프트웨어를 비교 한 결과 피어슨 상호 상관 값은 0.947이었고 소프트웨어가 섬유 유성 확장을 신뢰할 수있게 추적했다고 주장했다. 개별 filopodia의 성장과 retraction 속도 이외에, 그림 3A 의 하단에 kymographs
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토론
여기에 우리는 철근 - 성장 알고리즘을 통해 이러한 동적 구조에서의 상대 단백질 농도 분석과 생식기 성장 역학을 추적하기위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 최대 3 개의 채널을 한 번에 쌍으로 비교할 수 있으므로 두 채널 ( 즉, 단백질)의 상대적 농도가 확장 / 수축 사이클 전체에서 결정되고 이미지 파일과 데이터 파일로 별도의 폴더에 저장됩니다. 일상적인 작업 외에도 소프트웨어는 각 실험에 대한 분석을 최적화하기 위해 수정할 수있는 많은 매개 변수를 제공합니다. 이러한 수정 및 문제 해결에 대한 자세한 설명은 프로토콜 섹션과 표 1 에서 확인할 수 있습니다.
이미지 분석은 특정 현미경 유형에 국한된 것이 아니라 시계열의 이미지 품질에 의해 제한됩니다. 관련성을 고려하면 이미지 품질은획득하는 동안 채널이 잘못되었습니다. 우리의 실험은 알고리즘이 40X 이상의 배율과 픽셀 비닝 (pixel binning)이.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 DFG (EXC-1003에서 MG까지)의 자금 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% 소 태아 혈청 | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% 페니실린/스트렙토마이신 | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M 재고 솔루션) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz 연구소 DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 세포 | 라이프니츠 연구소 DSMZ | ACC-59 | |
| 현미경 | 니콘 이클립 | ||
| 카메라 | Andor | DU888 울트라 | |
| 컨포칼 유닛 | 요카가와 | CSU-X1 | |
| 피루브산 | Gibco | 31966-021 |
참고문헌
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U.
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재인쇄 및 허가
