동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스
July 11th, 2017
우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.
이 이미지 분석 소프트웨어의 전반적인 목표는 전체 필로포디알 길이를 따라 돌출 역학 및 상대 단백질 농도를 병렬로 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포 생물학의 핵심 질문, 특히 filopodia의 확장 및 수축에 관여하는 개별 단백질을 이해하는 데 실제로 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제공되는 적응형 형상 추적 알고리즘을 통해 돌출 역학 및 공간적으로 해결된 단백질 국소화에 대한 정량적 평가가 가능하다는 것입니다.
먼저, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 보충된 배지에서 뉴런, HeLa 또는 COS 세포를 배양합니다. 40%confluency에 도달하면 제조업체의 지침에 따라 transvection 시약을 사용하여 선택한 구조로 세포를 transvect합니다. 형질주입된 세포를 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이터에 15-18시간 동안 보관합니다.
배양 후 20밀리 몰 HEPES를 함유한 섭씨 37도의 예열 배지로 세포 배양 챔버를 최대 90%까지 채워 이미지 획득 중 증발로 인한 pH 및 삼투압 변화를 줄입니다. 뚜껑을 밀봉하려면 뚜껑 내부에 진공 그리스를 얇게 바르고 transvected 세포가 들어있는 배양 챔버를 부드럽게 누릅니다. 이미지 분석에서 가장 중요한 부분은 아마도 이미지 품질일 것입니다.
우리가 주의해야 할 한 가지는 신호 대 잡음비인데, 이 비율은 4 이상이어야 하며 카메라의 노출 시간과 레이저 강도 및 힘을 조정하여 프레임 속도가 1헤르츠 이상이 되어야 한다는 것을 보장할 수 있습니다. 픽셀 벤딩이 없는 60x 또는 100x 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 1헤르츠 이상의 획득 속도를 사용하여 필로포디얼 역학을 추적합니다.
초점이 맞지 않는 아티팩트를 최소화하려면 기저막에 가까운 필로포디얼을 이미지화합니다. 원활한 추적을 위해 신호 대 잡음비가 4보다 커지도록 카메라의 노출 시간과 레이저 강도를 조정하십시오. 이 작업이 완료되면 이미지 획득을 시작합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미지 사전 처리 후에는 이미지 분석에 필요한 모든 파일이 포함된 압축 폴더를 다운로드하여 이미지를 로드합니다. 파일의 압축을 풀고 작업 폴더에 복사합니다. 설치가 완료되면 filopodiaAnalysisM3.fig라는 파일을 열어 그래픽 사용자 인터페이스를 시작합니다.
개별 단백질에 대해 저장된 stack TIFF 파일을 그래픽 사용자 인터페이스 또는 GUI에 로드합니다. 단백질 A의 경우 1B, 단백질 B의 경우 1C, 선택적으로 단백질 C의 경우 1D 버튼을 사용하여 1A를 클릭하여 단백질 채널에서 세포의 중첩 이미지를 만듭니다. 그런 다음 2A를 클릭하여 첫 번째 프레임을 할당하고 2B를 클릭하여 분석을 위한 마지막 프레임을 할당합니다.
선택적으로, 2H 버튼을 사용하여 관심 있는 필로포듐을 포함하는 관심 영역 또는 ROI를 자릅니다. 2I 버튼을 사용하여 이미지를 회전하거나 자유 그리기 도구인 2J를 사용하여 원하지 않는 영역을 삭제합니다. 품질 관리를 위해 각 프레임에 대해 슬라이더를 2C씩 이동하고 전체 영화에서 필로포듐이 명확하게 보이는지 확인합니다.
추적을 생성하려면 먼저 GUI 창 1에서 3A 버튼을 클릭하여 GUI 창 2를 엽니다. GUI 창 2에서 4개의 버튼을 클릭하면 1A를 클릭한 후 GUI 창 1에서 생성된 중첩된 세포체의 질량을 생성합니다. 실험 데이터 세트에 대한 세그먼트 수, 스캔 너비 및 스캔 반경과 같은 매개변수를 최적화하는 데 시간을 할애하는 것이 좋습니다.
두 번째 창의 슬라이더를 이동하여 필로포디얼 팁이 처음 나타나는 위치를 확인합니다. 그런 다음 버튼 5를 클릭하면 커서가 나타납니다. 커서를 사용하여 filopodial tip의 거리가 측정되는 베이스를 선택합니다.
그 다음에는 그것이 처음 나타나는 프레임의 filopodia의 끝이 있습니다. 다음으로, 6C를 사용하여 filopodia가 구부러질 임계값 길이를 선택합니다. 그런 다음 상자 6A에서 필로포디아의 모양을 근사화하는 데 사용되는 세그먼트 수를 지정합니다.
수평 스캐너 역할을 하는 스캔 너비를 지정하여 노드를 6B에 배치합니다. 상자 6D에서 스캔 반경을 지정하고, 관찰된 프레임 간 팁 변위보다 약 50% 큰 값을 사용합니다. 그런 다음 상자 6E에서 굽힘 각도를 지정합니다.
GUI 창 2에서 상자의 이력 추적을 선택하여 나중에 참조할 수 있도록 전체 추적 프로토콜을 저장한 다음 추적 및 분석 버튼을 클릭하여 추적을 시작합니다. 공간 시간 분석의 경우 8B로 표시된 상자를 선택한 다음 관심 있는 단백질 채널을 선택합니다. 8A를 클릭하면 이전에 생성된 추적을 사용하여 필로포디알 길이를 따라 단백질 추적을 시작할 수 있습니다.
비율계량 단백질 분석의 경우 9B 또는 9C를 선택하고 9A 버튼을 클릭하여 공간 시간 비율계량 플롯을 가져옵니다. 필로포디얼 팁 분석을 수행하려면 8F에 확인란을 선택하고 8G 및 8H를 사용하여 베이스에서 팁 길이와 임계값 길이를 지정합니다. 푸시 버튼을 클릭하여 dynamics.xlsx라는 이름의 엑셀 파일에 데이터를 저장합니다.
그런 다음 단백질 강도 분석을 클릭하여 필로포디알 팁의 단백질 강도 트레이스를 생성하고 비율 계량 분석을 위해 저장합니다. 9D 또는 9E를 사용하여 분석할 원하는 비율을 클릭합니다. 마지막으로 비교 버튼 9A를 클릭하여 비율계량 데이터를 생성합니다.
빨간색의 필라멘트 액틴 마커와 녹색의 세포질 참조로 transveced COS 세포를 분석하면 액틴이 풍부한 filopodial 돌출부가 나타납니다. 시계열은 액틴이 풍부한 필로포듐 돌출부가 빠르게 확장 및 수축하는 것을 보여줍니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 개별 filopodia를 추적했습니다.
이미지 분석 소프트웨어는 필로포디아의 성장 및 수축률 외에도 필로포디아 확장을 안정적으로 추적하며, 화학 그래프는 세포질 참조로 정규화된 액틴의 농도를 보여줍니다. 이 기술을 적절하게 사용하면 filopodia를 따라 돌출 역학 및 공간적으로 분해된 단백질 농도의 정량적 분석이 가능합니다. 절차를 시도할 때 획득 속도를 기억하고 신호 대 잡음비를 4 이상으로 유지하면서 개별 이미지를 포화시키지 않는 것이 중요합니다.
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개요
이 기사는 동적인 세포 돌출물을 따라 단백질 농도를 반자동으로 추적하기 위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다. 이 소프트웨어는 돌출물 동태 및 단백질 국소화의 병렬 분석을 가능하게 하여 세포 생물학에 대한 이해를 향상시킵니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 영상 분석
- 단백질 동태
배경
- 돌출물 동태 이해는 세포 생물학에서 중요합니다.
- 필로포디아는 세포 연장 및 수축에 중요한 역할을 합니다.
- 단백질 국소화의 정량적 평가는 세포 과정 연구에 필수적입니다.
- 적응형 모양 추적 알고리즘은 분석 정확도를 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 필로포디아를 따라 단백질 농도를 분석하는 방법을 개발합니다.
- 돌출물 동태에 관여하는 단백질에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 세포 행동을 연구하는 연구자들에게 도구를 제공합니다.
사용된 방법
- 보충된 배지에서 뉴런, HeLa, 또는 COS 세포를 배양합니다.
- 형질전환 시약을 사용하여 플라스미드를 세포에 도입합니다.
- 형질전환된 세포를 37°C 및 5% CO2에서 15-18시간 동안 배양합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 단백질 농도 및 돌출물 동태를 추적합니다.
주요 결과
- 소프트웨어는 단백질 국소화의 정량적 평가를 가능하게 합니다.
- 세포 돌출물의 동태에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 적응형 추적은 측정의 정확도를 향상시킵니다.
- 이 방법은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
결론
- 개발된 소프트웨어는 단백질 동태 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
- 세포 돌출물 및 수축 메커니즘 이해를 돕습니다.
- 이 방법은 세포 생물학 분야의 향후 연구를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cell migration and signaling. This semi-automated image analysis workflow enables spatially resolved, reproducible measurement of protein localization and protrusion dynamics, supporting predictive confidence in target validation. Integrating such adaptive tracking tools strengthens portfolio triage by providing robust, quantitative outputs for mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein function during filopodial extension and retraction.
- Supports mechanistic de-risking by mapping spatial-temporal protein localization in live cells.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content imaging data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of modulators affecting protrusion dynamics.
- Standardizes assay conditions with defined signal-to-noise and acquisition thresholds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein localization data with disease-relevant cell migration models when applicable.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of migration-related targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in cell motility and signaling programs.
Pipeline & Workflow Integration
This software-assisted tracking method fits within the early discovery to lead identification continuum, bridging hypothesis-driven mechanistic studies and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying protein dynamics in live-cell protrusions.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative readouts for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates spatial-temporal protein concentration profiles and protrusion kinetics for robust comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant migration models when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable analytical capability for diverse protein localization and cell motility studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms related to cell migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs high-quality microscopy infrastructure with defined signal-to-noise and frame rate capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various cell types exhibiting filopodia, with parameter optimization per system.
- Dependent on maintaining image quality and avoiding saturation for reliable outputs.
