Oluşturma ve tartışma ve proteinler arasında farklı grup sınıflandırılması kolaylaştırmak için bir başvuru uygulama

Summary

Bu iletişim kuralının amacı farklı proteinler arasında tutarlı terminoloji ve sınıflandırma ölçütlerini yoksun bir grup için bir referans geliştirmektir. Bu başvuru analizleri ve bir bütün olarak grup tartışma kolaylaştıracak ve kurulan adlarına ek olarak kullanılabilir.

Abstract

Değişik organizmaların kullanarak farklı Labs'de inceledik ilgili proteinler zor bir bütün olarak grup görüşmek üzere ve yeni diziler uygun bağlam içine yerleştirmek için yapım bir Tekdüzen adlandırma ve sistem sınıflandırma, olmayabilir. Önemli sıra özellikleri öncelik bir referans geliştirme yapısı ilgili ve/veya faaliyet kurulan adlarına ek olarak bazı tutarlılık proteinlerin farklı bir gruba eklemek için kullanılabilir. Bu kağıt sistein-sağlamlık alpha sarmalının (CS-αβ) süper nasıl elektronik tablo yazılımı içinde oluşturulan bir referans süper varolan proteinler arasındaki ilişkileri netleştirmek yanı sıra yanı sıra yeni kolaylaştırmak göstermek için örnek olarak kullanılmıştır dizileri. Ayrıca nasıl başvurusu Filogenetik analizi geçerliliğini etkileri yaygın olarak kullanılan yazılım içinde oluşturulan sıra hizalamaları iyileştirmek için yardımcı olabilir gösterir. Bir başvurusu kullanımını büyük olasılıkla takson, yeterince moleküler analiz tarafından yakalanan değil özellikleri geniş bir yelpazede üzerinden son derece ıraksak dizileri içeren protein gruplar için yardımcı olacaktır.

Introduction

Özellikleri ve diğer proteinler için ilişki onlarda protein ad. Ne yazık ki, adları genellikle bulma zamanında atanmış olan ve araştırma devam ettikçe, büyük içerik anlayışı değişebilir. Bu bir protein bağımsız olarak birden fazla laboratuvar, adlandırma veya adı atarken kesin olması düşünülen özellikleri değişiklikleri ve artık yeterince protein ayırt adı tespit edildi, birden çok adda yol açabilir diğerlerinden.

Omurgasız defensins dejenerasyon isimlendirme ve sınıflandırma içinde iyi bir örnek sağlar. İlk omurgasız defensins böcekler rapor edilmiştir ve adı "böcek defensin" dayalı algılanan homoloji memeli defensins^1,2olarak önerilmiş. Dönem defensin hala kullanılan, şimdi açık olsa bile o omurgasız ve memeli defensins paylaşmak ortak bir atası^3,4. Türe bağlı olarak, bir omurgasız "defensin" (üç ya da dört disülfür bağları oluşturan) altı ya da sekiz katıldı ve çeşitli antimikrobiyal etkinlikler olabilir. Olarak defensins her zaman "defensins," denir değil durumu, aynı özelliklere sahip proteinler Caenorhabditis remanei⁵son zamanlarda tespit cremycins gibi karmaşık için. Buna ek olarak, omurgasız büyük defensins evrimsel omurgalı β-defensins diğer omurgasız defensins⁶ile ilgili olasılığı daha yüksektir. Buna rağmen bazen adı "hangi dizileri analizleri içinde dahil edilmesi gerektiğini belirlerken defensin olarak" araştırmacılar güveniyor.

Böcek defensins ve Akrep toksinler⁷arasındaki benzerliği yapısal çalışmalar ortaya ve CS-αβ kat daha sonra böcek defensins⁸belirleyici yapısal özelliği ilan edildi. Bu kat Akrep toksin gibi (CS-αβ) süper şu anda içeren beş ailenin yapısal sınıflandırma, proteinler (yapısal) veritabanı⁹' da tanımlar: böcek defensins, kısa Zincirli Akrep toksinler, uzun zincir Akrep toksinler, MGD-1 (üzerinden bir yumuşakça) ve bitki defensins. Bu süper son zamanlarda açıklanan CIS-defensins⁴ ve süper 3.30.30.10 CATH/genetik 3D veritabanı^10,11' deki yönergeleri ile eş anlamlıdır. Omurgasız takson, bitki ve mantarlar Haritayı bu kat içeren proteinler adlarını açıkça sistein numarası veya bağ desen, antimikrobiyal aktivite veya fiziksel özellikleri¹²ilişkili değil çeşitli çalışmalardan.

Tutarlılık ve açık ölçütleri eksikliği yeniden adlandırıp yeni tanımlanan dizileri bu süper sınıflandırmak zor yapmak. Proteinler bu süper karşılaştırmak için büyük bir engel olduğunu katıldı (her sıradaki ilk sistein C1 ise) her bireysel dizisi, yapısal rol için hesap yolu ile ilgili olarak numaralandırılır. Bu yalnızca diziler aynı sayıda katıldı ile karşılaştırılabilir anlamına gelir. İşte küçük sıra koruma dışında hizalamaları ve Filogenetik analizi zor yapar CS-αβ kat şekillendirme katıldı. Yapısal özellikleri öncelik bir numaralandırma sistemini geliştirerek, üst sıraları daha kolay karşılaştırıldığında hizalanmış ve. Hızlı bir şekilde korunmuş özellikleri yanı sıra bu alt gruplar, tanımlama görselleştirildiği ve yeni diziler daha kolay uygun bağlam içine yerleştirilebilir.

Bu kağıt numaralandırma sistemi için CS-αβ süper bir başvuru oluşturmak için bir elektronik tablo yazılımı (Örneğin, Excel) kullanır. Nasıl bu dizileri arasındaki karşılaştırmaları açıklar ve tardigrades tanımlanan yeni CS-αβ diziler uygulandığı gösterir. CS-αβ süper örnek olarak kullanarak, protokol dizileri ilgi kullanırken bir kılavuz sağlamak için yazılmıştır; Ancak, o bu süper veya sistein zengini diziler özgü olmak üzere tasarlanmamıştır. Bu yöntem büyük olasılıkla bağımsız olarak farklı özellikleri araştırılmış ve/veya kolayca moleküler analiz yazılımı tarafından tanınmayabilir ayrı özelliklere sahip küçük genel sıra homoloji sahip proteinler grupları için en yararlı olacaktır. Hiçbir önemli özellikleri tespit edilmiştir Eğer sınırlı yarar olur, böylece bu yöntem önemli özellikleri, bir temanın bazı kararlar gerektirir. Birincil hedefi nasıl basit bir görsel öğe sırası ilişkilerin elde edilebilir göstermektir. Bu daha sonra dizi hizalaması ve analiz bilgilendirmek için kullanılabilir ama hizalama ve çözümleme birincil hedefleri ise, bir barkod yöntem otomasyon¹³için daha fazla kapasiteye sahip uygun bir alternatif olacaktır. 3D yapısı doğrudan görselleştirme için yararlı olmayacaktır böylece geçerli yöntem her peptid özellikleri doğrusal bir formda görüntüler.

Protocol

1. faiz Protein grup tanımlama özelliklerini belirlemek

1. bir fikir birliği grubunun bir parçası olarak kabul için gerekli olan özellikleri ile ilgili olup olmadığını belirlemek için önceki yayınları danışmak. Herhangi bir tutarsızlık veya araştırma grupları arasında görüş farklılıkları dikkate almak ve bir alt grubu diğerinden ayırt etmek için hizmet verebilir özellikleri içerir.
2. Önceki edebiyat belirleyici özellikleri gidermez, grubun temsilcisi korunmuş olan özellikleri bulmak için başlangıç noktası olarak kabul edilen dizileri kullanın.

2. İlgili serilerini toplamak

Eğer değerlendirmeleri bu yazılı
1. analizleri grubunu gösteren diziler arasında bu dizilere ham veri kümesi içerir. Literatürde başvurulan katılım sayıları kullanarak dizileri almak ve düzenleme programı standart bir sıralama kaydetmek (Örneğin, EditSeq Lasergene oda veya bir çok için kullanılabilir ücretsiz online).
2. Söz konusu grup yapısal veritabanları birinde tanımlanmışsa al dizileri veritabanında sağlanan Katılım sayıları kullanarak grup. parçası olmak olarak veritabanını listeler dizileri içerir ve bir standart sıralama düzenleme kaydedin program, yukarıdaki gibi.
   Not: Örneğin, CS-αβ (Akrep toksin gibi) süper SCOP veritabanındaki kategorize dizileri burada bulunabilir: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. gerçekleştirmek temel Yerel Genel, online veritabanları literatürde dahil edilmemiş dizileri bulamadı biyoteknoloji bilgi (NCBI) için Ulusal Merkezi aracılığıyla veya yapısal hizalama arama aracı (patlama) ¹⁴ arama işlemleri veritabanları. İçin en komple sonuçlar, her iki protein patlama (blastp) kullanma ve patlama protein sorgu (tblastn) programları ile; tercüme Bu elde edilebilir vasıl her ikisi de vardır: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   1. Bilinen sorgu sırası olarak faiz grubun parçası olmak kullanım dizileri. Ve sıra en üstündeki arama kutusuna yapıştırın veya varsa bir GenBank katılım numarası veya gi tanımlayıcı sağlamak.
   2. Veritabanı açılır menüden seçin. Gereksiz protein dizileri (nr) blastp seçin ve tblastn için sıra etiketleri dile getirdi.
   3. Arama sonuçlarında belirli özellikleri canlı organizma veya takson adı yazıp listeden seçerek ayarlama için yazarken görüntülenir. Ek organizmalar veya dışlamak için özellikleri eklemek için tıklatın " + " düğme ve başka bir alan-ecek gözükmek. İstenmeyen herhangi bir takson organizma kutusuna yazarak ve denetimi sırasında görüntülenen listeden seçerek organizma veya takson adını yazarak dışlamak " çıkar " sağ taraftaki kutuya.
   4. Erişim ek parametreler yanında tıkırtı üstünde " algoritma parametreleri " yakın: sayfanın altındaki. Bir parametrenin değiştirilmesi için bir gerekçe değilse varsayılan bırakın.
   5. Tıklama " patlama " analizi çalıştırmak için düğme; görünür sonuçlar için biraz zaman alabilir. Genel olarak, sayısı bir bekliyoruz değeri (veya e-değer) ile almak " -05 " veya daha iyi ve düzenleme programı standart bir sıralama içinde kaydedin.
      1. Tüm sayısı bu eşiğin varsa, arama (bölümündeki algoritma parametreleri) hedef sıralarının artan bir sayıyla ilgili tüm serilerini almak için yeniden çalıştırın.
4. Gerekirse, ilgisiz bilgiler (CS-αβ kat olgun peptid geçerlidir Örneğin,) dışlamak için sıralarını kırpmak. Sinyal peptidler ve pro-peptidler ProP ¹⁵ kullanarak kaldırma için tanımlamak (kullanılabilir çevrimiçi), veya SignalP daha gelişmiş sinyal peptid tahmin ¹⁶ (elde edilebilir online).

3. Bir elektronik tabloyu alan önemli özellikleri olduğunu tespit edildi üzerinde bir başvuru oluşturmak

1. Grup ilgi belirleyici özelliklerini belirlemek. Örneğin, A Phormia terraenovae ( şekil 1) ⁸ defensin böcek çözüm yapısını tarafından kesin olarak kurulan CS-αβ kat kullanın.
   1. Bu kat içeren sistein-sağlamlık helix (CSH) ¹⁷ denilen daha küçük bir motif; bu motifi (X nerede herhangi bir amino asit) CXXXC tarafından tanımlamak iki disülfür bağları oluşturmak bir CXC, ters yönde ( Resim 1 , sağlam pembe çizgiler).
      Not: CS-αβ motifi tamamlamak için üçüncü bir disülfür bağ üzerinden ek katıldı CSH motifi ( şekil 1,) pembe çizgiler noktalı her yarı önce yerleştirilir oluşur.
2. Bunlar bir elektronik tabloya özellikleri tanımlama girin. Bkz: Şekil 2.
   1. Kullanım sütunları korunmuş özellikleri ve bu özellikler arasında boşluk göstermek için. Sütun numaraları uygun ve tutarlı bir genişliğe sahip olduğunuzdan emin olmak için geniş tutun. Genişliği kullanarak " Format | Sütun genişliğini " işlev ( Şekil 2, pembe ok).
   2. Satırları için sıra adlar kullanın.
   Ne zaman belgili tanımlık şekil, bir sıra vardır
   3. dolgu ( Şekil 2, pembe kare) işleviyle kutusuna doldurun. Özellikler arasındaki boşluğu için amino asitler kutusunda girin ve doldurulmamış bırakın. Örneğin, sıra defensin böcek kullanarak tanımlanmış aralıkları ve C5 ve C6 C2 C3 arasında ile altı katıldı içerir bir referans verir.
3. Daha önce kurulmuş temsilcisi dizileri yapısal veritabanları ve edebiyat dayalı grubunun üyeleri olarak ekleyin.
   Not: Örneğin, önceki edebiyat ve yapısal veritabanı eklenmesi için çeşitli gruplar tanımlamak: böcek defensins, kısa Zincirli Akrep toksinler, uzun zincir Akrep toksinler, MGD-1, bitki defensins, Yuvarlak solucanlar ABFs, Drosophila, drosomycins ve macins. Edebiyat da bu süper ¹⁸ atası gösterebilir sadece dört katıldı ile bakteriyel bir dizi tanımlar. Bu DNA dizileri ekleyerek katıldı altı on ref'teki sayısını artırır ama önemli yapısal özellikleri ( şekil 3) hizalamasını korur.
   1. Bir alt sıraları (örneğin, ekstra bir sistein) tanımlamak büyük olasılıkla bir özellik eklemek için kullanın " Ekle " işlev ( şekil 3, pembe ok).
   Verilen diziden eksik özellikleri doldurulmamış kutusunu boş bırakın ve aradan geçen amino asitler temsil eden kutuları ile birleştirmek varsa
   2. . Gerekirse, Birleştir ve Ortala özelliğini ( şekil 3, pembe kutu) kullanarak hücreleri birleştirme.
4. Daha büyük süper her grupta varyasyonun daha iyi bir görüntü elde etmek için devam serileri gruplara ekleme. Karşılaştırmalar ( şekil 4) kolaylaştırmak için Grup özelliklerini özetlemek.
   1. Amino asitler Başlıca özellikler arasında sayıda değişiklik gösterdiğinde, 6-12 (6-12 amino asitler) ve göstermek için eğik çizgi gibi bir aralık belirtmek için bir tire işareti kullanın / veya 7/10 (7 veya 10 amino asitler) gibi.
   2. Şekil-in uygun olmayabilir, ancak yeterince sık meydana gelmez dizileri içinde başvuru eklemek için ek açıklama eklemek için bir yol seçin. Katıldı bu süper önemli olduğundan, örneğin, ek katıldı ( şekil 4, pembe kutuları) etiket.
5. Newl Ekley-tespit dizileri için bir kılavuz olarak kurulan dizileri kullanarak elektronik tablo. Örneğin, tardigrades (sarı) dizileri ekleyerek tardigrade dizileri ( şekil 5 gösterir alan amaçlar için sıra başına bir satır yerine özetleri) süper çeşitli farklı gruplar içine düşmek gösterir.
6. Göstermek değişkenlik taksonomik grup içindeki satır ( şekil 6) yeniden düzenleyerek.

4. Rafine Amino asit hizalamaları referansı kullanın

Not: birden fazla sıra hizalamaları için kullanılan birçok program bulunmaktadır, ancak bu gösteri moleküler evrim genetik analiz (MEGA6) kullanır ¹⁹ ücretsiz indirmek kullanılabilir çünkü.

1. Yazılımı yükleyip.
2. Seçerek yeni bir uyum içinde MEGA başlamak " Düzenle/Yapı Hizalama " da Hizala sekmesini altında " yeni bir hizalama oluşturmak " kutusunda görünür ve'ı tıklatın " Tamam. " sonra seçin " Protein. "
3. Seçin " dosya eklemek serisinden " içinde " düzenleme " menü dizileri alınacak.
   Not: Dizileri MEGA içe aktarma işlemi için FASTA biçiminde olması gerekir. Arka plan renklerini yansıtan farklı amino asit türleri varsayılan olarak kullanılır, ancak bu seçenek altında devre dışı bırakılabilir " ekran " menü.
4. Tüm dizileri girildikten sonra flexing kol simgesini tıklatın ve sonra " hizalamak Protein " ²⁰ kas algoritması kullanarak dizileri hizalamak için.
   Not: İlogenetik de mevcuttur.
   1. Hiçbir şey seçili pops kadar yapılmış ve tüm, seçmek sorar bildiren tıklatırsanız " Tamam. "
   2. Not: Bu bir pencere açar bir bazı parametreleri değiştirmek izin veren, ancak yalnızca değiştirilmesi gerekir bunu yapmak için bir neden. Bu analiz bir alt kümesini bir önceki kağıt ¹² ' analiz dizileri kullanır.
5. Kontrol hizalamayı esaslı üzerinde önemli özellikleri; dizileri yukarıda üst çubuğu amino asit tamamen nerede tüm sütunları gösterir Not korunmuş (*). Bkz: Şekil 7. İlk hizalama sadece üç dört korunmuş katıldı ( Şekil 7, pembe kutuları); gösterir görmek sütun boyunca, AlCRP sırası açıkça yanlış hizalanmış ( Şekil 7, pembe ok) bakıyor.
Ben arasında geniş boşluk kurtulmak için
6. ve tireleri ve basın vurgulamak korunmuş C " Sil " anahtar. Herhangi bir amino asitler vurgulamak değil, ya da onlar-ecek var olmak silmek de.
7. Amino asitler sağa taşımak, vurgulamak ve boşluk çubuğu tuşuna basın için
   1. Not AlCRP şimdi hizalanmış yapısal katıldı vardır ve CXXXC motifi dün C hizalama ( şekil 8) korunmuş. Sıralarının en önemli özellikleri öncelik vermek için gereken hizalamayı ayarlayın.

5. Grupları tespit kullanımını filogenetik analiz sonuçları ile başvurusundan karşılaştırma

1. ön hizalamaları, hangi dizileri için küçük bir numara sıralarının; bir Filogenetik analizi dahil edilmesi gereken belirlemek için bu adımı olabilir gereksiz olacak.
   1. Tüm dizileri içeren bir hizalama dosyayı tutmak, ancak gereksiz dizileri bir Filogenetik analizi için kaldırmak ( Şekil 9, pembe kutuları Haritayı çift gereksiz dizileri).
   2. Serileri, çok sayıda veri kümesi içeriyorsa, ön analizler ve gruplardan seçin temsilcileri her zaman bir clade form.
2. En iyi amino asit ikame modeli belirlemek.
   1. Hizalama (Veri sekmesinin altında) MEGA formatında dışa.
   2. Modelleri menüsüne gidin ve seçin " bulmak en iyi DNA/Protein modeli. " az önce kaydettiğiniz dosyayı seçin ve aç; bu değiştirilebilir bazı parametreler içeren bir pencere açar.
   Onları değiştirmek için bir neden olmadığı sürece
   3. varsayılan parametrelerini kullanın. ' I tıklatın " hesaplamak " çözümlemesi'ni başlatmak için.
3. MEGA içinde maksimum olabilirlik (ML) analizler.
   1. Seç " yapı/Test maksimum olabilirlik ağaç " Phylogeny menüsünden.
   2. Model kararlı adım 5.2 veri için en uygun olmak seçin (çıkış yanı sıra en iyi oyuncu değişikliği modeli verecek " gore siteler arasında " parametre).
   3. 1.000 seçin önyükleme çoğaltır önlemleri ağaç için destek elde etmek için.
   4. Tıklama " hesaplamak " analiz; çalıştırmak için MEGA vardır bir " ağacı Explorer " ağaç görselleştirmek için.
4. MrBayes açık kaynak yazılım ²¹ ' Bayesian analizler.
   Not: MrBayes el kitabı da bu siteden kullanılabilir. Bu temel adımlar sağlamak amacıyla hazırlanmıştır ve Bayesian filogenetik analiz için kapsamlı bir rehber değil.
   1. MrBayes programın bulunduğu klasöre MEGA hizalama PAUP (Nexus) formatında verilecek.
   2. Açık MrBayes ve türü " exe dosya adı " (Örneğin, " exe Alignment.nex ").
   3. Model ve analiz parametrelerini belirtin. 5.2. adımda belirtilen her iki modeli seçin veya seçim " karışık " çeşitli modelleri denemek ayarı ve en iyi posterior olasılıklar ağaçlarıyla modelinde sıklığını rapor (prset aamodelpr = karışık). Türü " showmodel " geçerli modeli ayarlarını rapor etmek ve " mcmc yardımcı " her biri kısa bir açıklama ile geçerli parametre ayarları göstermek için.
   4. Kullanarak nesil sayısı ayarla " mcmcp ngen = " komutu (1 milyon tipik).
   5. Türü " mcmc " çözümlemesi'ni başlatmak için.
   6. , Nesil sayısı tamamlandığında daha fazla nesiller eklemek program sorar. Split Frekanslar ortalama standart sapması 0,1 daha az ise, hayır yazın. 0,1 olduğunu, analiz devam etmek için izin gerektiğini veya bazı parametreleri (el kitabına bakın) değiştirilmelidir.
   7. Kullanım " sumt " ağacı dosyaları oluşturmak için komut.
   8. Analizleri tamamlandıktan sonra bir fikir birliği ağacı oluşturulur, ağaç-ebilmek var olmak görüş içinde FigTree (elde edilebilir online).
5. Yöntemleri tutarlı sonuçlar elde görmek için ağaçlar karşılaştırın.
   Not: Bazı dizileri bir sürü bilgi sağlamaz: ağaçlar de çözülmüş olabilir onu da dallar en az destek ( şekil 10).
6. Karşılaştırmak ağaçlar başvurusu Filogenetik analizi bu gruplar destekleyip desteklemediğini görmek için kullanarak tanımlanan gruplar için.

Representative Results

Literatürde bildirilen CS-αβ süper serileri grupları şekil 4' te gösterilmiştir. Her sıra için numaralandırmasına bağlı sistein eşlendirme beş temel gruplar (Tablo 1, orta sütunda) öneririm. Grup 1, üç disülfür üzerinden Tahvil ve böcekler, arachnids, yumuşakçalar, nematodlar ve mantarlar dizileri içeren altı katıldı vardır. Grup 2, 3 ve 4 dört disülfür bağları oluştururlar 8 katıldı var. Grup 2 böcek, örümcek ve bitki sıraları içerir; Grup 3 örümcek, yumuşakça ve nematodunun dizileri ve Grup 4 cnidarians, annelids, yumuşakçalar ve mantarlar dizileri içerir. Grup 5 10 sistein macins içerir. Bazı dizileri oldukça bu kalıpları sığmadı ama diğerlerinden daha bir gruba genellikle daha yakındık.

Grup 1 ve 2 iki Tahvil paylaşmak gibi görünüyor: C2-C5 ve C3-C6; Ancak, onun ilk sistein ile her sıra numaraları başlayan Tahvil yapısal bağlamında kabul etmez. C2-C5 Grup 1'deki C2-C5 Grup 2 dizileri CS-αβ kat stabilize etmek için gerekli son bond formlar iken bir iki CSH motifi Tahvil formları diziler. Homolog Grup 1 C2-C5 için grup2 C3-C6, hangi numaralandırma üzerinden açık değildir bağdır. Ayrıca grup 3'te, C2-C6 bond aynı yapısal rol oynar açık değildir.

Edebiyattan dizileri kullanarak on katıldı ve toplam başvuru oluşturulur. CSH motifi Tahvil C3-C8 ve C4-C9, C2-C6 CS-αβ kat tamamlama ile oluşturulur. Başvuru numaraları dayalı sistein çiftleri yeniden numaralandırma Tahvil her sırayla (Tablo 1, sağ sütun) mevcut açıklar. Şimdi tüm dizileri C2-C6, C3-C8 ve C4-C9, süper tanımlar yapısal kat yansıtan var ortada. Tutarsız terminoloji var dizileri ve belirsiz sınıflandırma kriterleri arasında kolay karşılaştırma için bir başvuru sağlar. O da bir alt sıraları tanımlayan özellikleri belirlemek için yardımcı olabilir. Örneğin, C1-C7 bond macins diziler bu bağı ile "macins" "defensins yerine" (Tablo 1 ve şekil 4) sınıflandırmak uygun hale diğer süper üyelerden ayırt etmek.

Aramaları genel online veritabanları ortaya açıkça var CS-αβ tardigrades gelen on altı dizileri kat, her sekiz Hypsibius dujardini gelen ve Milnesium tardigradum. Dört yeni diziler altı katıldı var, dokuz sekiz, dokuz sahiptir, ve on iki tane. Bu çok az bilgi verir, ama başvuru dizileri yerleştirerek, tardigrade diziler aynı sayıda katıldı ile yapısal olarak önemli katıldı daha dizisi ( içinde aynı yerde her zaman yok netleşiyor Şekil 5 ve şekil 6). Referans hizalamayla desenleri (Tablo 2, değişkenden parantez içinde gösterilen yapıştırma desenleri) bağ ile çıkarsama için de sağlar. Bazı tardigrade dizileri açıkça desenleri 1-4 uygun. Diğer önerilen bakteriyel atası, Akrep Cl-toksin veya mantar defensin benzeri peptidler ailesi için en benzer. Desen 2 iki alt gruplar, bir Akrep Na + toksinler, drosomycin ve bitki defensins ve diğer tarafından Akrep Cl-toksinler tarafından temsil olabilir. Daha fazla çalışma tardigrade proteinlerin işlevi araştıran bazı toksinler tercihan--dan defensins düşünülmesi gereken eğer belirlemek için gereklidir.

Filogenetik analizi genellikle bir grup proteinlerin nasıl geliştiğini incelemek için kullanılır. CS-αβ süper dizileri genellikle kısa ve çok farklı; elde edilen ağaçların çoğu kez kötü çözümlenmiş ve küçük fikir sunuyoruz. Burada analiz dizileri alt kümesini ML ve Bayesian ağaçlara kötü düşük birçok clades (şekil 10, ek dosyaları 1 - 4) desteği ile çözüldüğünü. Sadece 70'in üzerinde (veya posterior olasılıklar üzerinde 0,7) önyükleme düzeyleri göstermek için yaygın bir uygulamadır, ancak genel olarak düşük düzeyde destek göstermek için tüm sayılar şekil 10 korur. Beş grubun 70/0.7 en az bir iki ağaç yukarıda desteklenen: (a) 6C ve 8C Akrep toksin; (b) macins; (c) kene ve Akrep defensins; (d) bitki defensins; ve (e) 6C defensins arachnids ve yumuşakçalar böcek. ML ağacında clade e de bir 8 C toksin ve bir 8 C tardigrade defensin içerir, ancak destek çok düşük (şekil 10A). Genel olarak, bunlar başvuru sistein numaralandırma kullanarak tanımlanan Kategoriler yansıtmak ama de diziler büyük bir taxonomical grubunda bulunan farklı sistein numaraları ile aynı modeli gelen sıralarıyla daha yakından ilgili olabilir farklı gruplar. Sadece küçük bir numara sıralarının bu çalışmada kullanılan iken, 250 serileri daha büyük bir analizini çözünürlük (ek dosyaları 5 - 8)¹²eksikliği ortadan kaldırmadı. Elektronik tablo başvuru hizalama için filogenetik ağaç karşılaştırıldığında yapısal veya fonksiyonel alaka ile benzerlikler daha kolay görselleştirme sunabilir.

Şekil 1: Sırası ve CS-αβ süper yapısal özelliklerini tanımlama. Amino asitler ve 3D yapısı vardır renk kodlu: döngü (mavi), Alfa-helix (yeşil), beta-sayfalar (altın) ve disülfür bağları (pembe). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Ön altı-sistein başvuru dayalı böcek Defensin sırası. Sütun belirtin (C1-C6) korunmuş katıldı ve CSH motif için sayısını amino korunmuş asitleri arasında katıldı. Dolu kutu sırası verilen sistein vardır ve amino asitler katıldı arasında sayıları gösterir gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

er.Within-sayfa = "1" >
Şekil 3: CS-αβ süper grupları üzerinden temsilcisi dizileri dayalı on-sistein başvuru rafine. Sütunları korunmuş katıldı ve amino asitler aralarında göstermek. CSH motifi (C3, C4, C8 ve C9) ve CS-αβ kat (C2 ve C6) katkıda bulunan katıldı etiketlenir. Dizileri taksonomik grup tarafından renk kodlu: Arachnida (ışık turuncu), bakteri (siyah), Knidliler (gri), altı bacaklılar (turuncu), yumuşakçalar (mavi), nematod (mor) ve Plantae (yeşil). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : CS-αβ üst sıraları özetini başvuruya göre grup özellikleri ile uyumlu. Sütunları korunmuş katıldı ve amino asitler aralarında göstermek. CSH motifi (C3, C4, C8 ve C9) ve CS-αβ kat (C2 ve C6) katkıda bulunan katıldı etiketlenir. Dizileri taksonomik grup tarafından renk kodlu: Annelida (Bordo), Arachnida (ışık turuncu), bakteri (siyah), Knidliler (gri), mantarlar (açık yeşil), altı bacaklılar (turuncu), yumuşakçalar (mavi), nematod (mor) ve Plantae (yeşil). Bir tire ile ayrılmış sayıları aradan geçen amino asitler bir dizi olduğunu gösterir; eğik çizgiyle ayrılmış sayılar ya gösterir / veya. Bir "C" başvuru için ek garanti için yeterli sıklıkta oluşmaz bir ek sistein gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Tardigrade CS-αβ dizileri için başvuru grubu özellikleri ile uyum süper ilavesi. Sütunları korunmuş katıldı ve amino asitler aralarında göstermek. CSH motifi (C3, C4, C8 ve C9) ve CS-αβ kat (C2 ve C6) katkıda bulunan katıldı etiketlenir. Dizileri taksonomik grup tarafından renk kodlu: Annelida (Bordo), Arachnida (ışık turuncu), bakteri (siyah), Knidliler (gri), mantarlar (açık yeşil), altı bacaklılar (turuncu), yumuşakçalar (mavi), nematod (mor), Plantae (yeşil) ve Tardigrada (sarı). Bir tire ile ayrılmış sayıları aradan geçen amino asitler bir dizi olduğunu gösterir; eğik çizgiyle ayrılmış sayılar ya gösterir / veya. Bir "C" başvuru için ek garanti için yeterli sıklıkta oluşmaz bir ek sistein gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: Tardigrade CS-αβ dizileri taksonomik grup tarafından başvuru ile süper uyum için eklenmesi. Sütunları korunmuş katıldı ve amino asitler aralarında göstermek. CSH motifi (C3, C4, C8 ve C9) ve CS-αβ kat (C2 ve C6) katkıda bulunan katıldı etiketlenir. Dizileri taksonomik grup tarafından renk kodlu: Annelida (Bordo), Arachnida (ışık turuncu), bakteri (siyah), Knidliler (gri), mantarlar (açık yeşil), altı bacaklılar (turuncu), yumuşakçalar (mavi), nematod (mor), Plantae (yeşil) ve Tardigrada (sarı). Bir tire ile ayrılmış sayıları aradan geçen amino asitler bir dizi olduğunu gösterir; eğik çizgiyle ayrılmış sayılar ya gösterir / veya. Bir "C" başvuru için ek garanti için yeterli sıklıkta oluşmaz bir ek sistein gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: Yanlış hizalanmış sırası kullanılarak otomatik hizalama. Amino asitler bütün serilerini korunmuş simgesiyle * (pembe kutularına özetlenmiştir) ilk sıra üstündeki satıra. AlCRP yanlış hizalanmış. Gap C (pembe ok) düzgün hizalamak için kaldırılması gerekiyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: El ile arıtma diziliş dizilerinin yapısal olarak önemli özellikleri korur. AlCRP şimdi hizalı düzgün (pembe ok), CXXXC motifi tam dizileri (pembe kutu) için korunmuş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 9 : Gereksiz bir hizalama serilerinde. Hemen hemen aynı sıraları (pembe kutu) çift varsa, bunlar-ecek beğenmek bu yana biri, kaldırılabilmesi için her zaman birlikte içinde küme ve ağacın genel topoloji için çok az katkıda bulunmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 10 : Filogenetik analizi üretilen ağaçlar karşılaştırılması. (A)maksimum 1.000 önyükleme ile MEGA, büyük olasılıkla analizde çoğaltır istimal WAG + G + ben model. (B) 1.000.000 karışık modeli ayarı kullanarak nesiller ile Bayesian çözümlemesi. 70/0.7 desteklenen clades düz pembe çizgiler gösterilir; kesik pembe çizgiler 70/0.7 diğer ağacında, desteklenen clades göster. (a) bir 6C ve 8C Akrep toksin; (b) macins; (c) kene ve Akrep defensins; (d) bitki defensins; ve (e) 6C defensins arachnids ve yumuşakçalar böcek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: CS-αβ süper içinde gruplar dayalı sistein eşleştirme desenler. Beş temel kalıpları bağı oluşumu dahili numarası (orta sütunda) veya başvuru numarası (sağ sütun) kullanılarak gösterilir. Akrep Cl - toksinler, ASABF 6Cys-Alfa ve mantar peptidler bir grup desenle m yerleştirilirOST yakından eşleşir. Başvurudaki dahil değildir bir sistein üst simge katıldı tarafından belirtilen önce/sonra (örneğin, C3 ve C4 arasında C^3/4 ' tür).

Tablo 2: Tardigrade CS-αβ ilavesi dizileri sistein eşleştirme desen gruplarına. Tardigrade defensins ve macins (kalın) daha önce kurulan gruplar halinde mümkünse konur. Tardigrade bazı dizileri bir gruba özel desen gösterebilir. Başvurudaki dahil değildir bir sistein üst simge katıldı tarafından belirtilen önce/sonra (örneğin, C3 ve C4 arasında C^3/4 ' tür). Gösterimi "2C^/1" referans C1 iki katıldı akıntıya karşı olduğunu gösterir.

Ek dosya 1 (S1): Bu veri kümesi içinde MEGA hizalamasını. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 2 (S2): maksimum olabilirlik ağaç MEGA dosya bu veri kümesi için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 3 (S3): Nexus biçimde MrBayes için bu veri kümesi hizalamasını. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 4 (S4): Bu veri kümesi MrBayes analizini dosyasından fikir birliği. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 5 (S5): MEGA 250 CS-αβ serilerinde hizalamasını. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 6 (S6): maksimum olabilirlik ağaç 250 CS-αβ sıralarının. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 7 (S7): 250 hizalamasını Nexus CS-αβ serilerini biçimlendirmek için MrBayes. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 8 (S8): 250 CS-αβ dizileri MrBayes analizini dosyasından fikir birliği. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bir grup içindeki bir protein adlandırma için ölçütleri açık olmalıdır, ancak bu her zaman böyle değildir. CS-αβ kat var dizileri organizmalar çeşitli kullanarak, farklı adlandırma sistemlerinde kaynaklanan yanı sıra karakterizasyonu düzeyleri değişen birçok laboratuvarlarda inceledik. Tamamen yeni bir adlandırma kabul ettirmeye çalışırken makul değildir ve karışıklık büyük bir önceki edebiyat danışmanlık zaman neden olur. Bir başvuru sistemi numaralandırma bir protein adına ek olarak süper göre özellikleri açıklamak için kullanılabilir.

Dizileri çok sayıda özetleme ve önemli özelliklerini görüntülenmesi için yararlı olabilir, ancak bir elektronik tabloda, başvuru oluşturma gelen proteinler için adlandırma ve sınıflandırma olacak olası değildir açık kriterleri ile grupları bulunuyor. Sıra hizalamaları ve logolar her yerinde koruma düzeyini soruşturma için yararlıdır, ancak aktif sıra özellikleri yapısı ve fonksiyonu için önemli öncelik değil. CS-αβ örnek yapısı üzerinde duruldu, ama bir bağlama sitesi oluşturmak belirli amino asitler de belirleyici bir özellik olarak dahil. CS-αβ peptidler belirli antimikrobiyal/toksik faaliyetleri görüşmek sıra özellikleri tanımlanır, bu faaliyete göre gruplara netleştirmek için başvuru için ekledi. Her ne kadar bir sinyal peptid veya yanlısı peptid önemli ise sadece tahmin edilen olgun peptidler Örneğin, kullanıldı, bu bilgileri her sıra için eklenebilir. Bilgilendirici olmak düşünseydim intron Mekanlar, yanı sıra belirli ekleme veya silme olayları da dahil edilebilir. Filogenetik analiz moleküler veri-bu sınırlı değildir için MrBayes kullanmanın bir avantajı evrimsel önemi olabilir diğer özellikleri için veri kodlama analiz edebilirsiniz. Bunlar kodlanmış olarak mevcut ya da yok, yalnız serisinden daha daha fazla bilgi sağlayan.

İlgili serilerini toplama Protokolü'nün kritik bir adımdır. Çalışmanın kapsamını ve grup üyelerinin dağıtım bağlı olarak, bu geniş taxonomical grupları kapsayabilir. Eğer amaç bir grup proteinlerin anlamak için bazı dizileri genellikle gelen rapor edilen türler dışında bulunabilir düşünün. Bir takson zaten iyi gösterilir ve olası veya gereksiz ek dizileri vardır, onları arama hariç uygun olabilir. Temel-in-bir patlama arama hits almak için kural için e-değer-05 kesim kullanmaktır. E-şans eseri beklenen sayısı değerdir. Bu hisse belirli özellikleri son derece farklı bir grup sıralarının ise bazı durumlar için uygun olmakla birlikte, daha az güvenilir-It benzer dizileri alabilir ama yapmak değil var belirli özellikleri istedi ve o-ebilmek değil olabilir Bu anahtar özelliklere sahip ancak son derece farklı olan dizileri döndürür. Bu sorunu ele almak olası bazı yolları vardır. İlk onlar dahil ölçütlere uyan görmek için-05 kesme aramada tespit sıralarını bakmaktır. Yeterli bilgi, ikincisi, pozisyon özgü tekrarlanır patlama (PSI-BLAST)²² veya desen-Hit başlatılan patlama (PHI-BLAST)²³kullanın. PSI-şok bir ilk arama sonuçlarından sonraki tur için yeni bir model oluşturmak ve bazen ilk arama değil teşhis ettiniz bul ıraksak dizileri kullanır. PHI-BLAST sorgu sırası ile birlikte gönderilmesi için bir desen gerektirir. Bu erişim tarihi dizileri faiz desende bulunduğu sınırlandırır. Grup için benzersiz bir motif açıkça belirlenebilir özellikle yararlı bir araçtır.

Doğru bir hizalama filogenetik analiz için önemlidir; ağaçlar yorumlara sadece iyi hizalama kullanarak oluşturuluyorsa geçerlidir. Hizalama bilgilendirmek için başvuruyu kullanarak yapısı veya etkinliği olarak kabul edilir ne zaman sadece bariz hataları önlemek için yardımcı olabilir. Sıra artıklık proje için tanımlanmış olması gerekir. Gereksiz görünüyor iki diziyi olabilir filogenetik amaçlar için onlar yaygın olarak farklı özellikleri veya hemen hemen aynı sıra ama farklı yapısal veya fonksiyonel özellikleri vardır. Hangi-meli var olmak dahil dizileri belirsizlik varsa, birden çok hizalamaları oluşturulan ve hizalama etkisi filogenetik çıkarımlar nasıl değiştiğini görmek için ayrı ayrı analiz. Burada sunulan yöntem hizalamaları manuel ayar ihtiyacını ortadan kaldırmaz, ancak dizileri nasıl hizalanacağını ve muhtemelen tarif edilmiştir daha daha sofistike bir tedarikçidir tekniği ile birlikte kullanılabilir netleştirmek için yardımcı olabilir daha önce¹³.

Yararlı olabilmesi başvurusunu serisinden yalnız şu anda açık değildir belirleyici özellikleri belirlemek önemlidir. Örneğin, desen her sıra kendisi ile ilgili olarak numaralanmıştır zaman katıldı farklı sayıda sıralarıyla arasında bağ sistein karşılaştırmak için yetersizlik göz önünde bulundurun. Karşılaştırma ve karışıklık başka bir katman eklemek için tartışma kolaylaştırmak için hedeftir. Bu referans birkaç yineleme içerebilir ve yargı hangi özellikleri dahil etmek için karar vermede çağırır. Bu bir grup ıraksak dizileri tartışırken yaygın yöntemi benimseyen bir bütün olarak grup anlayış artacak umulmaktadır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BLAST webpage			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (Lasergene suite)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
MrBayes			http://mrbayes.sourceforge.net/
SCOP database			http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/