Summary
细胞色素 P450s 致癌亚硝胺的α-羟基化是公认的代谢途径, 产生 DNA 损伤的中间体, 导致突变。然而, 新的数据表明进一步的氧化 nitrosamides 可能发生。我们描述了一个一般的方法, 检测 nitrosamides 产生的体外细胞色素 P450-catalyzed 代谢的亚硝胺。
Abstract
N-亚硝胺是一种公认的环境致癌物质, 需要细胞色素 P450 氧化来表现活性。代谢活化机制包括自发分解为 DNA 烷剂的α-hydroxynitrosamines 的形成。DNA 损伤的积累和由此产生的突变最终会导致癌症。新的证据表明, α-hydroxynitrosamines 可以进一步氧化到 nitrosamides processively 细胞色素 P450s。因为 nitrosamides 一般比α-hydroxynitrosamines 更稳定, 也可以烷基化 DNA, nitrosamides 可能在癌变中起到作用。在本报告中, 我们描述了一个一般的协议, 评估 nitrosamide 生产从体外细胞色素 P450-catalyzed 代谢亚硝胺。该协议采用了一般的方法合成相关的 nitrosamides 和一个体外细胞色素 P450 代谢测定的液相色谱-nanospray 电离-高分辨率串联质谱检测。此方法在示例研究中检测到′-nitrosonorcotinine 作为′nitrosonornicotine 的次要代谢物。该方法具有较高的灵敏度和选择性, 是由于质量检测准确。该方法在多种硝细胞色素 P450 系统中的应用将有助于确定这种转化的普遍性。由于细胞色素 P450s 的多态性和活动性的变化, 更好地了解 nitrosamide 的形成有助于个别癌症风险评估。
Introduction
N-亚硝胺是一种在饮食、烟草制品和一般环境中发现的大量致癌物质;它们也可以在人体内形成内1。超过 300 N-硝基化合物已经被测试和 #62; 90% 被评估了作为致癌物在动物模型2,3。为了展示它们的致癌性, 这些化合物必须首先激活细胞色素 P450s1,2,3。研究表明, 细胞色素 P450s 容易氧化亚硝胺为α-hydroxynitrosamines (图 1), 这是高度活性化合物与半衰期的〜 5 s 之前自发分解到 alkyldiazohydroxides。后者可以在丢失 H2O 和 N2之后烷基化 DNA。由此产生的 DNA 加, 如果未, 可以导致突变, 如果在关键的 onco 或抑癌基因, 导致癌症的发展1。因此, 为了充分了解细胞色素 P450 氧化致癌亚硝胺的代谢途径、DNA 加和下游代谢产物, 已经花费了大量的精力。这些知识在个人癌症风险评估中具有潜在的应用价值4。
图 1: 一般和建议的亚硝胺代谢。
亚硝胺 (1) 被 P450s 氧化为α-hydroxynitrosamines (2), 自发分解为 alkyldiazohydroxides (3)。这些化合物可以与 dna 结合形成 dna 加。假设2被 P450s 进一步氧化为 nitrosamides 4。这些可以直接绑定到 dna, 形成新的 dna 加或水解到3 , 形成已知的 dna 加。r1和 r2表示任何烷基组。请单击此处查看此图的较大版本.
虽然α-hydroxynitrosamine 假说得到了大量数据的坚实支持, 但也存在一些不一致之处。主要的一个是α-hydroxynitrosamines 的短半衰期5,6。众所周知, 这些化合物是在内质网膜和后来的烷基化核 DNA 中产生的。鉴于他们的生命的几秒钟, 这是令人费解的这些中间体如何生存所需的旅行, 虽然胞。一个假说是, α-hydroxynitrosamines 的一部分被 processively 氧化为 nitrosamides7,8, 在比较9中相当稳定。这可能会发生通过保留α-hydroxynitrosamines 在细胞色素 P450 活性部位。这种类型的氧化的先例已经看到与尼古丁10, 酒精的11, 和简单的 alkylnitrosamines12,13。另外, nitrosamides 是直接作用的致癌物质2,3。根据它们的反应性9, 这些化合物被认为产生的 dna 加与α-hydroxynitrosamines 和新的, 未经探索的 dna 加 (图 1) 的结果相同。因此, 这一假说不仅解释了通过胞的运输, 也说明了 DNA 损伤产物的形成。
本文介绍了一种用于评价亚硝胺的细胞色素 P450-mediated 转化为 nitrosamides 的体外的通用协议。先前报告的′-nitrosonornicotine (NNN) 转换为′-nitrosonorcotinine (NNC) 的细胞色素 P450 2A6 被展示为示例14。该协议在广泛的基质酶系统的应用将有助于确定 nitrosamides 在整体硝代谢中的重要性。
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Protocol
1. 材料和常规过程
- 将 NNN 合成为以前描述的 15 。获得 norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, 再生系统, 0.5x 和 #160; 反应缓冲器, 以及试剂级商业来源的所有其他化学品或溶剂.
- 在 500 MHz 光谱仪上记录核磁共振谱。报告化学变化为每百万分之 (ppm)。使用残余溶剂峰值作为内部参考为 1 H-nmr (7.26 ppm CDCl 3 ) 和 13 C-nmr (77.2 ppm CDCl 3 ).
注意: 峰值分裂使用了以下简称: s = 单线态, d = 双峰, dd = 双峰的双峰, dt = 三胞胎的双峰, dq = 双峰的四重奏, ddd = 双峰的双峰, 和 m = multiplet. - 对 LTQ Orbitrap Velos 上所选化合物执行高分辨率质谱 (人力资源), 并将数据报告为 m/z .
- 使用金预硅胶薄层色谱片 (40 毫米 x 80 毫米, 0.2 毫米厚) 与 254 nm 荧光指示剂 (tlc)。通过 UV 灯照射来可视化薄层色板.
- 在60和 #197 上执行闪光色谱; 70-150 目硅胶使用 1.5 cm x 15 cm 玻璃柱.
2。nitrosamide 阳性控制 ( N & #8242; -nitrosonorcotinine, NNC)
- 干燥, 在烤箱过夜 (16 小时, 〜140和 #176; C), 一个25毫升, 圆底烧瓶含有磁性搅拌棒。早上, 在 n 2 流下冷却烧瓶, 同时使用油起泡使 n 2 流速保持在每秒一个气泡下.
注: 冷却后, 不需要在 N 2 下保持烧瓶的预防措施. - 在通风罩中添加 norcotinine (31.8 毫克、0.196 摩尔)、醋酸酐 (5 毫升) 和乙酸 (1 毫升) 到冷却烧瓶中。在冷却到0和 #176 时, 将此混合物连续搅拌; C 冰浴.
警告: 醋酸酐和乙酸具有腐蚀性. - 添加纳米 2 (33.3 毫克, 0.483 摩尔) 在一个部分和连续搅拌的混合物为2.5 小时. 监测反应进展的 TLC (100% EtOAc, R f = 0.19, 参见步骤 1.4).
注: 在这段时间, 混合物将变得越来越黄与偶尔起泡. - 通过将混合物倒入 ice-cold H 2 O (18 毫升) 来淬火反应。在 100 ml 分漏斗中, 立即用18毫升 CH 2 Cl 2 提取水溶液。用 CH 2 Cl 2 (9 毫升) 将水层至少再抽出2次.
- 干燥100毫克 MgSO 的混合有机物 4 用于2分钟的过滤, 并通过旋转蒸发浓缩溶液以产生原油、黄油。在蒸发过程中, 将水浴加热到30和 #176; C.
注意: 如果化合物在 CH 2 Cl 2 中被溶解, 并且该解决方案在黑暗中存储在 2-8 和 #176 中, 则可以暂停该协议; C. - 用硅胶作为固定相和 100% EtOAc 为淋洗 16 , 通过柱层析 (见步骤 1.5) 净化粗化合物.
警告: NNC 和相关的 nitrosamides 应小心处理, 因为它们被认为是人类致癌物. - 溶解 CDCl 中的纯化合物 3 并使用 NMR (参见步骤 1.2) 确认结构并确定此解决方案的浓度 17 。将此解决方案存储在 2-8 和 #176 的黑暗中, 直到需要为止.
注意: 此解决方案将用作 体外 检测 (步骤 3.5) 中的正向控制。在支持信息中提供了核磁共振波谱和化学位移. - 使用纯 NNC 解决方案, 通过在步骤1.3 和4.3 中描述的参数直接注入高分辨率质谱仪 (人力资源), 确定准确的母体质量并测定产品离子质量.
注: 产品质量将用于检测该化合物在 体外 代谢试验 (步骤 4.3).
3。一个例子 nitrosamine-P450 体外 孵化
- 删除 P450 2A6 Baculosomes, 生动-再生系统, 和 10 mM NADP + 库存解决方案从-80 和 #176; C 冷冻, 让他们解冻冰。一旦解冻, 稀释 Baculosomes 和再生系统1:10 和1:50 分别, 成一个单一的1毫升管与0.5X 反应缓冲器。同样, 添加3和 #956; NADP + 库存解决方案为97和 #956; l 0.5X 反应缓冲器.
注意: NADP + 是光敏的。通过将容器包装在铝箔中来保护此解决方案。酶解对冻融循环敏感;将此限制为不超过2个周期。为将来的实验做必要的准备等分. - 对于每个孵化, 添加50和 #956; 酶溶液 l (含 5 pmol P450) 至1毫升管, 包含40和 #956; l 4 和 #956; M NNN 的解决方案, 由反应缓冲器。预孵化这种新的混合物为2分钟, 在37和 #176; C 使用水浴, 然后添加10和 #956; 稀释的 NADP + 解决方案。孵育整个系统 1-30 分钟, 在37和 #176; C.
注: 使用5分钟的潜伏期 (如 5, 10, 15 分钟等) 将提供足够的 nitrosamide 形成时间的过程. - 在所需的孵育时间后, 先将10和 #956 进行淬火; 3.0 n ZnSO 4 , 然后是10和 #956; 3.0 n Ba (哦) 2 的 l. 漩涡这个解决方案和白色沉淀将形成。离心样品在 8000 x g 为4分钟颗粒的沉淀.
注: 此步骤不能暂停, 因为形成的 nitrosamides 在水溶液中的稳定性有限。长时间的停顿可能导致错误的底片. - 立即将上清液移出, 并分析2和 #956; 用液体色谱法正 nanoelectrospray 电离高分辨串联质谱法 (LC-NSI + -人力资源/毫秒, 步骤 4.1-4.3).
- 对于正控制孵化, 将含有 100 fmol 的合成 NNC 溶液的分蒸发到1毫升的管下, 在 N 的流下为 2 。对这个小瓶, 添加完整的酶系统从步骤3.2 和继续按照描述的步骤 3.3-3.4.
- 对于负控制孵化, 执行所描述的实验 (步骤 3.2-3.4), 除替换50和 #956; L 酶溶液与0.5X 反应缓冲器.
4。用于 lc 组件的 lc-NSI + -人力资源/MS
- 的 nitrosamide 检测参数的示例, 请将步骤4.2 中的以下多级渐变应用于使用商用、手动包装的 18 C18 (5 和 #956; m) 的 UPLC 系统,100毫米 x 75 和 #956; m, 15 和 #956; m 孔毛细管柱.
- 使用 5 mM NH 4 华侨作为溶剂 a 和 MeCN 作为溶剂 b, 通过在1和 #956 的 5% b 处运行, 将样品加载到列上; L/分钟从 0-5 分钟, 然后减慢流速到0.3 和 #956; 之后的升/分钟。接下来, 运行从5到 20% b 以上4分钟的渐变, 后跟一个斜坡到 55% b 以上10分钟, 然后 re-equilibration 到 5% b.
- 在 LTQ Orbitrap 上执行 LC-NSI + -人力资源/MS。通过全扫描和 MS 2 碎片监视 NNC。以6万的分辨率进行全扫描, 并以 5 ppm 的质量公差提取准确的母质量 (192.07670)。使用 ms 2 碎片分离父离子 (2.0) 和由碰撞引发的离解 (CID) 与 25 eV 的碰撞能量, 分辨率 1.5万, 和扫描时间30毫秒提取的产品离子的准确质量 NNC ( m/z 192 m/z 134.04739 和 162.07874) 的质量公差为 5 ppm.
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Representative Results
基于白色et al的工作。19, norcotinine 是硝化 NNC 清洁和高产 (80-92%), 以产生一个标准的体外实验。一个成功的反应的结构证据获得了从光谱分析包括1H 核磁共振, 13C 核磁共振, 舒适, 和 HSQC (支持信息) 与人力资源证实了父质量 [M + h]+在 5 ppm 的理论值 (图 2)。MS2的碎片 NNC 被用来确定最丰富的产品离子质量。在 NSI 的+-人力资源/MS 法中, 使用了测定的母体质量和产品离子质量. 如果储存在黑暗中在 2-8 ° c, NNC 溶液是稳定的至少3月。由于这是一个非常普遍的反应, 它有应用于任何2酰胺。
图 2: 人力资源和人力资源2频谱 NNC。
a) 精确的母质量 NNC 与质量容忍 5 ppm: 计算: [M + H]+ = 192.07675, 找到: 192.07670。B) MS2为m/z 192 的碎片, 其隔离宽度为2.0。两个最丰富的产品离子是134.04739 和162.07875。转载的许可, 从化学 Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205。版权所有2016美国化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.
以合成 NNC 为标准, 进行了体外P450 代谢试验。细胞色素 P450 2A6 的使用, 因为它是已知的有效催化剂的 NNN 氧化20。同样地, NNN 浓度被设置为2μ m, 因为它接近于α羟羟基的21的 Km 。在所描述的色谱条件下, 合成 NNC elutes 在母体离子和产物离子通道中, 在17.5 分钟内具有良好解析峰。根据阳性对照, NNC 在1、5、10分钟孵化。
图 3: NNN-细胞色素 P450 2A6 孵化谱产生的 LC-NSI-人力资源。
对所有部分, 顶部色谱是准确的母体质量从全扫描提取 NNC。中间和底部谱是两个精确的产品离子质量从 MS2碎片提取 NNC。部分如下: NNC 标准 (A), NNC 细胞色素 P450 2A6 孵化含有所有相关的酶和因子与潜伏期1分钟 (B), 5 分钟 (C), 10 分钟 (D)。RT = 保留时间;MA = 质量区域。请单击此处查看此图的较大版本.
NNC 水平最大值为5分钟, 后时间点下降。相对定量使用合成 NNC 作为标准估计最大 NNC 水平为 10 nM。在缺乏 P450 系统的负控制中, 没有检测到 NNC 的形成 (数据没有显示), 因此需要进行酶转化。同时, 该协议显示了直接的证据, NNN 转换为 NNC 的 P450 2A6, 虽然形成的程度是轻微的, 与α羟基化的 NNN。
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Discussion
阐明亚硝胺的代谢是了解其致癌性的重要组成部分。由于涉及的细胞色素 P450s 和其他代谢酶是多态的, 进一步应用这一知识可能会发现高危个体1,4。新的数据表明, 进一步氧化α-hydroxynitrosamines, 推定主要代谢物的亚硝胺参与 DNA 结合, 以 nitrosamides 是可能的;然而, 这并没有在广泛的基板上进行强有力的测试。我们已经描述了一个协议来确定性氧化亚硝胺的程度, 以 nitrosamides体外。这种方法的广泛应用将有助于确定这一代谢途径的整体重要性。
该方法首先准备一个标准的 nitrosamide 的利益。在示例研究中, NNC 是烟草致癌物 NNN 的一种假设代谢产物, 在烟草制品中发现了一种致癌物质14,22。如上所述, 硝化的 norcotinine 顺利进行, 没有可辨别的副产品。该产品只受起始酰胺和乙酸的污染, 易被柱层析除去。其次是核磁共振和人力资源的结构确认。这种方法的好处是它适用于几乎任何酰胺, 它允许多个硝/nitrosamide 系统被调查。此外, 使用核磁共振定量为标准解决方案17提供了直接的浓度测量。这就允许在惰性条件下储存化合物, 而不需要采用反相高效液相色谱等破坏性技术进行测量。然后进行各种稀释, 以适应实验设计。
具有正控制和具有良好特征的质量碎片模式, 高灵敏度和选择性 LC NSI+-人力资源/MS 方法允许检测 nitrosamides 在一个相对复杂的矩阵。如图所示, 该方法估计 NNC 浓度为 1-10 nM 或 2-20 fmol 在柱, 尽管1000倍以上的启动硝, 酶, 和其他因子。该方法的灵敏度和选择性是由于采用了高分辨率的质量监测, 这是标准的 LC-MS 系统所缺乏的。亲本离子选择与 5 ppm 质量公差确保只有化合物与所需的分子公式是孤立的。同样, 准确的质量检测两个最丰富的产品离子及其保留时间提供了额外的分析物确认。因此, 质谱法要求对多个参数进行优化, 包括隔离宽度、碰撞能量和扫描时间。LC 梯度也可以修改, 以提高灵敏度, 因为 co-elution 与其他物质将限制填补离子陷阱与目标 nitrosamide。
在示例研究14中, NNC 的形成是次要的。基于质量面积, NNC 比α-hydroxyNNN21的水解产物的丰度低4000倍。虽然这表明 NNC 是一个很小的代谢物的 NNN, 其他系统可能有所不同。乔杜里et al。发现相当可观, 性氧化硝和硝;但是, 在它们的条件下, nitrosamide 中间是无法检测到的12。通过这里所描述的技术重新他们的系统可能揭示 nitrosamide 的形成。无论它们的形成水平, nitrosamides 比α-hydroxynitrosamines 更高的稳定性可能表明, 这些化合物具有生物重要性, 因为它们应该更容易运输的细胞。
虽然这种方法将适用于大多数硝酶系统, 但也存在一些局限性。最重要的一点是, 该方法不是定量的。在实例实验中, 从阳性对照样品的质谱峰面积估计出地层。为了更精确的测量, 可以开发一种利用 isotopically 标签 nitrosamide 的同位素稀释方法。另一种方法是使用诸如n-acetyllysine 或n-乙酰半胱氨酸之类的化合物实现陷印策略, 但这在我们的手中是不成功的, 直到现在为止14。
另一个限制是 nitrosamides 容易水解的倾向9;因而样品必须单独地被处理。这会减慢工作流, 并防止将示例发送给协作者进行分析。最后, 应该指出的是, 虽然细胞色素 P450 2A6 和许多其他的商业可用, 一些需要蛋白质表达和纯化获得。例如, 此检测应用于细胞色素 P450 2A1314, 但仅在严格隔离进程23后才可用。
总之, 我们已经描述了一个协议的检测 nitrosamides 产生的细胞色素 P450-catalyzed 氧化亚硝胺体外。该协议包括一个 nitrosamide 标准的一般综合作为一个积极的控制和一个体外细胞色素 P450 代谢检测使用 LC-NSI+人力资源/MS 检测。在本例研究中, NNC 在所有潜伏期, 从 1-10 分钟不等, 但只是作为一个小代谢物的 NNN。本议定书适用于其他亚硝胺将评估其共性和潜在的作用, nitrosamides 在硝癌变。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了格兰特号的支持。CA-81301 来自国家癌症研究所我们感谢鲍勃的编辑协助, Dr. 彼得 Villalta 和鲁迅的质谱协助分析生物化学共享资源共济会癌症中心, 和 Dr. 亚当 t. Zarth 和 Dr. 安娜 k. 米歇尔的宝贵讨论和输入。分析生物化学共享资源由国家癌症研究院癌症中心资助 CA-77598 部分支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
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