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Cancer Research

कैंसर कोशिका लाइनों में जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना के लिए Monocytes/मैक्रोफेज की भर्ती का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर Microenvironment

Published: November 23, 2017 doi: 10.3791/56333
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

Summary

इस प्रोटोकॉल कैंसर सेल लाइनों और उसके बाद के उपयोग में एक कार्यात्मक Tet-ON प्रणाली की स्थापना के लिए एक योजना के रूप में कार्य करता है, ट्यूमर कोशिका की भूमिका के अध्ययन के लिए विशेष रूप से monocytes/मैक्रोफेज की भर्ती में प्रोटीन व्युत्पंन ट्यूमर microenvironment के लिए ।

Abstract

सिरना और shRNA-मध्यस्थता नीचे दस्तक (केडी) जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के तरीके जीन और प्रोटीन समारोह को समझने के लिए अमूल्य उपकरण हैं । हालांकि, इस मामले में है कि ब्याज की प्रोटीन के केडी कोशिकाओं या केडी के प्रत्याशित प्रभाव पर एक घातक प्रभाव है समय पर निर्भर है, बिना शर्त केडी तरीकों उचित नहीं हैं । सशर्त प्रणालियों इन मामलों में अधिक उपयुक्त है और अधिक ब्याज का विषय रहा है । इनमें Ecdysone-inducible एक्सप्रेस सिस्टम, Cytochrome पी-४५० प्रेरण प्रणाली1, और टेट्रासाइक्लिन विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली शामिल हैं ।

टेट्रासाइक्लिन विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में shRNA अभिव्यक्ति की प्रेरण द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति पर प्रतिवर्ती नियंत्रण सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम जीन अभिव्यक्ति के सशर्त विनियमन के लिए मानव कैंसर सेल लाइनों में कार्यात्मक Tet-ऑन सिस्टम का उपयोग कर एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत करते हैं । हम तो ट्यूमर सेल के अध्ययन में इस प्रणाली के उपयोग के प्रदर्शन-monocyte बातचीत ।

Introduction

ट्यूमर एसोसिएटेड मैक्रोफेज (TAMs) ट्यूमर विकास को बढ़ावा देने, मेटास्टेसिस, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के द्वारा ट्यूमर के लिए योगदान2. कैंसर कोशिकाओं भड़काऊ monocytes, जो ट्यूमर घुसपैठ और समर्थक tumorigenic TAMs3में अंतर भर्ती । TAMs के साथ ट्यूमर की घुसपैठ गरीब नैदानिक परिणाम के साथ संबद्ध है और मैक्रोफेज4,5के गुर्दे भूमिका से जोड़ा गया है । हालांकि, ट्यूमर के लिए मैक्रोफेज की भर्ती के तंत्र अच्छी तरह से पता लगाया है और शामिल रास्ते की एक बेहतर समझ क्षेत्र और होनहार चिकित्सा के आगे उन्नति के लिए महत्वपूर्ण है नहीं कर रहे हैं । ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर microenvironment (टीएमई) में सामान्य कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने में चुनौतियों में से एक तंत्र और कोशिकाओं शामिल की जटिलता है, इन विट्रो दृष्टिकोण है कि crosstalk के विच्छेदन की अनुमति की आवश्यकता होती है । यहाँ हम एक बहुमुखी पद्धति है कि एक कैंसर कोशिका के paracrine प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता वर्तमान-व्युत्पंन, मैक्रोफेज की तरह अन्य कोशिका प्रकार के प्रवास पर स्रावित प्रोटीन, इन विट्रो में. एक ऐसी प्रणाली का उपयोग करना जहाँ कैंसर कोशिका-monocytes की भर्ती में शामिल प्रोटीन के खिलाफ shRNA की अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन inducible प्रवर्तक के नियंत्रण में है, paracrine पर स्रावित प्रोटीन का monocytes प्रभाव quantitated है. इस प्रोटोकॉल में, टेट्रासाइक्लिन विनियमित वेक्टर में shRNA दृश्यों की क्लोनिंग स्थिर कैंसर सेल लाइनों की पीढ़ी के बाद प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, प्राथमिक मानव monocytes और एक Boyden चैंबर परख की शुद्धि के लिए एक कैंसर कोशिका monocytes के प्रवास पर प्रोटीन प्राप्त paracrine प्रभाव का विश्लेषण किया जाता है ।

प्रोटीन के Downregulation जीन कोडिंग सामांयतः सिरना और shRNA तकनीक के साथ लागू किया जाता है, हालांकि इसके उपयोग में सीमाओं के बिना नहीं । लंबी अवधि के दस्तक-नीचे (केडी) जीन की कोशिकाओं है कि प्रयोगात्मक परिणामों के साथ हस्तक्षेप के माध्यमिक अनुकूली प्रतिक्रियाओं में लाना हो सकता है । जीन अभिव्यक्ति पर अस्थाई नियंत्रण की कमी यह समय या सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण एक प्रोटीन की भूमिका के साथ एक प्रोटीन की गतिशील भूमिका का अध्ययन करने के लिए चुनौती देता है । इस मुद्दे में विशेष रूप से vivo सेटिंग्स में महत्वपूर्ण है, जहां ट्यूमर के विकास और प्रगति में एक प्रोटीन की भूमिका के लिए केवल ट्यूमर की स्थापना के बाद ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की downregulation की आवश्यकता हो सकती है । सशर्त केडी कोशिकाओं पर केडी के एक बहुत जल्दी घातक प्रभाव को रोकने का लाभ है, और ट्यूमर के विकास के विभिंन चरणों के भीतर प्रोटीन की भूमिका का विश्लेषण सक्षम है, जबकि बिना शर्त केडी ट्यूमर के विकास की कमी में परिणाम सकता है ।

सशर्त केडी प्रणालियों की एक संख्या स्थिर केडी की सीमाओं का पता करने के लिए विकसित किया गया है । सशर्त जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों में शामिल है Ecdysone-inducible एक्सप्रेस सिस्टम, Cytochrome पी-४५० प्रेरण प्रणाली1, और टेट्रासाइक्लिन विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली । टेट्रासाइक्लिन-विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली एंटीबायोटिक टेट्रासाइक्लिन (या इसके अधिक स्थिर एनालॉग-doxycycline) के अलावा पर shRNA की अभिव्यक्ति पर नियंत्रण की अनुमति देते हैं । tet-ऑन सिस्टम्स में, shRNA की अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन/doxycycline की उपस्थिति में एक जीन अभिव्यक्ति केडी में जिसके परिणामस्वरूप प्रेरित है, जबकि tet-बंद प्रणालियों में, shRNA की अभिव्यक्ति जीन अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में दबा दिया जाता है. टेट्रासाइक्लिन-inducible प्रणाली की एक खामी पहले doxycycline के अभाव में shRNA की अभिव्यक्ति के निम्न स्तर की सूचना दी है-तथाकथित leakiness6,7. tet-ऑन सिस्टम में यहां वर्णित, टेट्रासाइक्लिन के प्रशासन पर, constitutively के बंधन टेट्रासाइक्लिन दमन (TetR) के लिए tet-उत्तरदायी तत्व (TRE) के लिए प्रोटीन ब्याज की एच 1 प्रमोटर क्षेत्र के भीतर shRNA व्यक्त की है दबा. shRNA की अभिव्यक्ति में यह परिणाम और एक टेट्रासाइक्लिन-निर्भर तरीके से ब्याज की प्रोटीन के अनुवाद के निषेध8,9।

अन्य उपलब्ध Tet-ऑन सिस्टम टाटा बॉक्स और समीपस्थ अनुक्रम तत्व (सार्वजनिक उपक्रम) के बीच और टाटा बॉक्स और प्रतिलेखन शुरू चान एट अलद्वारा विकसित की साइट के बीच TetO अनुक्रम के एक साथ दस्तक में शामिल हैं । 10 इस प्रणाली के लिए shRNA अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए टेट्रासाइक्लिन की तुलना में कम विषाक्त खुराक की आवश्यकता है, तथापि, एक गैर प्रेरित राज्य के तहत, shRNA के निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं । Krüppel-एसोसिएटेड बॉक्स (KRAB) आधारित Tet-ऑन सिस्टम11 में KRAB, जिंक फिंगर प्रोटीन, जो KRAB बाइंडिंग साइट के एक 3 केबी रेंज के भीतर स्थित जीन transcriptional दमन करने के लिए शामिल हैं । chimeric प्रोटीन tTRKRAB TetO के लिए बाध्य कर सकते हैं, और डीएनए नियंत्रणीय क्षमता की बड़ी रेंज के कारण, TetO प्रतिलेखन शुरू साइट और प्रमोटर के बीच सीमित होने की जरूरत नहीं है और प्रमोटर की गतिविधि पर कम प्रभाव पड़ता है । गैर प्रेरित राज्य के तहत, इस नियंत्रणीय आरएनए हस्तक्षेप प्रणाली shRNA11,12की लीक अभिव्यक्ति का एक निचला स्तर दिखाने के लिए सूचित किया गया था; हालांकि, यह एक अनुक्रमिक, दो वेक्टर क्लोनिंग दृष्टिकोण की आवश्यकता है । पहले विकसित की तुलना में ऐसी Ecdysone-inducible एक्सप्रेस प्रणाली या Cytochrome पी-४५० प्रेरण प्रणाली के रूप में सशर्त केडी प्रणालियों, टेट्रासाइक्लिन विनियमित प्रणाली अपनी मजबूती और reversibility का लाभ है, और इसलिए सबसे नियमित रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली13। प्रणाली इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया दोहरी TetO दस्तक पर लाभ प्रणाली में और KRAB Tet-प्रणाली पर है के रूप में यह सीधे आगे की आवश्यकता है, एकल वेक्टर क्लोनिंग, कई क्लोनों के त्वरित पीढ़ी की अनुमति है, और यह प्रदर्शन में leakiness के बहुत कम स्तर doxycycline की अनुपस्थिति ।

टीएमई कैंसर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । ट्यूमर के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए, कैंसर कोशिकाओं chemotactic प्रोटीन स्रावित द्वारा भड़काऊ monocytes भर्ती । भर्ती monocytes ट्यूमर और प्रो-tumorigenic TAMs है कि ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस में योगदान में अंतर घुसपैठ । इन विट्रो में प्रतिरक्षा सेल भर्ती का उपयोग प्रवास परख, Boyden चैंबर परख के साथ व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है14,15,16,17। इस परख में, chemoattractant प्रोटीन स्रोत, उदाहरण के लिए, कैंसर की कोशिकाओं, या एक शुद्ध प्रोटीन, नीचे चैंबर में रखा गया है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं ऊपरी कक्ष में नीचे डिब्बे से छिद्रित झिल्ली के साथ अलग रखा जाता है । कोशिकाओं chemoattractant के बढ़ते ढाल की ओर पलायन, और झिल्ली के निचले हिस्से पर पाया उन दाग और माइक्रोस्कोप के तहत गिना रहे हैं । यहां हम स्थिर पैदा करके monocytes पर Plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक 1 (पै-1) के chemoattractant समारोह का परीक्षण, inducible कैंसर सेल लाइनों जहां पै की अभिव्यक्ति-1 doxycycline इसके अलावा द्वारा विनियमित है । monocyte प्रवास में पै-१ की भूमिका का आकलन करने के लिए हम मानव प्राथमिक monocytes का Boyden चेम्बर प्रवास परख में उपयोग करते हैं. THP1 जैसे मानव प्राथमिक monocytes और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया monocytic सेल लाइनों के बीच अंतर रिपोर्ट किया गया है और विभिन्न cytokine अभिव्यक्ति पैटर्न18शामिल हैं; उदाहरण के लिए, मानव monocytes19की तुलना में THP1 कक्षों द्वारा TNF-α व्यंजक स्तरों में 5-10 गुना वृद्धि. THP1 कोशिकाओं मानव ल्यूकेमिया monocytic कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं, बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं, और 19-50एच20 के एक औसत दोहरीकरण समय के साथ पैदा. इसके विपरीत, मानव monocytes वृद्धि कारकों के अभाव में एक छोटी उम्र की विशेषता है । चूंकि monocytes दाताओं के रक्त से शुद्ध कर रहे हैं, परिवर्तनशीलता का एक उचित मात्रा में व्यक्तियों के बीच होता है और शुद्धि विधि पर निर्भर करता है, अन्य कोशिका प्रकार के साथ संदूषण हो सकता है. फिर भी, प्राथमिक monocytes प्रासंगिक है और इसे का उपयोग करें या जैविक अनुसंधान में प्राथमिक monocytes का उपयोग कर monocytic सेल लाइनों के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि की सिफारिश की गई है19। यहां हम परिधीय रक्त से मानव प्राथमिक monocytes के शोधन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । monocyte शुद्धिकरण के वैकल्पिक तरीकों घनत्व ढाल और आसंजन प्रोटोकॉल और Ficoll के एकल ढाल के साथ दो कदम प्रक्रिया-Hypaque एक Percoll ढाल द्वारा पीछा शामिल21। monocyte जनसंख्या की शुद्धता उन विधियों द्वारा प्राप्त की ७०-९०% के बीच पर्वतमाला । विधि यहां वर्णित एक घनत्व एक नकारात्मक प्रतिरक्षा चयन22 के बाद ढाल का उपयोग करता है और एंटीबॉडी के साथ सीधे संपर्क के बिना मानव monocytes की शुद्धि को सक्षम बनाता है, जिससे उनके आकस्मिक सक्रियण से बचने और एक में जिसके परिणामस्वरूप > ९५% monocytes की शुद्ध जनसंख्या ।

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक कार्यात्मक Tet-मानव कैंसर सेल लाइनों में जीन अभिव्यक्ति केडी के लिए प्रणाली पर स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कैंसर के chemoattractant प्रभाव-स्रावित प्रोटीन पै-1 monocytes पर व्युत्पंन । पै-1 ट्यूमर की एक किस्म से व्यक्त की है और अपनी अभिव्यक्ति विडंबना गरीब नैदानिक परिणाम23,24के साथ संबद्ध है । पै-1 की प्रो-tumorigenic भूमिका इसके प्रो-angiogenic और एंटी-अपोप्तोटिक फंक्शन्स25,26का परिणाम है । पै-1 सूजन के लिए मैक्रोफेज की भर्ती को बढ़ावा देने के द्वारा सूजन में योगदान करने के लिए दिखाया गया है27। पै-1 चिकनी मांसपेशी को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था cellmigration28,29 और में भाग लेने के लिए मैक-1 निर्भर macrophage माइग्रेशन30. पै-1 का इजहार भी काफी B16F10 मेलेनोमा ट्यूमर में रॉ २६४.७ मैक्रोफेज की भर्ती में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है31. हालांकि टैम माइग्रेशन में पै-1 की भूमिका की जांच विस्तार से नहीं की गई है । हम वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के सवाल का जवाब है कि क्या पै-1 कैंसर कोशिकाओं को monocytes आकर्षित करती है । यह पद्धति कैंसर कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन मुंह और टीएमई के घटकों का विश्लेषण करके ट्यूमर और टीएमई के बीच crosstalk के विच्छेदन की अनुमति देता है ।

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Protocol

मानव monocytes स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त का उपयोग करता है जो प्रोटोकॉल अनुभाग बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करती है और मानव सामग्री के तहत संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है प्रोटोकॉल संख्या: सीसीआई 08-00208 ।

1. टेट्रासाइक्लिन-विनियमित shRNA अभिव्यक्ति के साथ कैंसर सेल लाइनों की तैयारी

  1. shRNA पै की क्लोनिंग-1 में Tet-pLKO-पूरो वेक्टर 8 , 9
    1. डिजाइन shRNA oligomers कि उंरमैं और पारिस्थितिकीआरआई 5 ' अंत में दरार साइट, नब्ज अनुक्रम, एक 6 न्यूक्लियोटाइड पाश, और antisense अनुक्रम होते हैं ।
      नोट: ठेठ oligonucleotides इस प्रकार के रूप में डिजाइन किए हैं: फॉरवर्ड oligo: 5 ' CCGG-19-21 बीपी नब्ज-CTCGAG-19-21 बीपी antisense-TTTTT, रिवर्स oligo: 5 ' AATTAAAAA-19-21 बीपी नब्ज-CTCGAG-19-21 बीपी antisense 3 ' । oligomer डिजाइन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल 8में पाया जा सकता है । इस अध् ययन में 3 shRNA के विरूद्ध पै-1 का सबसे मजबूत मुंह प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया: shRNA 1३२, shRNA 2, shRNA 3३३, और तले३३ तालिका 1में शामिल हैं ।
    2. एनएन shRNA oligomers और तले shRNA oligomers ।
      1. पुनर्गठित oligonucleotides को १०० µ मीटर पानी में और मिश्रण 1 µ l आश oligonucleotide, 1 µ l रिवर्स oligonucleotide, और 8 µ l ज2हे.
      2. oligonucleotides को एनएन, निंनलिखित मिश्रण: 1 µ एल oligonucleotide मिश्रण, 5 µ एल बफर 10 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) पीएच ७.५, ५० मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl2), 1 मिमी dithioerythritol (DTE), और ४४ µ एल एच 2 हे.
      3. 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर एक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) थर्मल साइकिल चालक में मिश्रण मशीन, बंद साधन स्विच, और कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंच गया है जब तक इंतजार ।
    3. हाला annealed oligonucleotides जोड़कर 5 µ l 3 M सोडियम एसीटेट pH ५.२ से ५० µ l annealed oligonucleotides.
      1. जोड़ें १०० µ l ठंडा १००% इथेनॉल (ेतोः) और में 30 मिनट के लिए मशीन-८० ° c । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक benchtop केंद्रापसारक में केंद्रापसारक ।
      2. निकालें supernatant, जोड़ें ५०० µ l ठंडा ७०% ेतोः, 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक, हटाने supernatant, और 20 में गोली भंग µ एल एच2ओ ।
      3. spectrophotometry द्वारा annealed oligonucleotides की एकाग्रता का आकलन करें, २६० एनएम पर अवशोषक को मापने । 1 एनजी/µ एल के अंतिम एकाग्रता के लिए oligonucleotides पतला
    4. Luria Bertani (पौंड) मध्यम और पौंड आगर प्लेटें तैयार करें ।
      1. पौंड मध्यम के लिए, 10 ग्राम tryptone, 5 ग्राम खमीर निकालने, 10 ग्राम पानी की 1 एल में NaCl भंग । 1 N NaOH और आटोक्लेव का उपयोग कर पीएच ७.० के माध्यम से पीएच समायोजित करें ।
      2. पौंड के लिए प्लेटें आगर, पौंड मध्यम में आगर के 15 ग्राम/ आटोक्लेव और लगभग ५० डिग्री सेल्सियस के लिए शांत हो जाओ । एंटीबायोटिक जोड़ें और प्लेटें डालो ।
    5. लकीर जीवाणु Tet-pLKO-पूरो सदिश के साथ transduced ( सामग्री की तालिकादेखें) पौंड आगर प्लेट पर १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (O/
    6. लगाना १०० मिलीलीटर पौंड मध्यम १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन (LB/एम्पीसिलीन) से 1 कॉलोनी के साथ पूरक है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए O/
    7. IsolateTet-pLKO-पूरो से १०० मिलीलीटर बैक्टीरियल कल्चर एक प्लाज्मिड आइसोलेशन किट का उपयोग कर ।
    8. Tet-pLKO-पूरो वेक्टर EcoRI और AgeI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ निम्नानुसार के लिए प्रतिबंध प्रतिक्रिया तैयार करें: 1 µ l EcoRI, 1 µ l AgeI, 5 µ l 10x बफर, 1 µ l प्लाज्मिड डीएनए (1 µ g), ४२ µ l ज2O. मशीन 1 ३७ डिग्री सेल्सियस पर ज. के लिए पर्याप्त प्राप्त करने के लिए सट वेक्टर, अप करने के लिए तैयार 5 x ५० µ l प्रतिक्रियाओं.
    9. एक डीएनए शोधन किट का उपयोग कर agarose जेल से सट वेक्टर शुद्ध करने के लिए 1% agarose जेल का प्रयोग करें । डीएनए की पैदावार बढ़ाने के लिए, बड़े कुओं के लिए एक agarose जेल कंघी का उपयोग करके और ध्यान से एक स्केलपेल का उपयोग कर बैंड से agarose के अधिकांश को हटाने के द्वारा जेल में डीएनए अनुपात करने के लिए agarose को कम ।
    10. इस प्रकार के रूप में बंधाव रिएक्शन मिक्स तैयार करें: 1 एनजी annealed oligonucleotides, ५० एनजी सदिश, 2 µ एल 10x ligase बफर, 1 µ एल ligase, और 20 µ एल Ligate के साथ वेक्टर annealed shRNA oligonucleotides पर 16 डिग्री सेल्सियस O/
      1. इसके अलावा, oligonucleotides बिना एक नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया unसट के लिए खाते में, आंशिक रूप से सट, और आत्म ligated वेक्टर कि झूठी सकारात्मक कालोनियों में परिणाम होगा तैयार करते हैं ।
    11. मानक परिवर्तन तकनीक का प्रयोग, रासायनिक सक्षम बैक्टीरियल सीधे दोहराता युक्त lentiviral वैक्टर के मुताबिक़ पुनर्संयोजन को रोकने के लिए डिज़ाइन कोशिकाओं में बंधाव मिश्रण बदलना ।
    12. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन O/N के साथ प्लेटों पर बैक्टीरिया बढे ।
      नोट: यदि उपग्रह कॉलोनियों की वृद्धि होती है, परिवर्तन को दोहराने और 30 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ने के लिए नीचे वृद्धि धीमी और इस तरह उपग्रह कालोनियों को रोकने के ।
    13. सफल बंधाव को सत्यापित करने के लिए, 10-20 एकल कालोनियों, inoculating 2 मिलीलीटर पौंड/एम्पीसिलीन संस्कृतियों और एक एम्पीसिलीन प्लेट के बीच एक शेयर प्लेट के रूप में उठाओ (बाद में एक सकारात्मक क्लोन के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए O/N के साथ तरल संस्कृतियों हो जाना । ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली ओ/
    14. 6 डिग्री सेल्सियस पर parafilm और स्टोर के साथ प्लेट सील ।
    15. एक प्लाज्मिड आइसोलेशन किट का उपयोग कर तरल संस्कृतियों से प्लाज्मिड डीएनए को अलग.
    16. XhoI एंजाइम का उपयोग एम्पीसिलीन प्रतिरोधी कालोनियों से पृथक प्लाज्मिड डीएनए के प्रतिबंध विश्लेषण प्रदर्शन । प्रत्येक क्लोन के लिए, निंनलिखित प्रतिक्रिया तैयार मिश्रण: ०.५ µ एल XhoI, २.५ µ एल 10x बफर, 1 µ एल प्लाज्मिड डीएनए (०.५ µ जी), और 21 µ एल एच2ओ. 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । 1% agarose जेल पर प्रतिक्रिया चलाकर प्रतिबंध प्रतिक्रिया के परिणाम का विश्लेषण करें ।
      नोट: WT वेक्टर XhoI द्वारा सट के प्रतिबंध विश्लेषण 3 टुकड़े उत्पंन होगा: ८,४४७, १,८००, और २०० bp । १,८०० बीपी की Tet-pLKO-पूरो वेक्टर में सामान अनुक्रम सकारात्मक क्लोनों में मौजूद नहीं है shRNA-पै-1 और XhoI डाइजेस्ट के डीएनए टुकड़ों में परिणाम होगा आकार: ८,४४७, १९०, और १३० bp । के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, २,००० बीपी टुकड़ा डीएनए में एम्पीसिलीन प्रतिरोधी कालोनियों संख्या से अलग नहीं मिला है: 3, 8, और 11 । oligonucleotides के डिजाइन के आधार पर, सकारात्मक कालोनियों से डीएनए में प्राप्त टुकड़ों की लंबाई और संख्या भिंन हो सकती है ।
    17. Tet-pLKO-पूरो वेक्टर में shRNA अनुक्रम की उचित प्रविष्टि की जांच करें8,9अनुक्रमण द्वारा ।
    18. लगाना १०० मिलीलीटर पौंड/एम्पीसिलीन संस्कृति के साथ कॉलोनी के साथ सही क्लोन और विकसित O/N पर ३७ ° c ।
    19. अलग प्लाज्मिड डीएनए एक प्लाज्मिड आइसोलेशन किट का उपयोग कर ।
  2. lentivirus कणों की पीढ़ी ।
    1. कोट एक 15 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान पाली के साथ-l-Lysine ०.०१% पाली के बाँझ पानी समाधान के साथ पकवान की सतह को कवर करके-l-Lysine और आरटी पर 15 मिनट के लिए मशीनिंग । आकांक्षा और हवा से समाधान निकालें-बर्तन सूखी ।
    2. बीज 5 x 106 मानव भ्रूण गुर्दे २९३ कोशिकाओं (HEK293) पाली में कोशिकाओं-एल-Lysine-लेपित 15 सेमी पकवान, और Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में संस्कृति (DMEM) मध्यम ३७ ° c, 5% सह पर 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin मिश्रण (पेन/Strep) के साथ पूरक 2 जब तक वे ७०% प्रवाह तक पहुंचने ।
    3. वायरल कणों का उत्पादन करने के लिए, transfect HEK293 कोशिकाओं के साथ 25 µ g pLKO-Tet-On-shRNA, 25 µ g psPAX, (पैकेजिंग प्लाज्मिड), और 5 µ g pMD2. g plasmids (लिफ़ाफ़ा व्यक्त प्लाज्मिड) का उपयोग अभिकर्मक रिएजेंट ।
      नोट: psPAX और pMD2. G plasmids डिडिएर Trono लैब (इकोले पॉलीटेक्निक फेडरल डे लौसने, स्विट्जरलैंड) से एक उपहार हैं ।
    4. अगले दिन HEK293 कोशिकाओं को प्रेरित करने के माध्यम से DMEM पूरक के साथ 10 मिमी सोडियम butyrate और 20 मिमी HEPES पीएच ७.२, और संवर्धन के लिए 8 ज.
    5. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धो और 20 मिमी 4 युक्त ताजा DMEM मध्यम के 25 मिलीलीटर जोड़ने-(2-hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) पीएच ७.२ । ४८ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के बाद, ध्यान से pipetting द्वारा वायरस युक्त माध्यम इकट्ठा; फैल से बचें ।
    6. HEK293 कोशिकाओं को दूर करने के लिए एक ०.४५ µ मीटर सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एकत्र माध्यम फिल्टर. वायरल कणों युक्त मध्यम तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या बाद में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
  3. छुरा transfected की पीढ़ी सेल लाइंस
    1. बीज HCT116 बृहदांत्र कैंसर की कोशिकाओं और एमडीए-एमबी-२३१ स्तन कैंसर कोशिकाओं में ५०,००० कोशिकाओं पर DMEM मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एक 12-वेल प्लेट में 1% कलम/Strep के साथ पूरक । 5% CO2 पर ३७ ° c में मशीन जब तक कोशिकाओं ६०-७०% धाराप्रवाह हैं ।
    2. पंजाब के साथ कोशिकाओं को धो लें और 5% CO2पर ३७ ° c में कैंसर कोशिकाओं और मशीन के लिए वायरस युक्त मध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक नियंत्रण के रूप में, 10% FBS के साथ पूरक ताजा DMEM मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 1% पेन/Strep कैंसर की कोशिकाओं के साथ 2 कुओं के लिए ।
    3. ध्यान से वायरस युक्त माध्यम आकांक्षा से दूर । सेल को पंजाबियों से धोएं और मीडियम को 10% के साथ DMEM में बदलें (v/v) टेट्रासाइक्लिन-फ्री (Tet-free) FBS और 1% पेन/Strep ।
    4. ७२ ज के बाद, पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो और माध्यम बदलने के लिए DMEM 10% Tet-free FBS 1% पेन/Strep, 1 µ g/एमएल puromycin वायरस-transfected कोशिकाओं के चयन के लिए ।
      1. सेल लाइन पर निर्भर करता है, गैर transduced कोशिकाओं में puromycin सांद्रता (०.१, ०.५, 1, 2, और 5 µ जी/एमएल) की सीमा का परीक्षण करके इष्टतम चयन के लिए puromycin एकाग्रता समायोजित करें और जहां कोई नियंत्रण कोशिकाओं को जीवित सबसे कम एकाग्रता का चयन संस्कृति के 3 दिनों के बाद ।
    5. 3-14 दिनों के लिए puromycin की उपस्थिति में संवर्धन कक्षों द्वारा वायरस-transduced कक्षों का चयन करें. नियंत्रण के रूप में, गैर transduced कोशिकाओं, puromycin युक्त मध्यम और एक puromycin के बिना एक साथ के साथ दो अतिरिक्त कुओं तैयार करते हैं । कुओं पर नियंत्रण की तुलना में वायरस transduced कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से puromycin में कोशिकाओं की हत्या आंशिक निरीक्षण करते हैं ।
      नोट: गैर-transduced कोशिकाओं puromycin की उपस्थिति में विकसित नहीं होगा ।
    6. puromycin प्रतिरोधी HCT116 बृहदांत्र कैंसर और एमडीए-एमबी-२३१ स्तन कैंसर की कोशिकाओं में सशर्त केडी की दक्षता की पुष्टि करें ।
      नोट: doxycycline के प्रभावी एकाग्रता सेल लाइन इस्तेमाल के साथ अलग हो जाएगा और titrated होना चाहिए (आमतौर पर १०० एनजी/एमएल से 2 µ जी/एमएल) ।
      1. doxycycline एकाग्रता है कि कोशिकाओं के लिए विषाक्त लेकिन ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति downregulating में प्रभावी नहीं है निर्धारित करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, 1 µ g/mL सफलतापूर्वक इन विट्रो मेंउपयोग किया गया था ।
      2. संस्कृति की उपस्थिति और ०.१, 1, और 2 µ g/एमएल doxycycline की अनुपस्थिति में ७२ ज के लिए कोशिकाओं । पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा सेल lysate में downregulated प्रोटीन (यहां, पै-1) की अभिव्यक्ति का स्तर सत्यापित करें । HCT116 और एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं सशर्त व्यक्त shRNA नियंत्रण कोशिकाओं के लिए की तुलना करें ।
  4. वातानुकूलित माध्यम की तैयारी
    1. बीज 1 x 10 कोशिकाओं के6 doxycycline विनियमित pLKO के साथ छुरा transfected-shRNA युक्त lentiviruses में 10 सेमी व्यंजन ।
    2. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट (RPMI) मीडियम में 10% Tet-free FBS और 1% Pen/Strep के अभाव में और उपस्थिति में 1 µ g/एमएल doxycycline के लिए ३७ ° c पर 5% कं पर ७२ h के लिए सेल लाइंस बढ़ाएँ2, ताजा doxycycline दैनिक जोड़ने.
      नोट: RPMI माध्यम monocytes की संस्कृति की स्थिति के साथ संगत है । Doxycycline एक हल्का संवेदनशील यौगिक है । एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर द्वारा प्रकाश से सेल संस्कृतियों की रक्षा और प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम के तहत काम करने से बचें ।
    3. pipetting द्वारा माध्यम ले लीजिए, ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, और aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।

2. मानव रक्त से Monocytes का अलगाव

  1. मानव परिधीय रक्त से monocytes को अलग ।
    नोट: मानव प्राथमिक monocytes स्वस्थ प्लेटलेट दाताओं से प्राप्त एक ल्युकोसैट फिल्टर में केंद्रित सफेद रक्त कोशिकाओं के 7 मिलीलीटर से अलग कर रहे हैं । दाता के आधार पर, एक ल्युकोसैट फ़िल्टर 1 x 109 और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) के 2 x 109 के बीच का उत्पादन, जिनमें से लगभग 10% monocytes का गठन ।
    1. लामिना प्रवाह कैबिनेट में कार्यस्थान तैयार करें ।
    2. निष्फल कैंची और पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) के साथ लामिना प्रवाह कैबिनेट 30 मिनट के लिए ।
    3. लामिना फ्लो कैबिनेट के अंदर ७०% ेतोः और एयर-ड्राई के साथ ल्युकोसैट फिल्टर को स्प्रे करें ।
    4. ल्युकोसैट फ़िल्टर के दोनों सिरों को कैंची से काटें और फ़िल्टर की सामग्री को एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में खाली करें ।
    5. 1% से युक्त पंजाबियों जोड़कर ९० मिलीलीटर को पतला करें (v/v) FBS (पंजाब/FBS) ।
    6. 15 मिलीलीटर घनत्व ढाल समाधान के साथ 3 एक्स ५० मिलीलीटर ट्यूबों तैयार करें । परत धीरे FBS के 30 मिलीलीटर/घनत्व ढाल समाधान एक पिपेट नियंत्रक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह पर सेट का उपयोग करने के लिए परतों के मिश्रण से बचने के ऊपर खून पतला ।
    7. 25 मिनट के लिए ब्रेक के बिना आरटी पर ४०० x जी में एक स्विंग रोटर में केंद्रापसारक ।
    8. शीर्ष परत निपटाने और एक ताजा ५० एमएल ट्यूब करने के लिए PBMCs युक्त मध्यम परत हस्तांतरण ।
    9. //FBS ऊपर ५० मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए आर टी पर १२० x g पर केंद्रापसारक । प्लेटलेट्स युक्त supernatant निकालें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
    10. पंजाब के ५० मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड/FBS और एक hemocytometer का उपयोग कर PBMCs गिनती । RT पर १२० x जी पर केंद्रापसारक और पंजाब में गोली reसस्पेंड/FBS युक्त 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (पंजाब/FBS/EDTA) 5 x 107 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए/
    11. गैर-monocytic कोशिकाओं की कमी से monocytes को समृद्ध करने के लिए एक नकारात्मक चयन किट का प्रयोग करें ।
      नोट: नकारात्मक चयन किट (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, और glycophorin ए) के खिलाफ टी कोशिकाओं, NK कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, बी कोशिकाओं, granulocytes, और एरिथ्रोसाइट्स एंटीबॉडी का एक कॉकटेल का उपयोग करता है । एंटीबॉडी परिसरों इन गैर-monocytic कोशिकाओं की सतह के लिए और dextran चुंबकीय कणों के लिए बाध्य । जब ट्यूब एक चुंबक में रखा जाता है, मोती ट्यूब की दीवारों का पालन और समाधान से गैर monocytic कोशिकाओं को हटा दें ।
      1. Add ५० µ l के एंटीबॉडी कॉकटेल को 1 मिलीलीटर 5 x 107 PBMCs/ml, एक पिपेट के साथ मिश्रण, और आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन जोड़ें ५० µ l चुंबकीय मोती एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ PBMCs करने के लिए, एक पिपेट के साथ मिश्रण, और आरटी पर एक और 10 मिनट के लिए मशीन ।
      2. FBS/EDTA 25 मिलीलीटर तक जोड़ें और एक चुंबक है कि एक ५० मिलीलीटर ट्यूब को समायोजित कर सकते में PBMC मिश्रण जगह है । आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन चुंबकीय मोती ट्यूब की दीवारों का पालन करेंगे और समाधान से गैर-monocytic कोशिकाओं एकांत ।
    12. एक 25 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, चुंबक में ट्यूब से monocytes युक्त समाधान निकालें । पिपेट के साथ ट्यूब के पक्षों को छूने के लिए नहीं सावधान रहना ।
    13. RT पर २५० x g पर समाधान केंद्रापसारक, supernatant निकालें, और RPMI माध्यम में monocytes युक्त गोली 10% Tet-मुक्त FBS और 1% पेन से reसस्पेंड/Strep ।

3. Boyden चैंबर प्रवासन परख

  1. 1% तैयार (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) ultrapure पानी की १०० मिलीलीटर में BSA के 1 जी भंग करके समाधान, और एक ०.२ µm ताकना आकार के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए निष्फल ।
  2. 1% में छिद्रित झिल्ली आवेषण मशीन बाँझ BSA समाधान ओ/झिल्ली के लिए मैक्रोफेज के बेहतर पालन के लिए । monocytes/मैक्रोफेज के लिए, 5-8 µm ताकना आकार आवेषण का उपयोग करें ।
    1. 1% BSA समाधान के साथ एक बाँझ ऊतक संस्कृति पकवान भरें और पकवान में आवेषण जगह है । लागू २०० µ l 1% BSA समाधान अंदर न्या.
  3. बाँझ पंजाबियों से भरी डिश में रखकर और फिल्टर के अंदर पंजाबियों को लगाने से दो बार आवेषण को धो डालें ।
  4. बीज ४०,००० HCT116 या एमडीएस-एमबी-२३१ कक्ष में ०.५ मिलीलीटर RPMI मध्यम से 10% Tet-मुक्त FBS और 1% पेन/Strep प्रति खैर, एक 24 वेल प्लेट में, तपसिल में. वैकल्पिक रूप से, जगह chemoattractant के एक स्रोत के रूप में अच्छी तरह से पहले से उत्पंन वातानुकूलित मध्यम के ०.५ मिलीलीटर ।
  5. अगले दिन, प्लेट ८,००० monocytes में तैयार डालने में सम्मिलित RPMI मध्यम 10% Tet-free FBS और 1% पेन/Strep, तपसिल में, और 5% CO2पर ३७ ° c में मशीन ।
  6. ४८ ज के बाद आवेषण इकट्ठा ।
    नोट: एक प्रयोग की लंबाई विशिष्ट स्थितियों और कोशिकाओं का इस्तेमाल किया, एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग जहां आवेषण अलग मशीन समय पर एकत्र कर रहे है प्रदर्शन के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
    1. अधिक माध्यम से हिला और ठीक एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ भीतरी सतह ज़ोर से मारना कोशिकाओं है कि पलायन नहीं किया निकालने के लिए ।
    2. राइट-Giemsa विधि का उपयोग कर आवेषण के बाहरी ओर दाग ।
    3. ध्यान से एक उच्च चिपचिपापन माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल में 3 आवेषण/ग्लास स्लाइड, सुनिश्चित करें कि माइग्रेट मैक्रोफेज के साथ फिल्टर के पक्ष को चेहरे बनाने ।
  7. छवि 20X उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड । 9 क्षेत्रों की तस्वीरें ले लो/ गिनती माइग्रेट मैक्रोफेज 9 फ़ील्ड्स में फ़िल्टर/

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Representative Results

पई-1 के सबसे कुशल केडी के लिए तीन shRNA के जुगाड़ का परीक्षण किया गया । इसके लिए shRNA के विरूद्ध पै-1 और तले हुए जुगाड़ (टेबल 1) के ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन Tet-pLKO-पूरो एक्सप्रेशन वेक्टर में क्लोन किया गया । एचटी-१०८० fibrosarcoma सेल लाइन के निर्माण के साथ छुरा transfected था और कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए doxycycline के साथ इलाज किया गया । पै-1 की अभिव्यक्ति पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 2a) और पै-1 के लिए इसी बैंड की तीव्रता और tubulin द्वारा सत्यापित किया गया था densitometry द्वारा विश्लेषण किया गया था । सबसे प्रभावी केडी अनुक्रम (shRNA 2) का उपयोग करना, हम इसके अतिरिक्त एमडीए-एमबी-२३१ उपकला स्तन ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) और HCT116 कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं (चित्रा 2c) छुरा transfected एक टेट्रासाइक्लिन-विनियमित के साथ उत्पन्न pLKO-shRNA2-पै-1 अभिव्यक्ति वेक्टर (और एक नियंत्रण के रूप में तले हुए shRNA) । हमने एमडीए में पै-1 एक्सप्रेशन की ७४% कमी हासिल की-एमबी-२३१ सेल लाइन (चित्रा 2 बी) और HCT116 सेल में १७.५% की कमी doxycycline की उपस्थिति में रेखा (1 µ g/mL)(figure 2c) के रूप में पश्चिमी सोख्ता और densitometric विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन बैंड । Boyden चैंबर परख कैंसर कोशिकाओं के प्रति monocytes के प्रवास को यों तो इस्तेमाल किया गया था । हम परिकल्पना की है कि कैंसर कोशिका प्राप्त पै-1 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रति monocytes के प्रवास को बढ़ावा देता है, और इसलिए कम प्रवास जब पै-1 doxycycline के अलावा द्वारा downregulated है मनाया जाएगा । कैंसर की कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए doxycycline के साथ इलाज किया गया और ४०,००० कोशिकाओं पर एक 24 अच्छी तरह से थाली के नीचे में वरीयता प्राप्त/ शुद्धि प्राथमिक मानव monocytes परख के शीर्ष कक्ष में लागू किया गया और 24 ज के बाद, झिल्ली के नीचे से जुड़ी monocytes थे दाग और खुर्दबीन के नीचे गिना । हम यह प्रदर्शित करते है कि doxycycline के अभाव में और इसलिए पै की उपस्थिति-1, एमडीए में एमबी-२३१ और HCT116 कोशिकाओं (दोनों पै-1 shRNA और तले हुए नियंत्रण), काफी मानव monocytes (चित्रा 3) के प्रवास में वृद्धि हुई है । monocytes के प्रवासन तब ३३% और ७४% से हिचकते जब doxycycline सह संस्कृतियों में जोड़ा गया था और पै के उत्पादन-1 ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा विनियमित नीचे था (चित्र 3 ए, सी) । monocyte प्रवास का कोई निषेध transduced shRNA नियंत्रण है, जो भी संकेत दिया कि doxycycline निरोधात्मक प्रवास पर कोई monocyte प्रभाव था के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मनाया गया था । इसी तरह के परिणाम प्राप्त हुए थे जब doxycycline-इलाज कैंसर कोशिकाओं के वातानुकूलित माध्यम chemoattractants के एक स्रोत के रूप में कुओं के नीचे रखा गया था (चित्र बी, डी) ।

Figure 1
चित्र 1 . 16 बैक्टीरियल कॉलोनियों से निकाले गए डीएनए का XhoI प्रतिबंध विश्लेषण । डीएनए 16 बैक्टीरियल कालोनियों से निकाला गया था और XhoI एंजाइम के साथ प्रतिबंध प्रतिक्रिया के अधीन । परिणामस्वरूप डीएनए टुकड़े agarose जेल ट्रो द्वारा विश्लेषण किया गया । सकारात्मक क्लोनों (लेन 3, 8, और 11) कि XhoI प्रतिबंध डाइजेस्ट के बाद 2 केबी टुकड़ा की कमी तीर से चिह्नित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . कैंसर सेल लाइनों में पै-1 अभिव्यक्ति की सशर्त केडी । वेस्टर्न सोख्ता की पै-1 अभिव्यक्ति कोशिका लाइनों में छुरा टेट्रासाइक्लिन के साथ transfected-विनियमित pLKO-shRNA-पै-1 (shRNA 1-3) और तले हुए अभिव्यक्ति वेक्टर doxycycline उपचार के 3 दिनों के बाद । (क) HT1080. (ख) एमडीएस-एमबी-२३१. (ग) HCT116 । बैंड के Densitometry विश्लेषण tubulin बैंड तीव्रता पर पै-1 की तीव्रता के अनुपात के रूप में पश्चिमी दाग की गलियों के नीचे संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . पै-1 हिमाली macrophage प्रवास । मानव monocytes की ओर प्रवासन (एक) एमडीए-एमबी-२३१ और (ग) HCT116 सेल लाइनों के साथ छुरा transfected वेक्टर सशर्त व्यक्त shRNA के खिलाफ 2-1 और तले हुए shRNA, Boyden चैंबर परख का उपयोग कर मापा । कैंसर की कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए doxycycline के साथ इलाज किया गया और तपसिल में एक 24 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त । सम्मिलित करने के लिए मानव प्राथमिक monocytes के ऊपर आवेदन किया गया । 24 घंटे के बाद, फिल्टर के निचले हिस्से पर monocytes दाग और माइक्रोस्कोप के तहत गिना रहे थे । ७२ से अधिक उत्पन्न वातानुकूलित माध्यम की ओर मानव monocytes का प्रवासन (B) एमडीएस-एमबी-२३१ और (D) HCT116 सेल लाइन्स सशर्त व्यक्त पै-1 की उपस्थिति और अनुपस्थिति में doxycycline. डेटा तकनीकी triplicates [+/-मानक विचलन (SD)] के माध्य का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक दोहराने के लिए, माइग्रेटेड monocytes को 20X उद्देश्य आवर्धन पर 9 फ़ील्ड्स में गिना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Oligo का नाम अनुक्रम
shRNA 1 (एंटी पै-1 अनुक्रम 1- 8 ) आगे: shPAI-1A5 ' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT ३ '
रिवर्स: shPAI-1b 5 ' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3 '
shRNA 2: (विरोधी पै-1 अनुक्रम 2) आगे: shPAI-1C 5 '-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3 '
रिवर्स: shPAI-1 डी 5 '-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3 '
shRNA 3 (एंटी पै-1 अनुक्रम-3 9) आगे: shPAI-1E 5 '-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3 '
रिवर्स: shPAI-1F 5 '-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3 '
हाथापाई (हाथापाई अनुक्रम-4 9) आगे: हाथापाई १ ५ '-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3 '
रिवर्स: हाथापाई 2 5 '-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3 '

तालिका 1. shRNA अनुक्रम. यहां 3 shRNA से पै-1 के खिलाफ जुगाड़ का सबसे मजबूत मुंह प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3, और तले हुए

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Discussion

कोशिका प्रकार की एक किस्म से बना है, टीएमई कैंसर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । इष्टतम विकास की स्थिति का पता लगाने के लिए, कैंसर कोशिकाओं chemotactic कारकों के स्राव के माध्यम से monocytes को आकर्षित । यहां हम इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं द्वारा monocyte भर्ती के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रयोजन के लिए, inducible जीन अभिव्यक्ति प्रणाली का एक संयोजन, प्राथमिक मानव monocytes का शुद्धिकरण, और एक प्रवास परख के एक उदाहरण के रूप में, Boyden चैंबर परख, प्रयोग किया जाता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम Tet-ON वेक्टर में shRNA अनुक्रम की सही क्लोनिंग की पुष्टि करना है, जिसे हमेशा अनुक्रमण द्वारा मूल्यांकित किया जाना चाहिए । कार्यात्मक स्थिर Tet के आगे की स्थापना-सेल लाइनों पर पश्चिमी सोख्ता द्वारा doxycycline की उपस्थिति में केडी परीक्षण द्वारा पुष्टि की जरूरत है । लागू doxycycline की मात्रा सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं, और इसलिए यह केडी के लिए प्रभावी सांद्रता और कोशिकाओं पर विषाक्तता के लिए परीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है । टेट्रासाइक्लिन-inducible प्रणालियों के एक ज्ञात नुकसान उनके leakiness6,7है । उपस्थिति और doxycycline की अनुपस्थिति में पाया प्रोटीन की मात्रा मापा और इस आशय के लिए खाते के लिए तले हुए नियंत्रण की तुलना में होना चाहिए. इन विट्रो प्रयोगों में, leakiness का एक निंन स्तर shRNA2 और shRNA3 केडी के साथ मनाया जाता है, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, यह हमेशा टेट्रासाइक्लिन मुक्त सीरम इन विट्रो में का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है नियंत्रण की स्थिति में प्रोटीन के स्तर के downregulation से बचने के लिए । प्रणाली इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल अंय Tet पर लाभ है के रूप में यह एक सदिश क्लोनिंग की आवश्यकता है, कई क्लोनों के त्वरित पीढ़ी की अनुमति देता है, और leakiness के बहुत कम स्तर प्रदर्शित करता है ।

रक्त से प्राथमिक मानव monocytes प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम अच्छा ढाल जुदाई है, जो घनत्व ढाल पर पतला रक्त की धीमी परत पर निर्भर प्राप्त है । प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण कदम को ठीक से नकारात्मक चयन कदम से पहले कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है क्योंकि यह एंटीबॉडी कॉकटेल और चुंबकीय मोतियों की मात्रा निर्धारित करेगा रक्त निलंबन को जोड़ा है । प्रयोगों के reproducibility का बीमा करने के लिए, एक से अधिक रक्त दाता दोहराने प्रयोगों प्रदर्शन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह तकनीक एक घनत्व ढाल और आसंजन-आधारित प्रोटोकॉल३४ और एक दो कदम प्रक्रिया एक ढाल21के साथ, क्योंकि यह वारंट कम लिम्फोसाइट संदूषण सहित monocyte शोधन के मौजूदा विकल्प से बेहतर है स्तर और उच्च शुद्धता (> 95%) प्राप्त monocytes की । चूंकि गैर-monocytic कोशिका प्रकार नकारात्मक चयन द्वारा PBMC मिश्रण से निकाल दिए जाते हैं, monocytes एंटीबॉडी कॉकटेल में मौजूद एंटीबॉडी के साथ सीधे संपर्क में नहीं आते हैं, और इसलिए एंटीबॉडी के साथ बातचीत द्वारा सक्रिय बनने monocytes का खतरा कम है । प्राप्त कोशिकाओं के वैकल्पिक अनुप्रयोगों के माध्यम से मैक्रोफेज में monocytes के भेदभाव शामिल हो सकते हैं इन विट्रो और vivo में प्रयोगों जहां मानव monocytes immunodeficient चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं. प्रोटोकॉल के संशोधनों सामांयतः PBMCs की धुलाई चरणों के दौरान लाल रक्त कोशिका lysis बफर का उपयोग शामिल हैं । इस संशोधन परासरणी दबाव लागू करने से लाल रक्त कोशिकाओं के अतिरिक्त हटाने का लक्ष्य है । तकनीक की सीमाएं मैक्रोफेज की एक सीमित संख्या है कि एजेंट का एक निर्दिष्ट राशि का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता शामिल हैं ।

Boyden चैंबर प्रवास परख एक तेज और सीधा तरीका है अगर एक गुप्त प्रोटीन या एक सेल लाइन अंय प्रकार के सेल के प्रवास को उत्तेजित करता है विश्लेषण है । इस परख के नुकसान कम संवेदनशीलता और कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर कोशिकाओं के लिए लेखांकन नहीं शामिल हैं । उन चिंताओं को हल करने के तरीके एक microfluidic आधारित परख और एक समय के पाठ्यक्रम के प्रयोग की तरह एक अलग परख के साथ परिणाम की पुष्टि होगी, जहां प्रवास समय की छोटी अवधि में मापा जाता है । छोटी आबादी को छोड़कर, परिपक्व monocytes vivo३५,३६ मेंनहीं पैदा; हालांकि अन्य कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, तो एक अपने विभाजन चक्र से कम समय रेखा कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से बचने के लिए चुना जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, कोशिका विभाजन अवरुद्ध एजेंट मूल मढ़वाया कोशिका संख्या को बदलने से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को आसानी से अंय कैंसर कोशिकाओं और उनके paracrine कार्यों से स्रावित प्रोटीन के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । सशर्त केडी कैंसर सेल लाइनों के संभावित अनुप्रयोगों में से एक प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन कर रहा है जिसका केडी न केवल इन विट्रो में कोशिकाओं के लिए विषाक्त है, लेकिन यह भी vivo में, जहां Tet विनियमित सेल लाइनों चूहों में xenotransplanted हैं, और केडी प्रेरित है पीने के पानी के लिए doxycycline के अलावा द्वारा ट्यूमर की स्थापना के बाद ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Jacqueline रोसेनबर्ग को स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम अमेरिका के स्वास्थ्य और मानव सेवा के विभाग द्वारा समर्थित किया गया था या DeClerck (ग्रांट 5R01 सीए १२९३७७) और टी जे Martell फाउंडेशन के लिए अनुदान के साथ स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों । MH कुबल बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स में सबन अनुसंधान संस्थान के एक अनुसंधान कैरियर विकास फैलोशिप पुरस्कार के प्राप्तकर्ता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tet-pLKO-puro lentiviral vector Addgene 21915
FBS (Tetracycline-free) Omega Scientific FB-15
Histopaque Sigma 10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell 19059
EasySep Magnet StemCell 18002
EcoRI HF NEB R3101S
AgeI HF NEB R3552S
Cut Smart buffer NEB B7200S
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System PROMEGA A9281
psPAX vector Addgene 12260
pMD2.G vector Addgene 12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain Protocol 123-869
HEK293 cells ATCC CRL-1573
PBS Corning 21-031-CV
XhoI restriction enzyme NEB R0146S
Ligase NEB M0202S
Ligase buffer NEB M0202S
EDTA 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific R1021
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
The Big Easy" EasySep Magnet Stem Cell 18001
0.1% Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S7670
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
0.45 μM syringe filters VWR International 28145-479
NaOH Sigma-Aldrich S5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Invitrogen 15504-020
Sodium Chloride(NaCl) Sigma-Aldrich S7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-100g
dithioerythritol (DTE) Sigma-Aldrich B8255-5g
ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich 792780
tryptone Amresco J859-500g
yeast extract Fluka 70161-500g
Bacto agar BD 214010
ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
puromycin Sigma-Aldrich P9620
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Corning 10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0 Thermo Fisher Scientific R1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane Becton Dickinson 353097
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cotton-Tipped Applicator  Medline MDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack  Fisher Scientific Company 123-869
Resolve Immersion Oil, High Viscosity Richard Allan Scientific M4004
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122

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References

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Kubala, M. H., DeClerck, Y. A.… More

Kubala, M. H., DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (129), e56333, doi:10.3791/56333 (2017).

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