Summary
Un protocollo è presentato per la sintesi di nanocristalli core-shell drogato con lantanidi upconversion (UCNs) e le loro applicazioni cellulare per regolazione della proteina canale su illuminazione a luce vicina all'infrarosso (NIR).
Abstract
Drogato con lantanidi upconversion nanocristalli (UCNs) hanno attirato molta attenzione negli ultimi anni sulla loro proprietà ottiche promettente e controllabile, che favoriscono l'assorbimento della luce di vicino infrarosso (NIR) e poterla convertire successivamente in base multiplexing delle emissioni che si estendono su una vasta gamma di regioni dal UV al visibile al NIR. Questo articolo presenta dettagliate procedure sperimentali per la sintesi ad alta temperatura co-precipitazione di core-shell UCNs che incorporano gli ioni lantanidi differenti in nanocristalli per la conversione efficiente di eccitazione di deep tissue penetrabile NIR (808 Nm) in una forte emissione blu a 480 nm. Controllando la modificazione superficiale con polimero biocompatibile (acido poliacrilico, PAA), il preparato come UCNs acquisisce grande solubilità in soluzioni tampone. I nanocristalli idrofili sono ulteriormente funzionalizzati con ligandi specifici (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) per la localizzazione sulla membrana cellulare. Al momento di luce NIR (808 nm) irradiazione, l'emissione di upconverted blu può efficacemente attivare la proteina canale luce-gated sulla membrana cellulare e specificamente regolare l'afflusso di cationi (ad esempio, Ca2 +) nel citoplasma. Questo protocollo fornisce una metodologia fattibile per la sintesi di core-shell drogato con lantanidi UCNs e successive modificazione superficiale biocompatibile per ulteriori applicazioni cellulari.
Introduction
Negli ultimi anni, drogato con lantanidi upconversion nanocristalli (UCNs) sono stati ampiamente utilizzati come alternativa ai coloranti organici convenzionali e punti quantici in applicazioni biomediche, che sono principalmente basate sul loro proprietà ottiche e chimiche eccezionali, tra cui ottima biocompatibilità, elevata resistenza al photobleaching e larghezza di banda stretta emissione1,2,3. Ancora più importante, possono servire come un promettente nanotransducer con tessuto eccellente penetrazione profondità in vivo per convertire vicino infrarosso (NIR) di eccitazione in una vasta gamma delle emissioni da UV, visibile e le regioni NIR attraverso un multi-fotone upconversion processo4,5. Queste proprietà uniche rendono drogato con lantanidi UCNs servire come un vettore particolarmente promettente per rilevamento biologico, imaging biomedico e malattie teranostica6,7,8.
Le componenti generali di UCNs si basano principalmente sugli ioni lantanidi drogati in matrice dell'ospite isolanti contenenti un sensibilizzante (ad es., Yb3 +, Nd3 +) e un attivatore (ad es., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) all'interno del cristallo in modo omogeneo9. L'emissione ottica diversa da nanocristalli è attribuita alla transizione elettronica localizzata all'interno gli orbitalif 4 dei droganti lantanidi a causa della loro scala-come organizzato energia livello10. Pertanto, è fondamentale per controllare con precisione le dimensioni e la morfologia delle UCNs sintetizzato con droganti multicomponente lantanidi. Dalla destra, alcuni metodi promettenti sono state ben stabilite per la preparazione di UCNs drogato con lantanidi, tra cui decomposizione termica, ad alta temperatura co-precipitazione, sintesi idrotermale, elaborazione di sol-gel, ecc.11 , 12 , 13 tra questi approcci, il metodo ad alta temperatura co-precipitazione è una delle strategie più popolare e conveniente per UCNs sintesi, che può essere controllato rigorosamente per preparare desiderata qualità nanocristalli con forma regolare e distribuzione delle dimensioni in un relativamente breve tempo di reazione e di basso costo14. Tuttavia, la maggior parte delle nanostrutture sintetizzati da questo metodo sono limitati principalmente con ligandi idrofobici come acido oleico e oleilammina, che in genere ostacolano la loro ulteriore bioapplication a causa della limitata solubilità ligando idrofobico in soluzione acquosa 15. di conseguenza, è necessario eseguire tecniche di modificazione superficiale adatto per preparare UCNs biocompatibile in applicazioni biologiche in vitro ed in vivo.
Qui, presentiamo la dettagliata procedura sperimentale per la sintesi di nanostrutture UCNs core-shell attraverso il metodo ad alta temperatura co-precipitazione e una tecnica di modificazione fattibile per funzionalizzare polimero biocompatibile sulla superficie UCNs per Ulteriori applicazioni cellulari. Questo nanoplatform UCNs incorpora tre ioni lantanidi (Yb3 +, Nd3 +e Tm3 +) in nanocristalli di acquisire forte emissione blu (~ 480 nm) al momento di eccitazione luce NIR a 808 nm, che ha una maggiore profondità di penetrazione in tessuto vivente. È ben noto che Nd3 +-drogati UCNs visualizzare gli effetti di assorbimento e surriscaldamento acqua ridotta a icona questa finestra spettrale (808 nm) rispetto ai convenzionali UCNs su 980 nm irradiazione16,17, 18. Inoltre, per utilizzare le UCNs nei sistemi biologici, i ligandi idrofobici (acido oleico) sulla superficie delle UCNs in primo luogo vengono rimossi tramite sonicazione in soluzione acida19. Quindi le UCNs privo di ligando vengono ulteriormente modificati con un polimero biocompatibile (acido poliacrilico, PAA) di acquisire grande solubilità in soluzioni acquose20. Inoltre, come un proof-of-concept in applicazioni cellulari, le UCNs idrofili sono ulteriormente funzionalizzati con ligandi molecolare (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) per la localizzazione specifica sul N3-etichetta della membrana cellulare. Al momento di luce NIR (808 nm) irradiazione, l'emissione di upconverted blu a 480 nm può efficacemente attivare una proteina canale luce-gated, channelrhodopsin-2 (ChR2), sulla cella la superficie e così facilitare l'afflusso di cationi (ad esempio, agli ioni di Ca2 + ) attraverso la membrana delle cellule viventi.
Questo video protocollo fornisce una metodologia fattibile per drogati lantanidi UCNs sintesi, modificazione superficiale biocompatibile e UCNs bioapplication in cellule viventi. Eventuali differenze nelle tecniche di sintesi e reagenti chimici utilizzati in nanocristallo crescita influenzerà gli spettri di luminescenza (UCL) dimensione upconversion, morfologia e distribuzione delle nanostrutture di UCNs finale utilizzata negli esperimenti di cella. Questo protocollo dettagliato dei video è disposta ad aiutare nuovi ricercatori in questo campo per migliorare la riproducibilità delle UCNs con il metodo ad alta temperatura co-precipitazione ed evitare gli errori più comuni in UCNs biocompatibile modificazione superficiale per ulteriori applicazioni cellulari.
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Protocol
Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue la sintesi di UCNs ad alta temperatura (~ 290 ° C), compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (ad es., occhiali protettivi, guanti, camice da laboratorio, lunghezza pantaloni e scarpe chiuse).
1. sintesi di Sorbetto_limone 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristalli core-shell Nd(20%)
- sintesi di Sorbetto_limone 4: nanostruttura core Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)
- Preparazione del RE (CH 3 CO 2) 3, soluzione di NaOH, NH 4 F metanolo riserva
Nota: le terre rare (ri) ioni lantanidi includono ittrio (Y), itterbio (Yb), Thulium (Tm) e neodimio (Nd).- Sciogliere 500 mg scandio acetato idrato in 5 mL di metanolo (100 mg/mL), itterbio (III) acetato idrato in 5 mL di metanolo (50 mg/mL), 10 mg Tulio (III) acetato idrato in 1 mL di metanolo (10 mg/mL), di 250 mg e 10 mg al neodimio (III) acetato idrato in 1ml metha Nol (10 mg/mL) in fiale di vetro con un bagno di pulizia ad ultrasuoni per 2 min.
- 400mg NaOH in una provetta da centrifuga 50 mL si combinano con 20 mL di metanolo con bagno ad ultrasuoni pulizia per preparare la soluzione di NaOH riserva (20 mg/mL).
- Combinare 600 mg NH 4 F in una provetta da centrifuga 50ml con 30 mL di metanolo con bagno ad ultrasuoni pulizia per preparare la soluzione di riserva di NH 4 F (20 mg/mL).
Nota: Inserire la soluzione madre di complessi di lantanidi, NaOH e NH 4 F in flaconcini di vetro, sigillare con parafilm e conservarli in frigorifero a ~ 4 ° C fino a quando necessario. Le soluzioni di riserva di metanolo preparati vengono sostituite una volta ogni 2 settimane.
- Preparazione di Sorbetto_limone 4: Yb/Tm/Nd core nanostruttura
- Pipettare 3 mL di acido oleico e 7 mL di 1-octadecene in un matraccio da tre colli di 50 mL. Soluzione
- combinare 1.089 mL della soluzione di riserva di Y (CH 3 CO 2) 3, 0,608 mL della soluzione madre Yb (CH 3 CO 2) 3, µ 83,6 l dello stock 3 Tm (CH 3 CO 2), e 128,5 µ l della soluzione madre 3 Nd (CH 3 CO 2) nel pallone.
- Montare un termometro (gamma 0 - 360 ° C) in un matraccio e lasciare che la sua punta toccare la soluzione. Collocare la beuta in un contenitore di vetro con olio di silicone phenylmethyl.
- Riscaldare la soluzione a 100 ° C con una piastra calda per evaporare il metanolo. Collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il metanolo residuo e mantenere la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 minuti mescolando.
- Aumentare la temperatura a 150 ° C e mantenere tale temperatura per 60 min. mantenere una velocità dell'agitatore di 700 giri/min durante la sintesi.
Nota: Impostare una moderata velocità di agitazione per evitare spruzzi la soluzione. - Interrompere la piastra riscaldante e mantenere il matraccio a temperatura ambiente per consentire la soluzione di raffreddare lentamente.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
Soluzione di riserva - combinare 2 mL di NaOH-metanolo e 2,965 mL di NH 4 F-metanolo soluzione stock in una provetta da centrifuga da 15 mL. Avvitare il tubo con il tappo e mescolare la soluzione potente nel Vortex per 5 s.
- Aggiungi la miscela di F NaOH-NH 4 lentamente nel pallone mediante una pipetta di vetro oltre 5 min.
- Aumentare la temperatura della miscela a 50 ° C e mantenere tale temperatura per 30 min.
Nota: Impostare la temperatura a non più di 50 ° C, perché la temperatura elevata promuoverà cristallo nucleazione e crescita. - Aumentare la temperatura (~ 100 ° C) per evaporare il metanolo e collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il metanolo residuo e mantenere la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 min.
- Cambiare la posizione del rubinetto per riempire il pallone con azoto.
- Aumentare la temperatura di 290 ° C ad una velocità di riscaldamento di ~ 5 ° C/min mantenere la miscela di reazione a 290 ° C per 1,5 h.
- Interrompere la piastra riscaldante e togliere il matraccio per consentire la miscela di reazione raffreddare lentamente a temperatura ambiente mescolando.
Attenzione: Fare attenzione della piastra riscaldante con temperatura elevata (> 400 ° C) per evitare gravi ustioni al contatto con la pelle. - Trasferire il composto in un matraccio in un tubo di centrifuga da 50 mL. Risciacquare il matraccio con 30 mL di etanolo e trasferire la soluzione nella provetta della centrifuga.
- Centrifugare il prodotto a 4.000 × g per 8 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
- Aggiungere 10 mL di esano per la provetta da centrifuga e ri-disperdere il prodotto con sonicazione (60 kHz, 240 W) per 2 min.
- Aggiungere 30 mL di etanolo al tubo. Rotazione verso il basso il prodotto a 4.000 × g per 8 min e poi scartare il surnatante.
- Ri-disperdere i prodotti solidi sul fondo della provetta da centrifuga con 5 mL di esano. Conservare la soluzione in frigorifero a ~ 4 ° C per un prossimo passo.
Nota: L'emissione di upconversion di core-shell UCNs è testato irradiando le soluzioni con un laser di 808 nm (2 W).
- Preparazione del RE (CH 3 CO 2) 3, soluzione di NaOH, NH 4 F metanolo riserva
- Preparazione di Sorbetto_limone 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristalli core-shell Nd(20%)
- combinare 3 mL di acido oleico e 7 mL di 1-octadecene in una boccetta di tre colli da 50 mL. Aggiungere 1,082 mL della soluzione madre 3 Y (CH 3 CO 2) e 2,87 mL della soluzione madre 3 Nd (CH 3 CO 2) nel pallone.
- Aggiungere la nanostruttura nucleo ottenuti (80 mg in 5 mL di esano dal passaggio 1.1.2.18) nel pallone mescolando.
- Montare un termometro (gamma 0 - 360 ° C) in un matraccio e lasciare che la sua punta toccare la miscela. Collocare la beuta in un contenitore di vetro con olio di silicone phenylmethyl.
- Di calore la miscela a 100 ° C nella parte superiore piastra calda per evaporare il metanolo ed esano. Collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il solvente residuo e mantenere la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 minuti mescolando.
- Aumentare la temperatura a 150 ° C e mantenerla per 60 min. Mantieni la velocità dell'agitatore a 700 rpm nella sintesi.
Nota: Impostare una moderata velocità di agitazione per evitare spruzzi la soluzione. - Interrompere la piastra riscaldante e togliere il matraccio per consentire la soluzione raffreddare lentamente a temperatura ambiente.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
Soluzione di riserva - Pipettare 2 mL di NaOH-metanolo e 2,965 mL di NH 4 F-metanolo soluzione stock in una provetta da centrifuga da 15 mL. Avvitare il tubo con il tappo e mescolare la soluzione potente nel Vortex per 5 s.
- Aggiungi la miscela nel pallone mediante una pipetta di vetro lentamente oltre 5 min.
- Aumentare la temperatura della miscela a 50 ° C e tenerlo a 50 ° C per 30 min.
Nota: Impostare la temperatura non supera a 50 ° C perché l'alta temperatura promuoverà cristallo nucleazione e crescita. - Aumentare la temperatura (~ 100 ° C) per evaporare il metanolo e collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il metanolo residuo, mantenendo la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 min.
- Cambiare la posizione del rubinetto per riempire il pallone con azoto.
- Aumentare la temperatura di 290 ° C ad una velocità di riscaldamento di ~ 5 ° C/min mantenere la miscela di reazione a 290 ° C per 1,5 h.
- Interrompere la piastra riscaldante e togliere il matraccio per consentire la miscela di reazione raffreddare lentamente a temperatura ambiente mescolando.
Attenzione: Fare attenzione della piastra riscaldante con temperatura elevata (> 400 ° C) per evitare gravi ustioni al contatto con la pelle. - Trasferire il composto in un matraccio in un tubo di centrifuga da 50 mL. Risciacquare il matraccio con 30 mL di etanolo e trasferire la soluzione nella provetta della centrifuga.
- Centrifugare il prodotto a 4.000 × g per 8 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
- Aggiungere 10 mL di esano per la provetta da centrifuga e ri-disperdere il prodotto con sonicazione (60 kHz, 240 W) per 2 min.
- Aggiungere 30 mL di etanolo al tubo. Rotazione verso il basso il prodotto a 4.000 × g per 8 min e poi scartare il surnatante.
- Ri-disperdere i prodotti solidi sul fondo della provetta da centrifuga con 5 mL di esano. Conservare la soluzione in frigorifero a ~ 4 ° C fino a quando necessario.
Nota: L'emissione di upconversion di core-shell UCNs è testato irradiando le soluzioni con un laser di 808 nm (2 W).
2. Sintesi di nanostrutture UCNs biocompatibile
- preparazione di ligando-libero UCNs nanoparticella
- combinare 30 mL di etanolo con la come-preparato oleato-capped UCNs soluzione (passo 1.2.18) in una provetta da centrifuga 50 mL. Centrifugare la miscela a 4.000 × g per 8 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
- Combinare 10 mL di soluzione acquosa acida (pH = 4) regolata da HCl (0,1 M) con il precipitato in 50 mL provetta e sciogliere il precipitato di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 30 min.
- Trasferimento la soluzione in un bicchiere flaconcino con vigorosa agitazione per 2 h.
- Estrarre la soluzione acquosa con 30 mL di etere etilico per rimuovere l'acido oleico, ripetere tre volte.
- Aggiungere 10 mL di acqua negli strati etere combinato con agitazione delicata.
- Raccogliere l'acquoso fase insieme (20 mL) e aggiungere 20 mL di acetone con vortex per 5 s.
- Spin giù il prodotto a 35.000 × g per 10 min e poi scartare il surnatante. Sciogliere il precipitato in 2 mL di acqua.
- Preparazione del polimero per volta UCNs (PAA-UCNs)
- combinare 200 mg di acido poliacrilico (PAA, Mw = 1.800) con 20 mL di acqua di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 20 minuti aggiungere il suddetto UCNs ligando-libero nella soluzione PAA con agitazione vigorosa.
- Regolare il pH a 7.4 di soluzione di NaOH (1 M) con sonicazione (60 kHz, 240 W) per 30 min. di mantenere la miscela per 24 h a temperatura ambiente mescolando.
- Raccogliere il precipitato mediante centrifugazione a 35.000 × g per 10 min. Risospendere il prodotto in 10 mL di acqua di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 5 min e centrifugare nuovamente a 35.000 × g per 10 min. Ripetere questa operazione tre volte.
- Ri-disperdere il prodotto in 8 mL di acqua di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 5 min. conservare la soluzione in frigorifero a ~ 4 ° C fino a quando necessario.
- Preparazione di funzionale DBCO-UCNs nanoparticella
- Spin-down il PAA@UCNs come preparato (1 mg) mediante centrifugazione a 35.000 × g per 10 min. Risospendere il precipitato in 1ml secco DMF di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 1 min e centrifugare nuovamente a 35.000 × g per 10 min. Ripetere questo passaggio due volte.
- Sciogliere il precipitato in 200 µ l a secco DMF in un flaconcino di vetro. Aggiungere HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) e DIPEA (16 µ l) nel flaconcino con agitazione magnetica per 24 h.
- Raccogliere il prodotto mediante centrifugazione a 35.000 × g per 10 min. eliminare il surnatante e risospendere il precipitato in 1 mL di DMSO e centrifugare nuovamente a 35.000 × g per 10 min. Ripetere questa operazione tre volte.
- Disperdere il prodotto in 0,2 mL di DMSO e conservare in frigorifero a ~ 4 ° C prima dell'uso.
3. Bioapplications di DBCO-UCNs nel regolamento dei canali di membrana in cellule viventi
- cultura il HEK293 cellule in Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) completati con 10% FBS, 100 unità/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e mantenere in un incubatore umidificato con 5% CO 2 al 37 cellule di ° C. Seed 1 × 10 5 in 1 mL DMEM/pozzetto in un piatto di 12-pozzetti e tenerlo in incubatrice per 24 h.
- Combinare il plasmide (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µ g) con reagente di transfezione P3000 (2 µ l) in Eagle ' s Media essenziale minimo (MEM) (100 µ l) in microcentrifuga tubo A e aggiungere il reagente di transfezione (1,5 µ l) nella MEM (100 µ l) nel tubo B.
- Incubare la miscela di soluzioni in tubi A e B per 10 min a temperatura ambiente.
- Combinare la soluzione nel tubo A e B con 400 µ l MEM. Lavare le cellule con 1 mL DMEM privo di siero due volte.
- Aggiungere la miscela di transfezione di 600 µ l in ogni pozzetto di una piastra 12-pozzetti e incubare le cellule all'incubatore 37 ° C per 4 h. Rimuovi il supporto e lavare due volte con 1 mL DMEM.
- Aggiungere 1 mL DMEM contenente 1 µ l Ac 4 ManNAz (50 mM in DMSO) nel pozzo e tenerlo in incubatrice per 2 giorni.
- Rimuovere il mezzo e lavare una volta con 1 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti e incubare a 37 ° C fino a quando le cellule hanno staccato (~ 2 min). Ri-cultura le cellule in un piatto confocale a 1 × 10 5 cellule/pozzetto in 1ml DMEM per una notte.
- Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL fresco DMEM con 2 µ l DBCO-UCNs (50 mg/mL) nel piatto per 2 ore a 37 ° C. Per formazione immagine confocal, lavare le cellule due volte con DMEM e aggiungere 1 µ l Rhod-N 3 (10 mM) per 30 min.
- Per l'analisi di calcio intracellulare, incubare le cellule con la miscela di 1 µ l Rhod-3 AM (10 mM), 10 µ l Probenecid (250 mM) e 10 µ l di tampone di caricamento (Pluronic tensioattivo polyols,0.1% w/v)) in 1 mL di terreno DMEM per 30 min al buio.
- Lavare le cellule con DMEM privo di siero e irradiare con luce NIR 808 nm al dosaggio di 0,8 W/cm 2 per 20 minuti (5 minuti di pausa dopo 5 min illuminazione).
- Registrare i risultati di imaging il microscopio confocale (fonte di laser: laser di 561 nm; rivelatore gamma: 610/75 nm; obiettivo: 100 x 1.4 NA olio, tempo di esposizione: 100 ms). Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C fino a quando le cellule hanno staccato (~ 2 min). Risospendere le cellule in 1 mL di PBS per citometria a flusso (FCM) (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
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Representative Results
Il processo di sintesi schematica di core-shell drogato con lantanidi UCNs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) di microscopia immagini di nanostrutture UCNs core e core-shell sono stati raccolti rispettivamente (Figura 1). Il ligando-libero UCNs sono preparati rimuovendo l'acido oleico idrofoba sulla superficie delle UCNs in soluzione acida e modificato con polimeri idrofili (PAA). Quindi il COOH-capped PAA-UCNs sono funzionalizzati con DBCO-NH2 da una reazione di condensazione di ammide. Le immagini TEM di ligando-libero UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs sono mostrate nella Figura 2. La dispersione della luce dinamica (DLS), risultati di potenziale zeta e spettri di luminescenza (UCL) upconversion di DBCO-UCNs sono raccolti rispettivamente (Figura 3). La spettroscopia di trasformata di fourier transform a infrarossi (FTIR) di DBCO-NH2, PAA-UCNs e DBCO-UCNs sono presentati nella Figura 4.
In esperimenti di cellulare, l'espressione successo di ChR2 sulla membrana cellulare è confermata dal marcatore ovvio proteina fluorescente verde (GFP) (Venus) usando la microscopia confocale (Figura 5A). Il DBCO-UCNs sono specificamente localizzati sulla superficie delle cellule HEK293 ChR2-esprimendo da clic reazione (Figura 5A). L'analisi di calcio intracellulare dopo stimolazione leggera NIR è confermato anche da confocale imaging e flusso cytometry (FCM) basato su un standard Ca2 + indicatore fluorescente, Rhod-3 AM (figura 5B, C).
Figura 1. Sintesi di core-shell lantanidi-drogato UCNs. (A) illustrazione schematica del processo di sintesi delle UCNs. (B, C) TEM del nucleo (Sorbetto_limone4: Yb/Tm/Nd (30/0,5/1 %)) e core-shell (Sorbetto_limone4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostrutture. Barra della scala: 50 nm. Inserto: Immagini HRTEM di nanostrutture UCNs core e core-shell. Barra della scala: 5 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sintesi di nanostrutture funzionali di UCNs. (A) illustrazione schematica del processo di sintesi del ligando-libero UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs, rispettivamente. (B, C, D) Immagini TEM di ligando-libero UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs. Barra della scala: 100 nm nel pannello B e 50 nm nel pannello C/D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Spettroscopia FTIR di DBCO-NH2, PAA-UCNs e DBCO-UCNs, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Caratterizzazione di DBCO-UCNs in soluzione tampone. (A) risultati DLS di DBCO-UCNs. (B) risultati di potenziale Zeta di PAA-UCNs e DBCO-UCNs (media ± DS). (C) spettri UCL di core e core-shell UCNs in esano (1 mg/mL), PAA-UCNs e DBCO-UCNs in acqua (1 mg/mL) separatamente (Ex: 808 nm). Inserto: luminescenza fotografia UCNs con irradiazione di 808 nanometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Applicazioni cellulari di DBCO-UCNs su NIR illuminazione light. (A) formazione immagine Confocal di esprimendo la ChR2 N3-etichetta cellule HEK293 incubate con DBCO-UCNs (in alto) e PAA-UCNs (in basso) per 2 ore a 100 µ g/mL. Verde: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), blu: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Barra della scala: 20 µm. (B) cellulare Ca2 + imaging con Rhod-3 AM prima e dopo l'irradiazione di luce NIR (0,8 W/cm2 per 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Barra della scala: 10 µm. (C) FCM Quantitative Analisi dell'intensità di fluorescenza normalizzata del cellulare Ca2 + con illuminazione a dosaggi differenti di luce (media ± SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo presenta un metodo per la sintesi di nanocristalli core-shell drogato con lantanidi upconversion (UCNs) e la loro modificazione superficiale con molecole funzionali per applicazioni cellulari. Questo nanomateriale romanzo possiede eccellenti proprietà ottiche, che possono emettere UV e luce visibile eccitazione luce NIR attraverso un processo Multi-photon upconversion. In questo protocollo, il core-shell UCNs nanostrutture (Sorbetto_limone4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) sono preparati secondo un metodo di alto-temperatura co-precipitazione in una miscela di acido oleico e 1-octadecene. Immagini TEM dimostrano la morfologia di questi core e core-shell nanocristalli sono sferici in forma con un diametro di 20 nm e 30 nm rispettivamente, implicando un spessore di shell di circa 5 nm (Figura 1). L'architettura core-shell rivela anche le immagini TEM ad alta risoluzione nella rientranza della Figura 1, che Mostra simili frange della grata con quello del nucleo UCNs nanostrutture. Inoltre, un tipico d-spaziatura intorno 0,52 nm concorda bene con la spaziatura del piano (100) del β-Sorbetto_limone4, che indica che tutti i core e core-shell UCNs nanostrutture sono altamente cristallizzate e mantenere la stessa struttura cristallina. Inoltre, gli spettri di luminescenza di upconversion dimostrano i nanocristalli core-shell emettono forte emissione blu con un'intensità molto superiore a 480 nm che le particelle del nucleo eccitazione con un laser a diodo per ottenere un'onda continua a 808 nm ( Figura 4). L'emissione maggiore di core-shell UCNs è attribuita alla soppressa superficie tempra effetto di Yb3 +, Nd3 +e Tm3 + ioni incorporati nello strato interno del core-shell nanocristalli21. Questi risultati confermano fortemente la corretta preparazione di lantanidi-drogati di nanomateriale UCNs core-shell in questa proposta.
Ci sono diversi passaggi critici nella sintesi ad alta temperatura co-precipitazione di questi nanocristalli. In primo luogo, il volume della soluzione di riserva agli ioni lantanidi nel processo di sintesi del core e core-shell UCNs aggiunto deve essere strettamente controllato (passo 1.1.2.2). Elevato livello di ioni il doping si tradurrà in un croce-rilassamento correlate a concentrazione o tempra effetto dovuto all'interazione ione-ione a nanocristalli21. In secondo luogo, la temperatura deve essere mantenuta a meno di 50 ° C per garantire completa nucleazione dopo l'aggiunta di NaOH e NH4F nel pallone (passaggio 1.1.2.9 e passaggio 1.2.9), che è fondamentale per garantire una morfologia uniforme promuovendo la crescita dei cristalli basata su Ostwald maturazione di effetti22. In terzo luogo, le dimensioni e le proprietà ottiche delle nanoparticelle core-shell può essere controllata principalmente regolando la quantità di ioni lantanidi nei precursori del guscio (Y3 + e Nd3 +) e particelle come preparato core (punto 1.2.1). È anche importante che la morfologia dei nanocristalli core-shell si basa sulla crescita anisotropa shell di diversi tipi di particelle, che è utile per modulare le diverse emissioni ottiche di UCNs su NIR illuminazione luce23.
Inoltre, è anche una notevole sfida per convertire efficacemente idrofobo UCNs idrofila UCNs nanoparticelle per ulteriori applicazioni biologiche. Anche se alcuni metodi sono state segnalate per migliorare la biocompatibilità delle UCNs in una soluzione tampone, compreso cambio di ligando, rivestimento di silice, oleato e tappatura ossidazione ligando, ecc., essi soffrono di aggregazione inatteso, che richiede tempo, e complesse procedure24,25,26. Nel presente documento, sviluppiamo un approccio semplice per ottenere dispersibile in acqua privo di ligando UCNs nanostrutture rimuovendo l'acido oleico sulla superficie delle UCNs oleato-ricoperto in una soluzione di acqua acida (pH = 4). Il valore di pH regolato da HCl è fondamentale per controllare il rilascio di ligando oleato ed interessare la luminescenza di UCNs. Ancora più importante, un polimero biocompatibile (acido poliacrilico, PAA) con un gran numero di carbossilico gruppi possono collegare con gli ioni lantanidi sulla superficie della UCNs dall'interazione di coordinamento, che fornirà ulteriori gruppi funzionali per ulteriori prodotti chimici modifica. Di conseguenza, abbiamo funzionalizzare le moiety2 DBCO-NH sulla superficie delle UCNs per ulteriori specifiche N3-etichetta localizzazione della membrana cellulare. Le immagini TEM di ligando-libero UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs nella Figura 2 dimostrano la grande dispersità e la solubilità di queste nanostrutture in soluzione tampone dopo la modificazione della superficie. Inoltre, spettroscopia di trasformata di fourier transform a infrarossi (FTIR) è stata effettuata per caratterizzare la modificazione superficiale dei gruppi DBCO su UCNs nanoplatform. Come mostrato nella Figura 3, la band forte intorno 3.430 cm-1 è dovuto la vibrazione di stretching di H-O di gruppi carbossilici, e le due bande centrate 1550 cm-1 e cm 1458-1 sono associate con l'asimmetrica e modi di vibrazione stretching simmetrici degli anioni carbossilato, che indica il rivestimento di successo di gruppo contenenti polimeri COOH (PAA) sulla superficie UCNP. Dopo la reazione con moiety2 DBCO-NH, un'appariscente fascia a 1.635 cm-1 è presente basato sul C = C stretching vibrazione sull'anello aromatico dei gruppi DBCO, che è coerente con lo spettro FTIR di moiety2 DBCO-NH allo stesso numero d'onda. Inoltre, il risultato della dispersione della luce dinamica (DLS) indica il diametro maggiorato idrodinamico del DBCO-UCNs in soluzione acquosa (96.4±10.4 nm) (Figura 4A). I risultati di potenziale zeta anche indicano la superficie negativa del PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) e DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) rispettivamente (Figura 4B), dimostrando la grande solubilità e la stabilità di queste nanostrutture in soluzione tampone. Inoltre, gli spettri UCL di PAA-UCNs e DBCO-UCNs dimostrano che possono emettere simili upconverted emissione a 480 nm su 808 irradiazione di luce nm (Figura 4), che può essere utilizzato per ulteriori NIR luce-mediata fotoattivazione nel biologico sistemi.
Inoltre, come un proof-of-concept, al fine di dimostrare il bioapplication di UCNs funzionalizzati in cellule viventi, una proteina canale luce-gated (ChR2) è stata progettata sulla superficie delle cellule per regolare le funzioni cellulari mediando l'afflusso degli ioni di catione (ad es., Ca2 +) nel citoplasma27,28,29. L'espressione di successo di ChR2 sulla membrana della linea cellulare HEK293 è confermata dalla presenza del marcatore proteina fluorescente verde (GFP) (Venus) usando la microscopia confocale (Figura 5A). Inoltre, la localizzazione di UCNs su N3-taggata membrana cellulare ovviamente è visualizzata sulla superficie cellulare (blu) dopo 2 h di incubazione, che può essere attribuita al fatto che i gruppi DBCO residui sulla superficie delle nanostrutture UCNs sono macchiati con un colorante fluorescente contenenti azide (5-carboxytetramethylrhodamine-azide, Rhod-N3) attraverso il bioorthogonal esente da rame clicca reazione. Inoltre, luce NIR (808 nm) viene utilizzata per irradiare il nanotransducer UCNs localizzata sulla superficie delle cellule, che può attivarela luce-gated ChR2 canale proteine e facilitare l'afflusso di Ca2 + ioni attraverso la membrana. Come mostrato in figura 5B, si osserva un aumento significativo di fluorescenza rossa nel citosol di standard Ca2 + indicatore fluorescente, Rhod-3 AM, mentre nessun incremento di fluorescenza apparente è registrato in assenza di illuminazione. L'analisi di citometria (FCM) quantitativa di flusso in Figura 5 dimostra inoltre che tale aumento di fluorescenza NIR-luce-sensible a reagire è luce-dose-dipendente, chiaramente suggerendo che il DBCO-UCNs biocompatibile può regolare efficacemente il proteine canale sulla membrana cellulare all'irradiazione di NIR-luce.
In sintesi, sulla base dei suddetti risultati, possiamo anticipare che il presente protocollo non solo fornisce dettagliate procedure sperimentali per la sintesi ad alta temperatura co-precipitazione di nanostrutture UCNs core-shell, ma sviluppa anche un semplice tecnica per la modifica superficiale biocompatibile di UCNs per ulteriore NIR luce-mediata fotoattivazione in applicazioni biologiche. Ancora più importante, basato sulla spiegazione razionale dietro questo metodo, le proprietà ottiche delle UCNs ulteriormente regolabile dal doping diversi tipi di ioni lantanidi (ad es., erbio (III), olmio (III), ecc.) nei cristalli di emettere UV, verde, rosso, e NIR luce su 808 nm irradiazione di luce30. Inoltre, la superficie UCNs può essere modificata anche con vari gruppi funzionali (ad es., peptide, proteine, lipidi, targeting ligando, ecc.) per ulteriori applicazioni biomediche31,32. Questi vantaggi rendono biocompatibile UCNs nanomateriale un candidato adatto per lo studio di processi fisiologici in vitro e in vivoe possono pertanto fungere da nanomedicina personalizzata per teranostica clinici in futuro.
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Disclosures
Non abbiamo nulla di divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) e (RG 35/15) assegnato a Nanyang Technological University, Singapore e National Natural Science Foundation di Cina (NSFC) (No. 51628201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
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