높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

요약

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

초록

이 원고에서 우리는 transposon 시퀀싱 (Tn-Seq) 기술을 식별 하 고 계량 Leptospira interrogans 돌연변이 피트 니스 시리아 황금 햄스터의 감염 시 변경 설명 합니다. 테네시-Seq 임의의 transposon mutagenesis 높은 처리량 시퀀싱 기술의 힘 결합합니다. 동물 뒤에 수확 혈액과 조직의 몇 일 후 식별 하 고 각 기관 (출력 풀)에 있는 돌연변이의 수를 계량 transposon 돌연변이 (입력된 풀)의 수영장 도전입니다. 출력 풀 각 돌연변이의 vivo에서 적합성을 평가 하는 입력에 비교 됩니다. 이 방법은 돌연변이 동물의 제한 된 수에서의 대형 수영장의 수 있습니다. 사소한 수정이 프로토콜 렙의 어떤 동물 모델, 저수지 호스트 모델 쥐, 햄스터, 생체 외에서 연구 등 급성 감염 모델 수행할 수 있습니다. 테네시-Seq vivo에서 그리고 생체 외에서 피트 니스 결함 돌연변이 대 한 화면에 강력한 도구를 제공합니다.

서론

Leptospira 종 등 일부 박테리아에 대 한 독성 유전자의 유전 도구 사용할 수 있는 제한 된 수 때문에 어렵습니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 각 돌연변이에 삽입 사이트의 식별 및 독성 테스트 동물 모델에서 개별 transposon 돌연변이의 임의의 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 컬렉션의 창조 이다. 이 방법은 소모, 비싼, 고 동물의 많은 수를 요구 한다.

무작위 mutagenesis Leptospira interrogans병원 체에 대 한 처음으로 개발, 유전자 독성에 관련 된 동물 모델¹에서 개별 돌연변이 테스트 하 여 확인 되었다. 돌연변이 신호에 그들의 잠재적인 역할 또는 운동 성 또는 그들의 예상된 외부 막 또는 표면 위치 같은 기준에 따라 선정 됐다. Leptospiral의 대부분으로 유전자 인코딩 알 수 없는 함수²의 가상 단백질, 선택 돌연변이 이러한 조건 제한에 따라 소설 leptospiral 독성 유전자를 발견 하는 능력.

더 최근에, L. interrogans transposon....

프로토콜

주의: Leptospira 종의 병원 성 긴장 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 견제 절차에 따라 처리 되어야 합니다. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다. 캐비닛 클래스 II biosafety 병원 성 Leptospira 종의 모든 조작에 대 한 사용 해야 합니다.

1. 창조는 Transposon의 돌연변이 도서관¹⁵

1. 활용 하 여 Leptospira spp. 에 transposon의 전송 (그림 1)
   1. Ellinghausen-맥-존슨-해리스 중간 (EMJH)^18,19의 10 mL로 10⁷ 셀에 해당 하는 병원 성 Leptospira 종의 지 수 단계 문화의 예방 떨고 밀도 10⁸ 셀/mL x 2-8에 도달할 때까지 150 rpm으로 30 ° C에서 품 어.
      참고: 병원 성 leptospires의 2....

결과

그림 1에서 보듯이 transposon 돌연변이 L. interrogans 에 활용 하 여 도서관의 창조 여과 장치를 요구 한다. 우리는 각 짝짓기에서 100-200 transconjugants를 복구.

Transposon 삽입 사이트는 transposon의 끝을 대상으로 어느 정도 임의적인 PCR에 의해 생성 된 PCR 제품을 시퀀싱으로 각 돌연변이에 식별 되 고 인접 한 호스트 시퀀스¹⁵ (그림 2A). 어느 정도 임의적인 PCR의 결과의 예는 그림 2B에 표시 됩니다. 대부분의 경우에는 지배적인 amplicon 2 차 PCR 태그와 TnkN1.......

토론

Intraperitoneally 42 L. interrogans 돌연변이 함께 도전 하는 햄스터에 대 한 우리의 파일럿 실험 결과¹⁷제공 됩니다, 하지만 우리는 돌연변이의 더 큰 수영장 Tn이 의해 상영 될 수 있습니다 기대 Transconjugants의 주파수는 낮은 때문에 (100-200 transconjugants/짝짓기), 몇몇 matings 큰 Tn-Seq 실험에 대 한 돌연변이의 충분 한 번호를 생성할 필요가 있습니다. 액체 문화에서 돌연변이의 많은 수를 유지 하는 해결 되어야 물류 도전을 선물 한다. 문화 깊은 96 잘 접시에 알을 품을 수 있다. 문화 밀도 420로 설정 하는 분 광 광도 계에 신호는 광학 밀도 의해 모니터링할 수 nm. 사용 하는 동물의 수의 결정 부분에 입력된 풀의 크기에 따라 고 전력 분석에 의해 결정 되어야 합니다. 대규모 실험에 대 한 전력 분석 협의 biostatistician에서 수행 되어야 하는 것이 좋습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스트렙토마이세스 kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K4000
2,6-디아미노피멜릭산	Sigma-Aldrich	D1377
스펙티노마이신 디하이드로클로라이드 펜타하이드레이트	Sigma-Aldrich	S4014
Axio Lab A1 현미경(암시야 포함)	Zeiss	490950-001-000
DNeasy 혈액 및 조직 키트	Qiagen	69504/69506
MinElute PCR 정제	Qiagen	28004/28006
QIAquick PCR 정제 키트	Qiagen	28104/28106
모델 505 음파 분석기	Fisher Scientific	FB-505
2.5" 컵 혼	Fisher Scientific	FB-4625
비드 파열기 24	Omni International	19-010	Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase	Promega	M828C
Master mix Phusion	Thermo Scientific	F531	게놈 라이브러리 준비, step 3.4.
DreamTaq Master Mix	Thermo Scientific	K9011/K9012	트랜스포존 삽입 부위 식별, 1.2단계.
dCTP	Thermo Scientific	R0151
ddCTP	Affymetrix/ USBProducts	77112
T100 Thermal cycler	BioRad	1861096
Qubit 2.0 형광측정기	Invitrogen	Q32866	step 3.6.
Qubit dsDNA HS 어세이 키트	Invitrogen	Q32851/Q32854	3.6단계.
Qubit 어세이 튜브	생명 기술	Q32856	단계 3.6.
PBS pH 7.2 (1X)	Gibco	20012-027 20012-050
일회용 메스 No10	Feather	2975#10
플라스틱 K2 EDTA 2ml 튜브	BD 진공 청소기	367841
사기 U-100 26G x ½ ” 바늘	BD 진공 청소기	329652	IP 챌린지, 2.2.1 단계.
3mL Luer-Lok 팁 주사기	BD 진공	309657	심장 천자, 2.4.2단계.
25G X 5/8" 바늘	BD 진공 청소기	305901	심장 천자, 단계 2.4.2.
스토퍼가 있는 25mm 프릿 유리 베이스	EMD Millipore	XX1002502	여과 장치 시스템, 단계 1.1.7.
25mm 알루미늄 스프링 클램프	EMD Millipore XX1002503		여과 장치 시스템, 단계 1.1.7.
15ml borosilcate 유리 깔때기	EMD Millipore	XX1002514	여과 장치 시스템, 1.1.7 단계.
125ml 측암 삼각 플라스크	EMD Millipore XX1002505		여과 장치 시스템, 1.1.7단계.
아세테이트-셀룰로오스 필터 VVPP(기공 크기 0.1mm, 직경 25mm)	EMD 밀리포어	VVLP02500

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