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방법 논문

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56442

⸱

2017년 12월 18일

 ,  ,  , 
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

이 논문에서

요약

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

초록

이 원고에서 우리는 transposon 시퀀싱 (Tn-Seq) 기술을 식별 하 고 계량 Leptospira interrogans 돌연변이 피트 니스 시리아 황금 햄스터의 감염 시 변경 설명 합니다. 테네시-Seq 임의의 transposon mutagenesis 높은 처리량 시퀀싱 기술의 힘 결합합니다. 동물 뒤에 수확 혈액과 조직의 몇 일 후 식별 하 고 각 기관 (출력 풀)에 있는 돌연변이의 수를 계량 transposon 돌연변이 (입력된 풀)의 수영장 도전입니다. 출력 풀 각 돌연변이의 vivo에서 적합성을 평가 하는 입력에 비교 됩니다. 이 방법은 돌연변이 동물의 제한 된 수에서의 대형 수영장의 수 있습니다. 사소한 수정이 프로토콜 렙의 어떤 동물 모델, 저수지 호스트 모델 쥐, 햄스터, 생체 외에서 연구 등 급성 감염 모델 수행할 수 있습니다. 테네시-Seq vivo에서 그리고 생체 외에서 피트 니스 결함 돌연변이 대 한 화면에 강력한 도구를 제공합니다.

서론

Leptospira 종 등 일부 박테리아에 대 한 독성 유전자의 유전 도구 사용할 수 있는 제한 된 수 때문에 어렵습니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 각 돌연변이에 삽입 사이트의 식별 및 독성 테스트 동물 모델에서 개별 transposon 돌연변이의 임의의 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 컬렉션의 창조 이다. 이 방법은 소모, 비싼, 고 동물의 많은 수를 요구 한다.

무작위 mutagenesis Leptospira interrogans병원 체에 대 한 처음으로 개발, 유전자 독성에 관련 된 동물 모델1에서 개별 돌연변이 테스트 하 여 확인 되었다. 돌연변이 신호에 그들의 잠재적인 역할 또는 운동 성 또는 그들의 예상된 외부 막 또는 표면 위치 같은 기준에 따라 선정 됐다. Leptospiral의 대부분으로 유전자 인코딩 알 수 없는 함수2의 가상 단백질, 선택 돌연변이 이러한 조건 제한에 따라 소설 leptospiral 독성 유전자를 발견 하는 능력.

더 최근에, L. interrogans transposon 돌연변이의 풀 infectivity 햄스터와 마우스 모델3에 대 한 상영 했다. 각 동물 수영장 최대 10 돌연변이에 전했다. 돌연변이의 infectivity 문화의 혈액과 신장에서 얻은 PCR에 의해 검색 된 경우 긍정적으로 득점 했다. 수영장에서 각 돌연변이 대 한 개별 PCR 반응 필요 하기 때문에 PCR 테스트 하는 것은 힘 드는. 문화에 각 돌연변이의 주파수는 계량 하지, 때문에 접근 했다 높은 감쇠 돌연변이의 id 쪽으로 치우친 다.

(테네시-Seq) 기법, 독성 유전자에 대 한 화면을 보다 효율적으로 하는 전략으로 시퀀싱 하는 transposon을 설명 합니다. 대규모 병렬 시퀀싱4,,56다음 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 도서관의 창조 테네시-seq에 의하여 이루어져 있었다. 간단히, transposon 돌연변이 풀링된, 동물에 주사 고 나중 다른 장기 (출력 풀)에서 복구. 출력 풀에서 DNA 추출 및 금지 효소로 소화 또는 쥡니다에 의해 전단. 2 라운드 PCR transposon 삽입 사이트의 접속을 대상으로 수행 됩니다. 이 단계는 시퀀싱에 필요한 어댑터의 추가 수 있습니다. 결과 PCR 제품의 그들의 관계 되는 풍부, 돌연변이의 수영장의 초기 구성에 비해 함께 수영장의 각 돌연변이 transposon 삽입 사이트를 식별 하려면 높은 처리량 연속 분석 된다.

이 방법의 주요 장점은 많은 동물의 작은 수로 돌연변이 동시에 화면을 기능입니다. 테네시-Seq 새로운 Leptospira발견의 기회를 증가 하는 transposon 삽입 사이트의 사전 지식이 필요 하지 않습니다-특정 유전자 독성에 더 적은 시간 및 더 큰 효율성과 관련된. 설치류 모델에 치명적인 감염 감염 조직에 leptospiral 부담에서 상대적으로 높기 때문에 (일반적으로 104 조직의 108 박테리아/g)7,,89 또한 저수지 호스트 에서 10,11, 조직 문화, 생체 외에서 성장으로 인해 편견을 줄일 필요 없이 직접 분석 될 수 있다.

테네시-Seq 날짜를 설명 하는 대부분 세균성 병원 체 연구, insertional mutagenesis의 높은 주파수 통칭 데 모든 유전자4 내 여러 긴밀 한-간격 transposon 삽입 돌연변이 포함 하는 큰 풀과 감염을 허용 ,12,,1314. 또한 테네시-Seq는 mutagenesis 주파수는 훨씬 낮은6박테리아에 대 한 개발 되었습니다. Leptospira, 함께 transposon 돌연변이의 라이브러리 활용 설명 된 대로 Slamti 외15여 의해 transposon mobilizable 플라스 미드에 도입 하 여 생성할 수 있습니다. 그러나, L. interrogans 의 transposon mutagenesis의 주파수가 낮습니다. Transconjugant 주파수만 8.5 받는 당 10-8 x L. interrogans16 라이 긴장으로 세포와 될 것입니다 알려졌다 Himar1 transposon conjugative 플라스 미드에 도입 되었다, L. interrogans의 대부분 다른 종자와 마찬가지로 가난한 사람 여기에 설명 된 프로토콜 보렐 리아 burgdorferi는 transposon insertional mutagenesis의 주파수는 또한 낮은6에 대 한 개발에 기반 하는 부분 이다.

프로토콜17우리의 파일럿 실험에 대 한 낮은 함께 피로 transposon 삽입 돌연변이 고립 시키는에 다른 그룹의 성공 때문에 L. interrogans serovar Manilae 긴장 L495와 transposon mutagenesis 실시 LD50 (치명적인 복용량) 독성1. 우리 테네시-Seq에 의해 42 돌연변이 검사 하 고 여러 돌연변이 후보 후보 adenylate 있고 유전자에서 2 삽입을 포함 한 독성에 결함을 발견. 햄스터에 두 돌연변이의 개별 테스트 그들이 결핍 독성17에 확인.

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프로토콜

주의: Leptospira 종의 병원 성 긴장 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 견제 절차에 따라 처리 되어야 합니다. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다. 캐비닛 클래스 II biosafety 병원 성 Leptospira 종의 모든 조작에 대 한 사용 해야 합니다.

1. 창조는 Transposon의 돌연변이 도서관15

  1. 활용 하 여 Leptospira spp. 에 transposon의 전송 (그림 1)
    1. Ellinghausen-맥-존슨-해리스 중간 (EMJH)18,19의 10 mL로 107 셀에 해당 하는 병원 성 Leptospira 종의 지 수 단계 문화의 예방 떨고 밀도 108 셀/mL x 2-8에 도달할 때까지 150 rpm으로 30 ° C에서 품 어.
      참고: 병원 성 leptospires의 2 배 시간 변형에 따라 12 ~ 24 h입니다.
    2. 5 mL Luria 국물 (파운드)의 하 0.3 m m 2, 6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µ g/mL의 보충으로 mobilizable transposon 플라스 미드 (pCjTKS2)16 을 들고 기증자 대장균 긴장 β216320 의 50 µ L를 접종 대 (Km), 그리고 spectinomycin (Spc)와 255 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 하룻밤의 50 µ g/mL.
    3. DAP (EMJH + DAP)의 0.3 m m로 보완 하는 EMJH의 3 mL에 대장균 세포의 60 µ L을 접종. OD600nm≈ 0.3까지 3-4 h 255 rpm 동요에서 37 ° C에서 품 어.
    4. 여과 장치 (그림 1)를, 125 mL 사이드-팔 삼각 플라스 크에 기지를 배치, 초 산 셀 룰 로스 필터 위치 (기 공 크기 0.1 m m, 직경 25 mm) 베이스, 클램프 베이스에 퍼 널에. 진공 시스템에 여과 장치를 연결 합니다.
    5. Leptospira spp의 5 mL를 추가 합니다. 문화와 0.5 mL의 깔때기로 대장균 문화. 진공 필터를 통해 액체입니다.
    6. EMJH + DAPplate에 향하도록 하는 박테리아의 표면으로 필터를 전송 합니다. 품 어 30 ° C에서 하룻밤 향하도록 필터.
    7. EMJH 및 10에 대 한 소용돌이의 1 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 필터를 배치 미디어에 박테리아를 릴리스 s. 5 EMJH platescontaining 50 µ g/mL의 10-15 1 m m 메 마른 유리 구슬 또는 멸 균 일회용 분산기를 사용 하 여 Km에 서 스 펜 션의 200 µ L를 확산. Parafilm으로 접시를 포장 하 고 식민지가 표시 될 때까지 3 ~ 4 주 동안 그들을 거꾸로 30 ° C에서 품 어.
    8. 7 ~ 10 일 문화 ≈ 10의 밀도 도달할 때까지 교 반 150 rpm에서 30 ° C에서 50 µ g/mL Km (EMJH + 킬로미터)를 포함 하는 EMJH의 3 mL에 개별적으로 식민지를 전송8/mL.
      참고:-80 ° C에 또는 액체 질소 (4% 글리세롤)과 문화를 저장할 수 있습니다.
  2. 중첩된 PCR에 의해 transposon 삽입 사이트의 식별 (그림 2)
    1. 15 분 동안 95 ° C에 외피에 의해 PCR 튜브에 각 transposon 돌연변이의 50 µ L를 lyse.
      참고: DNA 수 수 정화 대신, DNA 추출 키트를 사용 하 여.
    2. 표 1에 따라 Deg1와 Tnk1 뇌관 (표 3) PCR 혼합을 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 믹스의 23.7 µ L를 전송 하 고 lysed 세포의 1.3 µ L를 추가 합니다. 프로그램을 실행: 95 ° C 5 분; 40 주기: 95 ° C 15 초, 1 분, 2 분; 72 ° C에 40 ° C 10 분 동안 72 ° C입니다.
    3. 표 2에 따라 태그와 TnkN1 뇌관 (표 3) PCR 혼합을 확인 합니다. 각 PCR 튜브에 믹스의 24.2 µ L를 전송 하 고 PCR #1 반응의 0.8 µ L를 추가 합니다. 프로그램을 실행: 95 ° C 5 분; 35 주기: 95 ° C 15에 대 한 s, 55 ° C 30 초, 2 분; 72 ° C 10 분 동안 72 ° C입니다.
    4. 10-15 V/cm (그림 2B)에 1 X 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼와 함께 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 3 µ L를 실행 합니다.
    5. PCR 정화 키트를 사용 하 여 긍정적인 샘플의 PCR 제품을 정화. 복구 하는 DNA의 농도 극대화 하는 키트에서 허용 하는 최저 볼륨으로 DNA을 elute.
    6. 생어 시퀀싱 TnkN1 뇌관 (표 3)을 사용 하 여에 대 한 정화 PCR 제품을 보냅니다.
    7. BLASTN 분석 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 부모의 긴장의 게놈 순서와 결과 시퀀스를 비교 하거나21SpiroScope 데이터베이스 (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) 사용 하 여 삽입 사이트를 식별 합니다.
    8. 측면에 서 호스트 시퀀스를 단련 하는 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 transposon의 삽입 사이트를 확인 합니다.
      참고:는 transposon 증가 야생-타입 시퀀스의 크기 ≈ 2 kb.

2. 동물 실험 (그림 3)

  1. Leptospira 돌연변이의 문화
    1. 107-108 leptospires/mL의 조밀도에 150 rpm 동요에서 30 ° C에서 EMJH + 킬로미터의 10 mL에 각각 개별적으로 선택한 transposon 돌연변이 성장.
    2. Petroff 하우서 카운터 또는 밀러23에 의해 설명된대로 다크 필드 현미경으로는 leptospires를 계산 합니다.
    3. 각 문화 EMJH에 동일한 밀도, 예를 들어 106 셀/mL를 희석.
    4. 입력된 풀 조립, 동일한 볼륨에 희석된 문화 혼합 함께.
      참고: loa2217,24 등 알려진된 피트 니스 결함 돌연변이 돌연변이 ligB17,25, 같은 불변된 피트 니스와 함께 추가 하 여 입력된 풀 컨트롤 포함 각각. 돌연변이의 풀 4% 글리세롤-80 ° C에 또는 액체 질소에서로 저장할 수 있습니다.
  2. 도전
    참고: 여기서 설명 하는 방법 재향 군인 담당 큰 로스 앤젤레스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 #09018-14)에 의해 승인 되었다.
    1. 인슐린 주사기 U-100 26G x ½"바늘 각 동물에 입력된 풀의 intraperitoneally 1 mL를 주사.
      참고: 파일럿 실험 8 동물 입력된 풀, 즉, 106 박테리아 총17의 1 mL와 함께 도전 되었다. 감염 4 일전 안락사에 대 한 진행을 허용 했다.
    2. 입력된 풀의 10 mL를 수집 하 고 3,220 x g. 20 분은 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게 제거 하는 상쾌한 대 한 스핀. -80˚C에서 셀 펠 릿 사용 (단계 3.1.3)까지 저장 합니다.
    3. 그들은 미리 정해진된 끝점에서 종료 됩니다 때까지 동물을 매일 모니터링 합니다. 햄스터를 매일 체중을 끝점 기준: 식욕, 걸음 걸이 또는 호흡 곤란, 의식, 뻗 치고 모피, 또는 달성 하는 최대 중량의 > 10%의 손실.
  3. 생체 외에서 실험
    1. 도전의 날 3 플라스 크의 입력된 풀의 5 mL와 EMJH + 킬로미터의 25 mL 접종. 150 rpm 동요에서 30 ° C에서 문화를 성장.
    2. 2.1.2 섹션의 방법 중 하나를 사용 하 여 매일은 leptospires를 계산 합니다. 밀도 ≈ 1 x 108/mL에 도달 하면, 각 정지 3,220 x g에서 20 분 동안 아래로 회전 합니다.
    3. 사용까지-80 ° C에서 셀 펠 릿을 저장 합니다.
  4. 수확 및 저장 조직
    1. 뒤에 양자 thoracotomy26isoflurane 흡입에 의해 동물을 안락사.
    2. 즉시 3 mL 주사기와 바늘 25G x 5/8"심장 펑크에 의해 혈액의 1 ~ 2 mL를 수집 합니다. EDTA를 포함 하는 튜브로 혈액을 전송 합니다. 반전에 의해 혼합 5 ~ 6 배.
    3. Cryotubes에 간 복 부 중간 엽의 ½를 한 신장과 ⅓를 수집 합니다.
    4. 조직-80 ° C에서 사용까지 저장 합니다.

3. 높은 처리량 시퀀싱 (그림 4)에 대 한 게놈 라이브러리의 건설

  1. DNA 추출
    1. 혈액 으로부터 DNA 추출입니다.
      1. Microcentrifuge 튜브에 EDTA 튜브에서 혈액의 100 µ L를 전송.
      2. DNA 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 제조업체의 지침을 따릅니다.
    2. 조직에서 DNA 추출입니다.
      1. Scalpels와가 위를 사용 하, 작은 조각 (1 m m x 1 m m),으로 각 장기의 50 ~ 80 밀리 그램 사이 주사위 고 나사 모자 살 균 건조 관으로 그들을 전송. 정밀 밸런스와 티슈의 무게를 측정 합니다.
      2. 튜브에 살 균 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.
      3. 초당 5 움직임에서 1 분 동안에 방해를 사용 하 여 샘플을 균질.
      4. 다음 수식을 사용 하 여 조직의 25 밀리 그램에 해당 하는 볼륨을 계산:
        figure-protocol-1
      5. DNA 추출 키트로 계산된 볼륨을 전송. 제조업체의 지침에 따라 DNA 정화와 함께 진행 합니다.
    3. 입력된 풀 및 생체 외에서 문화에서 DNA 추출.
      1. 세균성 알 약 5-10 분 동안 실 온에서 녹여
      2. DNA 추출 키트와 함께 제공 되는 지침에 따라 진행 합니다.
    4. 사용까지-80 ° C에서의 저장소 DNA
  2. DNA를 기울이기 (그림 5)
    1. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 추출 된 DNA의 50 µ L를 전송 합니다.
    2. 차가운 물 (4 ° C)로 가득 sonicator 컵 경적의 랙 튜브를 놓습니다.
    3. 10 80% 강도로 3 분 sonicator 실행 펄스 및 5의 펄스에서 s.
      주의: 귀 머프 또는 귀 플러그 청력 보호를 착용 하십시오.
    4. 전단의 2.5 µ L을 실행 DNA의 대부분을 확인 하는 2 %agarose 젤에 DNA는 < 600 bp 크기.
  3. C-꼬리의 추가
    1. 작은 볼륨 분 광 광도 계와 DNA 농도 측정 합니다.
    2. 500 해당 볼륨 계산 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 DNA의 ng:
      figure-protocol-2
    3. 미행 반응 (표 4)을 준비 합니다. 37 ° C에서 1 시간을 품 어 20 분 동안 75 ° C에 비활성화.
      참고: 14.5 µ L 보다 큰 볼륨을 조정 해야 하는 샘플에 대 한 40 µ L에 대 한 반응의 최종 볼륨을 증가 하 고 그에 따라 나머지 구성 요소를 확장.
    4. PCR 정화 키트와 함께 샘플을 청소. 차입 버퍼의 12 µ L로 DNA elute
  4. 중첩된 한 PCR
    1. PCR #1
      1. 테이블 3 및 5PCR 믹스를 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 라이브러리 믹스의 22 µ L를 전송 하 고 순화 된 DNA의 3 µ L를 추가 합니다. 마찬가지로 컨트롤 믹스와 함께 진행 합니다.
        참고: 뇌관 TnkN317 는 transposon 및 뇌관 olj3766 는 C-꼬리. 제어 믹스 TnkN3 뇌관, 특히 표적으로 transposon 부족 이다.
      2. 다음 프로그램 실행: 95 ° C 2 분; 24 주기: 95 ° C 30에 대 한 s, 60 ° C 30 초, 2 분; 72 ° C 2 분 동안 72 ° C입니다.
    2. PCR # 2입니다.
      1. 테이블 3 및 6에 따라 두 번째 PCR 믹스를 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 라이브러리 믹스의 49 µ L를 전송 하 고 PCR #1 라이브러리 반응의 1 µ L를 추가 합니다. 각 PCR 관을 제어 믹스의 24.5 µ L를 전송 하 고 PCR #1 컨트롤 반응의 0.5 µ L를 추가 합니다.
        참고: 뇌관 pMargent2는 transposon, 그리고 IP 뇌관6 포함 6-기지-쌍 바코드 및 특정 시퀀스 다음-세대 시퀀싱 플랫폼에 의해 인식.
      2. 다음 프로그램 실행: 95 ° C 2 분; 18 주기: 95 ° C 30에 대 한 s, 60 ° C 30 초, 2 분; 72 ° C 2 분 동안 72 ° C입니다.
    3. 2 %agarose 젤에서 3 µ L를 실행 합니다. 라이브러리는 대부분 200 ~ 600 사이 신호의 얼룩 표시 해야 혈압 (그림 6)과 제어 반응에 대 한 아무 증폭.
  5. PCR 제품의 정화입니다.
    참고: 제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 게놈 라이브러리를 청소 합니다. 차입 버퍼의 30 µ L로 DNA elute
  6. DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여 측정 합니다. 평균 2 ~ 3 읽습니다.
  7. 각 도서관에 15 또는 20 ng 아래 수식을 사용 하 여 해당 볼륨을 계산:
    figure-protocol-3
  8. 모든 라이브러리 이전 계산에 따르면 함께 혼합. 다음 웹 사이트의 방정식으로 DNA의 어 금 니 농도를 결정 합니다.
    http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
    주의: DNA 농도 및 볼륨 요구 사항을 시퀀싱 플랫폼에 따라 달라 집니다.

4. 높은 처리량 시퀀싱 및 데이터 분석

  1. 시퀀싱
    1. 사용자 지정 연속 뇌관 pMargent3 표준 상업 시퀀싱 뇌관을 사용 하 여 64 bp 일자형 읽기로 라이브러리를 시퀀스. 시퀀싱 플랫폼 모든 시퀀싱 읽기와 FastQ 파일을 제공 합니다.
  2. 분석은 소프트웨어와 함께
    1. 게놈 시퀀스 파일 다운로드
      1. SpiroScope 데이터베이스 홈페이지에서 (단계 1.2.7 링크 참조), 실험을 위해 사용 하는 유기 체를 선택 하 고 "게놈 브라우저에 로드"를 클릭 합니다.
      2. (홈페이지 상단) 도구 모음에서 선택 "검색/내보내기 > 데이터 다운로드", "시퀀스 (fasta)" 줄에서 "게놈" 시퀀스를 다운로드를 클릭 합니다.
      3. 메모장 (PC) 나 텍스트 편집기 (Mac) 파일을 열고 염색체 (예: "기독교")의 이름을 변경 합니다. Fasta 포맷을 유지 한다.
      4. 염색체 II의 순서를 다운로드 하려면 동일한 단계를 따릅니다. 복사 및 붙여넣기 하 여 단일.txt 파일로 두 염색체 시퀀스를 결합 합니다.
        참고: 염색체 시퀀스 수 NCBI 웹사이트 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 다운로드할 수 있으며 단일.txt 파일에 결합.
    2. 서버에 파일 업로드
      참고:은 오픈 소스, 데이터 집중 생물 정보학 워크플로27,,2829,30 를 관리 하기 위한 웹 기반 플랫폼 이며, https://usegalaxy.org/에 액세스할 수 있습니다.
      1. 도구 메뉴에서 선택 "데이터 > 당신의 컴퓨터에서 파일을 업로드". 드래그 드롭 창으로 시퀀싱 플랫폼에서 생성 된.fastq 파일 다음 클릭 "시작".
      2. Leptospira 게놈 시퀀스.txt 파일을 업로드 하려면 동일한 단계를 따릅니다.
    3. 신랑이 읽습니다.
      1. 선택 "NGS: QC 및 조작 > FASTQ Groomer" 도구 메뉴에서.
      2. 신랑을 파일, 다음 단계 4.2.2에서에서 업로드 라이브러리를 선택 합니다. 입력 FASTQ 품질 점수 형식에서 적절 한 시퀀싱 시스템을 선택 합니다. 고급 옵션에 대 한 선택 숨기기 고급 사무실을 떠나.
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    4. 제거 시퀀싱
      1. 선택 "NGS: QC 및 조작 > 시퀀싱 제거". 필터링 할 라이브러리 옆 4.2.3 단계에서 생성 된 단정한 파일을 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다.
    5. C-꼬리 시퀀스를 제거
      참고: 모든 C-꼬리를 보장 하기 위해 한 두 번이 단계는 제거를 반복 합니다.
      1. 선택 "NGS: QC 및 조작 > 어댑터 시퀀스 클립".
      2. 선택 하거나 다음을 입력 합니다.
        도서관 클립: 4.2.4 단계에서 생성 된 파일을 선택 합니다.
        최소 시퀀스 길이: 15
        사용자 지정 시퀀스를 입력 하는 소스:
        사용자 지정 클리핑 시퀀스: CCCCCCC
        0이 아닌 값을 어댑터 시퀀스와 그것을 따르는 x 기지 유지 입력: 0
        알 수 없는 (N) 기지와 시퀀스를 무시: 예
        출력 옵션: 잘린 및 비 클립 시퀀스를 출력
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    6. 어댑터 시퀀스를 제거
      1. 선택 "NGS: QC 및 조작 > 어댑터 시퀀스 클립".
      2. 선택 하거나 다음을 입력 합니다.
      3. 도서관 클립: 4.2.5 단계에서 생성 된 파일을 선택 합니다.
      4. 최소 시퀀스 길이: 15
      5. 사용자 지정 시퀀스를 입력 하는 소스:
      6. 사용자 지정 클리핑 시퀀스 입력: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. 0이 아닌 값을 어댑터 시퀀스와 그것을 따르는 x 기지 유지 입력: 0
      8. 알 수 없는 (N) 기지와 시퀀스를 무시: 예
      9. 출력 옵션: 잘린 및 비 클립 시퀀스를 출력
      10. "실행"을 클릭 합니다.
    7. 그들의 품질에 따라 필터 읽기
      1. 선택 "NGS: QC 및 조작 > 품질 필터".
        참고:이 도구는 품질 평가 점수에 따라 읽기를 선택 합니다.
      2. 다음을 선택 합니다.
        필터링 할 라이브러리: 4.2.6 단계에서 생성 된 파일을 선택 합니다.
        품질 컷오프 값: 20
        질 해야 하는 순서로 기지의 % 동등 하/보다 높은 커트 오프 가치: 95
      3. "실행"을 클릭 합니다.
        참고: 이러한 설정을 사용 하 여 읽기 20 뉴클레오티드 또는 20의 품질 평가 점수와 함께 짧은 이하의 사이클의 95%는 삭제 됩니다. 적응 실험을 엄중 설정.
    8. 읽기32 지도
      1. 선택 "NGS: 매핑 > Bowtie2"32.
      2. 주 창에서 필드에서 다음을 선택 합니다.
        이 단일 또는 결합 라이브러리: 일자형
        FASTQ 파일: 라이브러리 4.2.7 단계에서 품질에 대 한 필터링을 선택 합니다.
        별도의 파일 (fastq 형식)에 정렬 되지 않은 읽기 쓰기: 없음
        파일을 정렬된 (fastq 형식)에서 읽기 쓰기: 없음
        당신의 역사에서 참조 게놈을 선택 것입니다 하거나 내장 된 인덱스를 사용 하 여?: 역사에서 게놈을 사용 하 고 인덱스 작성
        선택 참조 게놈: Leptospira genome.txt 파일 업로드 단계 4.2.2에서에서 선택.
        설정 그룹 정보를 읽을?: 설정 하지 마십시오
        선택 분석 모드: 1: 기본만 설정
        프리셋을 사용 하 시겠습니까?: 아니, 그냥 기본값 사용
        역사에 bowtie2 매핑 통계를 저장: 없음
        리소스 매개 변수 작업: 기본 작업 리소스 매개 변수를 사용 하 여
      3. 게놈에 정렬 하려면 "실행"을 클릭 합니다.
    9. 파일 변환
      1. 선택 "NGS: SAMtools > BAM 샘 샘 BAM 변환".
      2. 다음을 선택 합니다.
        BAM 파일 변환: 선택 매핑된 단계의 4.2.8 라이브러리.
        헤더 옵션: 헤더 샘 출력에 포함 (-h)
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    10. 파일 변환
      1. 선택 "NGS: SAMtools > 간격 샘 변환".
      2. 다음을 선택 합니다.
        변환할 데이터 집합 선택: 4.2.9 단계에서 생성 된 샘 매핑된 라이브러리 파일을 선택.
        모두 인쇄?: 네
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    11. 정렬 읽기
      1. 선택 "필터 및 정렬 > 오름차순 또는 내림차순으로 데이터 정렬".
      2. 다음을 선택 합니다.
        데이터 집합 정렬: 4.2.10 단계에서 생성 된 간격 파일 선택.
        열: 2
        맛: 순서
        에 다: 오름차순
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    12. 일치 하는 염색체 읽기 선택 난
      1. 선택 "필터 및 정렬 > 식과 일치 하는 라인을 선택".
      2. 다음을 선택 합니다.
        라인 선택: 정렬 된 읽기 단계 4.2.11에서에서 생성 된 파일 선택.
        그: 일치
        패턴: 단계 4.2.1.3 (예를 들어, "기독교")에서으로 내가 결정 하는 염색체의 이름 입력.
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    13. 일치 하는 염색체 II 선택 읽기
      4.2.12 단계 진행 합니다.
    14. 그룹은 염색체에 삽입 사이트에 읽고 내가
      1. 선택 "조인, 빼기와 그룹 > 데이터 열으로 그룹화 하 고 다른 열에 집계 작업을 수행".
      2. 다음을 선택 합니다.
        데이터 선택: 단계 4.2.12에서에서 결과 파일 선택.
        그룹 열: 2
        그룹화 하는 동안 소문자 무시?: 없음
        이 문자로 시작 하는 줄을 무시: Ø
        작업 > 작업 삽입 +
        종류: 수
        열: 2
        가장 가까운 정수로 결과 라운드: 없음
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    15. 그룹 II 염색체에 삽입 사이트에 따르면 읽습니다.
      4.2.14 단계 진행 합니다.
    16. 정렬 삽입 사이트 염색체에 나
      1. 선택 "필터 및 정렬 > 오름차순 또는 내림차순으로 데이터 정렬".
      2. 다음을 선택 합니다.
        데이터 집합 정렬: 4.2.14 단계에서 파일을 선택 합니다.
        열: 1
        맛: 순서
        에 다: 오름차순
      3. "실행"을 클릭 합니다.
    17. 염색체 2 차 정렬 삽입 사이트
      4.2.16 단계 진행 합니다.
  3. 통계 분석
    1. 복사 및 붙여넣기 단계 4.2.16에서에서 두 개의 열으로 스프레드시트 파일은 데이터를 전송. 그리고 4.2.17입니다. 으로 하는 Excel 파일.
      참고: 첫 번째 열은 transposon 삽입 사이트의 뉴클레오티드 좌표 하 고 두 번째 열은 각 삽입 사이트에서 읽기 수 있습니다.
    2. 은닉 transposon 테이블에 제공 된 뉴클레오티드 좌표를 사용 하 여 유전자를 식별 합니다.
      참고: 예를 들어 뉴클레오티드 #30718 염색체에 삽입 하는 transposon 나는 걸쳐 뉴클레오티드 29263 31539에 염색체, LIC10024 유전자에 있는 나.
    3. 각 조직에와 아래 방정식에 따라 입력된 수영장에서 각 돌연변이 대 한 상대 주파수 (F)을 계산.
      figure-protocol-4
    4. 각 돌연변이 아래 수식을 사용 하 여 조직에 대 한 입력/출력 비율 (R)을 계산.
      figure-protocol-5
    5. Wilcoxon 서명 순위 테스트
      1. 1.0 각 동물의 각 조직에 대 한 평균 비율을 설정 하 여 모든 입력/출력 비율을 정상화. 1.0의 비율은 중립, > 1.0은 불리 한, 그리고 < 1.0은 유리한33.
      2. P 값으로 Wilcoxon 순위 테스트를 사용 하 여 1.0 (중립 피트 니스) 입력/출력 비율을 비교 < 0.05 통계적으로 유의 한 것으로 간주.

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결과

그림 1에서 보듯이 transposon 돌연변이 L. interrogans 에 활용 하 여 도서관의 창조 여과 장치를 요구 한다. 우리는 각 짝짓기에서 100-200 transconjugants를 복구.

Transposon 삽입 사이트는 transposon의 끝을 대상으로 어느 정도 임의적인 PCR에 의해 생성 된 PCR 제품을 시퀀싱으로 각 돌연변이에 식별 되 고 인접 한 호스트 시퀀스15 (그림 2A). 어느 정도 임의적인 PCR의 결과의 예는 그림 2B에 표시 됩니다. 대부분의 경우에는 지배적인 amplicon 2 차 PCR 태그와 TnkN1...

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토론

Intraperitoneally 42 L. interrogans 돌연변이 함께 도전 하는 햄스터에 대 한 우리의 파일럿 실험 결과17제공 됩니다, 하지만 우리는 돌연변이의 더 큰 수영장 Tn이 의해 상영 될 수 있습니다 기대 Transconjugants의 주파수는 낮은 때문에 (100-200 transconjugants/짝짓기), 몇몇 matings 큰 Tn-Seq 실험에 대 한 돌연변이의 충분 한 번호를 생성할 필요가 있습니다. 액체 문화에서 돌연변이의 많은 수를 유지 하는 해결 되어야 물류 도전을 선물 한다. 문화 깊은 96 잘 접시에 알을 품을 수 있다. 문화 밀도 420로 설정 하는 분 광 광도 계에 신호는 광학 밀도 의해 모니터링할 수 nm. 사용 하는 동물의 수의 결정 부분에 입력된 풀의 크기에 따라 고 전력 분석에 의해 결정 되어야 합니다. 대규모 실험에 대 한 전력 분석 협의 biostatistician에서 수행 되어야 하는 것이 좋습니다.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품 재향 군인 업무 공로 수상 (D.A.H.)에 의해 지원 되었다 그리고 건강의 국립 연구소는 부여 R01 AI 034431 (D.A.H.).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
스트렙토마이세스 kanamyceticusSigma-AldrichK4000
2,6-디아미노피멜릭산Sigma-AldrichD1377
스펙티노마이신 디하이드로클로라이드 펜타하이드레이트Sigma-AldrichS4014
Axio Lab A1 현미경(암시야 포함)Zeiss490950-001-000
DNeasy 혈액 및 조직 키트Qiagen69504/69506
MinElute PCR 정제Qiagen28004/28006
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28104/28106
모델 505 음파 분석기Fisher ScientificFB-505
2.5" 컵 혼Fisher ScientificFB-4625
비드 파열기 24Omni International19-010Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferasePromegaM828C
Master mix PhusionThermo ScientificF531게놈 라이브러리 준비, step 3.4.
DreamTaq Master MixThermo ScientificK9011/K9012트랜스포존 삽입 부위 식별, 1.2단계.
dCTPThermo ScientificR0151
ddCTPAffymetrix/ USBProducts77112
T100 Thermal cyclerBioRad1861096
Qubit 2.0 형광측정기InvitrogenQ32866step 3.6.
Qubit dsDNA HS 어세이 키트InvitrogenQ32851/Q328543.6단계.
Qubit 어세이 튜브생명 기술Q32856단계 3.6.
PBS pH 7.2 (1X)Gibco20012-027 20012-050
일회용 메스 No10Feather2975#10
플라스틱 K2 EDTA 2ml 튜브BD 진공 청소기367841
사기 U-100 26G x ½ ” 바늘BD 진공 청소기329652IP 챌린지, 2.2.1 단계.
3mL Luer-Lok 팁 주사기BD 진공309657심장 천자, 2.4.2단계.
25G X 5/8" 바늘BD 진공 청소기305901심장 천자, 단계 2.4.2.
스토퍼가 있는 25mm 프릿 유리 베이스EMD MilliporeXX1002502여과 장치 시스템, 단계 1.1.7.
25mm 알루미늄 스프링 클램프EMD Millipore XX1002503여과 장치 시스템, 단계 1.1.7.
15ml borosilcate 유리 깔때기EMD MilliporeXX1002514여과 장치 시스템, 1.1.7 단계.
125ml 측암 삼각 플라스크EMD Millipore XX1002505여과 장치 시스템, 1.1.7단계.
아세테이트-셀룰로오스 필터 VVPP(기공 크기 0.1mm, 직경 25mm)EMD 밀리포어VVLP02500
의 카나마이신 황산염 주 청소기

참고문헌

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307(2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359(2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117(2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021(2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2(2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86(2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367(2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800(2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787(2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225(2017).

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