미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류

요약

이 프로토콜에는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드와 세포 신호 캐스케이드 인 단백질의 지 방화를 평가 하는 방법을 설명 합니다.

초록

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) 미토 콘 드리 아 게놈의 다른 알려진된 유전자 내의 작은 열려있는 독서 프레임으로 인코딩됩니다 펩 티 드의 새로운 클래스는. MDPs는 apoptosis에서 신경 세포를 보호, 개선 신진 대사 마커, 화학요법에서 세포를 보호 등 생물학적 효과의 다양 한이 있다. Humanin 발견 첫 번째 민주당 고 민주당 가족 중 가장 공부 펩 티 드 이다. 막 수용 체와 humanin의 하류 신호 경로 신중 하 게 특징 되었습니다. 태그 c와 SHLP1-6 등 추가 MDPs 최근에 발견 되었습니다 고 신호 메커니즘 아직 해명 될. 여기이 펩 티이 드의 기능을 결정 하는 셀 문화 기반 방법을 설명 합니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 셀 분류 기법 활성화의 양적 결정 및 중요 한 신호 분자의 전 좌 허용. 세포 분별 법의 다른 방법이 있다, 하는 동안 여기에 설명 된 하나 쉽고 간단한 방법입니다. 이러한 방법은 더 명료이 펩 티이 드 및 다른 치료제의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

서론

신흥 연구는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) cytoprotection 및 대사^1,2,3중요 한 역할을 재생을 보여줍니다. 신호 변환 통로 MDPs의 존재 이해는 MDPs는 다양 한 기능을 조절 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 제공. 첫 번째 확인 된 민주당 humanin, extracellular 신호 통제 키 1/2 (ERK1/2)을 증가 표시 되었습니다^4,5바인딩 그것의 수용 체를 통해 인 산화. 그러나, ERK1/2 활성화의 다운스트림 효과 여전히 underexplored.

ERK1/2 캐스케이드 다양 한 확산, 셀 이동, 세포 물질 대사, 생존, 및 apoptosis^6,,78을 포함 하 여 세포질 과정에에서 필수적인 중재자 역할을 합니다. 모든을 통합 하는 것을이 다른 세포질 과정, 활동 및 ERK1/2의 subcellular 지 방화는 단단히 통제 가수분해 및 비 계 단백질^9,10. 포스트 번역 상 수정 뿐 아니라 그것의 신호 기능, 활동, 및 특이성^11,12조절 또한 ERK1/2의 동적 였죠. ERK1/2 주로 cytosol¹³에서 지역화 됩니다. 고정 및 비 계 단백질의 세트, 세포의 표면 또는 세포질¹³확산에 cytoskeletal 요소에 ERK1/2을 유지 도움이. 자극, ERK1/2은 phosphorylated 고 핵, 미토 콘 드리 아, 골, 리소좀^14, 등 다른 subcellular 구획에 ERK1/2의 전 수 있도록 그 정박 단백질에서 해리 된다 ^{15 , 16}.

비록 humanin는 ERK1/2 신호 전달 경로 활성화, ERK1/2의 활성화만 총 세포 lysates에서 관찰 됩니다. ERK1/2 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과, 모두 subcellular 지 방화의 분석 및의 총 수준에 중요 한 역할 때문에 이전에 설명한 대로 phosphorylated ERK1/2는 포괄적인 이해를 제공 하는 데 필요한 ERK1/2 활성화 humanin 유도 및 다운스트림 목표의 활성화.

활성화 ERK1/2의 대상 세포를 이해 하려면 뒤에 phosphorylated ERK1/2 서 부 럽 subcellular 분류 수행 되었다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시 약 사용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 격리 된 subcellular 구획 straightforwardly 해석 결과 허용 하는 고 순도의 있습니다. ERK1/2 Immunostaining의 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 subcellular 구획은 상대적으로 시각화 하 고 특별 한 고정 및 permeabilization 방법이 필요로 어렵습니다. ERK1/2 레벨 subcellular 구획에 변화 하 고 전체 세포 lysates 볼 때이 변화 거짓 긍정과 거짓 부정적인 신호를 발생할 수 있습니다. 따라서, 격리 된 subcellular 구획을 사용 하 여 한 immunoblot 우리가 ERK1/2 지역화의 더 나은 이해를 제공 합니다.

방법의 다양성에 다른 MDPs 또는 STAT3 같은 다른 신호 분자의 전 좌를 포함 하 여 다른 자극의 효과 조사 하는 프로토콜의 수정 수 있습니다. 최근 발견 된 작은 humanin와 같은 펩 티 드 (SHLPs) 16S rRNA 지구 humanin 인코딩 및 HN¹⁷에 비해 유사 하지만 개별 속성에서 인코딩됩니다. 예를 들어 SHLP2 및 SHLP3에 8 h humanin 검토 다른 펩 티 드에 대 한 응답에서 ERK1/2의 subcellular 지 방화 5 분 이내 ERK1/2를 활성화 하는 있지만 우리가 줄 것 이다 이러한 펩 티이 드의 생물학의 더 나은 이해 후 ERK1/2를 활성화 해야 합니다. 증거를 신흥 신호 분자의 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과에 중요 한 역할을 담당 했다. 예를 들어, STAT3 전통적으로 주로 휴식 셀에 cytosol에서 지역화는 알려져 있으며 다음 응답 cytokines¹⁸으로 유전자 발현을 활성화 하는 핵으로 translocates. 또한 STAT3 미토 콘 드리 아를 translocates 하 고 TCA 주기 및 ATP 생산¹⁹. Autophagy 규제에 관한 STAT3의 다른 subcellular 지 방화 다양 한 방법으로²⁰에서 autophagy를 조절 한다. 예를 들어 핵 STAT3 transcriptionally autophagy 관련 유전자를 조절 하 고 autophagy 변조기 역할. 세포질 STAT3 constitutively autophagy 신호 분자와 상호 작용 하 여 autophagy를 억제. 미토 콘 드 리아 STAT3 억제 하 고 산화 스트레스 유발 autophagy를 억제 하 여 mitophagy를 방지 합니다. 따라서,이 subcellular 구획 격리 방법은 다른 신호 분자로 ERK1/2의 역할을 이해 하기 위한 중요 한입니다.

프로토콜

1. 셀에 펩 티 드 치료

1. 2 백만 SH-SY5Y 접시 또는 10 cm로 HEK293 세포 (2 x 10 ⁶) 요리와 2 일 동안 그들을 성장
2. (선택 사항) 다음 날, 셀 세럼 무료 Dulbecco 씻어 ' s 수정 매체 (DMEM) 미디어를 한 번 독수리 및 혈 청 치료 혈 청 무료 미디어에서 일을 해야 하는 경우 무료 DMEM 하룻밤 함께 품 어.
3. 3 일에 0.2 µ m 필터링, 증류수, 고 1 m m 재고 솔루션으로 그들을 다시 구성에서 S14G humanin 펩 티 드를 분해.
   참고:는 펩 티 드 (예를 들어, 전체 충전) 펩 티 드의 시퀀스 특성에 의해 결정 될 수 있다 고는 펩 티 드 상업적으로 사용할 수 있는 경우는 제조 업체에 의해 제공 될 수 있습니다 적절 한 용 매에 녹아 해야 합니다. 예를 들어, S14G humanin, SHLP6, SHLP2, 및 태그 c 물에 용 해. Aliquot 동결을 방지 하 고 주기를 해빙 하는 적절 한 볼륨 (예를 들어, 50 μ)에서 펩 티 드. 일단 해 동, 사용 하지 않는 다시.
4. 미리 데워 진 혈 청 포함 약 수 또는 혈 청-무료 미디어 50 ml 원뿔 튜브 및 실내 온도 1 m m 재고 솔루션 작업 농도 (예를 들어, 1 µ M, 10 μ M)에 그것을 만들기 위해 추가.
5. 6 mL 펩 티 드 솔루션 단계 1.4에서에서 미디어 바꿉니다. 시간의 적절 한 금액에 대 한 셀을 품 어 고.
   참고: 선택 ERK 활성화 상태에 따라 보육 시간.

2. Cytosol와 핵 subcellular 분별

1. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL로 두 번 셀을 씻고, 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 ml에서 접시에서 셀 긁 고 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
2. 4에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심 ° c.
3. PBS를 발음 하 고 다시 얼음 처럼 차가운, 분별 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 (10 mM HEPES pH 7.6, 3 m m MgCl ₂, 10 m m KCl, 5% (v/v) 글리세롤 1% 비 이온 계면 활성 제 (C ₁₃ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) = _n), 효소/인산 가수분해 효소 억제제).
   참고: 유지 하기 위해 단백질의 인 산화 상태에, 인산 가수분해 효소 억제 물 뿐만 아니라 프로 테아 제 억제 물 갓 추가 되어야 하 고 샘플 지켜져야 한다 얼음에 모든 시간. 동결과 해 동을 반복 샘플의 주기를 피해 야 한다. -80에 그들을 동결 하기 전에 작은 금액 (예: 50 μ g)으로 aliquot 샘플 ° c.
4. 다음 4에 5 분 동안 250 x g에서 원심 고 15 분 동안 얼음에 다시 일시 중단 된 펠 릿을 품 어 ° c.
5. 세포질 분수 상쾌한 수집 하 고 핵 부분을 위해 펠 릿을 유지.
6. 원심 18000 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 다른 오염 물질과 세포 파편을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송에 상쾌한. 이것은 cytosol 분수.
7. 200 μ 차가운 워시 버퍼에 펠 릿을 resuspend (10 mM HEPES pH 7.6, 1.5 m m MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25% (v/v) 글리세롤, 0.2 m m EDTA, 효소/인산 가수분해 효소 저 해제 =) 및 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기
8. 는 상쾌한 제거 및 100 μ 얼음 처럼 차가운, 핵 추출 버퍼에 펠 릿을 resuspend (20 mM HEPES pH 7.6, 1.5 m m MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25% (v/v) 글리세롤, 0.2 m m EDTA, 효소/인산 가수분해 효소 억제제 =)와 10 번을 sonicate (5 초, 10 s , 30% 앰프.) 얼음에
9. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리기
10. 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 이것은 핵 분수.
11. 계량 BCA 분석 결과 사용 하 여 단백질 금액

3. 원유 미토 콘 드 리아 분수

1. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL와 함께 각 10 cm 접시에 셀을 씻어 5 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS, 추가 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 분리.
   참고: 서 럽에 대 한 미토 콘 드리 아의 좋은 수확량을 셀의 3 10 cm 요리 사용.
2. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 한 15 ml 원뿔 튜브에 세 10 cm 요리에서 모든 결합.
3. 4 시 10 분 600 x g에서 세포를 원심 ° c.
4. PBS를 발음 하 고 다시 얼음 처럼 차가운 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL에 펠 릿을 일시 중지 (10 mM Tris MOPS, pH를 조정 하는 1mm EGTA/트리 스, 자당, 200mm = 7.4).
5. 얼음에 소계 코팅된 유 봉과 2 mL 균질 화기의 25 선 셀 균질
   참고:이 단계는 미토 콘 드 리아 무결성을 유지 하 고 미토 콘 드리 아 분수의 수익률을 극대화 하는 중요 한. 획 수는 각 세포 유형에 최적화 되어야 합니다. 절차를 시작 하기 전에 균질 화기를 쿨.
6. Microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 핵 및 손상 되지 않은 세포 제거 하 4 ° C에서 10 분 600 x g에서 원심.
7. 는 상쾌한 수집 하 고 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송 하 고, 4에서 10 분 동안 7000 x g에서 원심 ° c.
   참고: 펠 릿은 느슨한 관리와 함께 상쾌한을 수집 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않으려고.
8. 는 상쾌한을 제거, 다시 차가운 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 200 μ와 펠 릿을 일시 중단 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에 솔루션을 전송. 4에서 10 분 동안 7000 x g에서 튜브를 원심 ° c.
9. 반복 단계 3.8 펠 릿을 세척입니다. 이 단계에서 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송할 필요는 없습니다.
10. 는 상쾌한 씻어 펠 릿에서 제거 하 고 다시 RIPA 버퍼의 50 μ와 미토 콘 드리 아를 포함 하는 펠 릿을 일시 중지.
11. 품 10 분에 대 한 얼음에 서 스 펜 션
12. 4에서 16000 x g 15 분 동안에 현 탁 액을 원심 ° c.
13. 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 이것은 미토 콘 드리 아 분수.
14. BCA 분석 결과 사용 하 여 단백질 양을 계량.

4. 인 특정 단백질을 위한 서쪽 Blotting

1. 는 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (8-16% 들어찬 젤)를 수행 하 고 전송 단백질 PVDF 막 ⁴.
2. TBST에 5 %BSA 막 품 어 (0.1% 폴 20) 배경 비 특정 바인딩 사이트 차단에 실 온에서 30 분.
   참고: phosphorylated 단백질 검출을 위한 BSA 하지 우유와 막을 차단 합니다. 우유 카 세 인, 높은 일반적인 신호는 풍부한 phosphoprotein 포함.
3. 하룻밤 4 ° C에서 1 차 항 체 (안티-인-ERK1/2)와 막 품 어.
4. 다음 날 씻어 TBST 가진 멤브레인 (0.1% 폴 20) 세 번 실 온에서 5 분.
5. 품 어 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체 (항 토끼 HRP)와 막.
6. TBST 가진 막 세척 (0.1% 폴 20) 세 번 실 온에서 5 분.
7. ECL 솔루션 막 품 어 및 이미지 분석기에서 막 이미지.
8. 스트립 스트립 실내 온도 및 세척 5 분에 대 한 세 번 TBST 가진 막에 15 분에 대 한 버퍼와 막
9. 4.2-4.7 안티 총 ERK1/2 항 체를 사용 하 여 단계를 반복.
10. 각 분수의 순도 확인, SDS 페이지를 실행 하 고 immunoblots (예: 핵, 미토 콘 드리 아에 대 한 TOM20 및 GAPDH cytosol에 대 한 대 한 Lamin B1) 각 구획에 대 한 마커를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 수행.

결과

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 1 μ M와 100 μ M HEK293와 SH SY5Y 셀 치료 S14G-humanin, 강력한 humanin 아날로그²¹, 각각, 완료 미디어 (그림 1 및 그림 1 지정 된 기간에 대 한 B). 우리는 다음 세²⁰²총 단백질 추출 물에서 /Tyr²⁰⁴ 에서 ERK1/2의 총 및 phosphorylated 형태 검사. S14G humanin 치료의 규제 세²⁰²/Tyr²⁰⁴ 사이트에서 ERK1/2의 인 산화의 증가 보였다. ERK1/2의 subcellular 지 방화의 특이성에 특히 그것의 신호 전달 기능에 중요 한 역할을 한다. ERK1/...

토론

여기, 우리가 보여주는 두 가지 서로 다른 세포 유형, 발생 하는 humanin 펩 티 드-중재 ERK1/2 활성화 및 활성화 ERK1/2의 subcellular 지 방화 (예를 들면, 펩 티 드, 시간 및 셀의 조건에 따라 다를 수 있습니다. 입력) 합니다. 그것은 보였다 그 humanin 두 개의 다른 수용 체^22,23, humanin의 다른 복용량에 대 한 요구 사항 뿐 아니라 두 셀 라인 신호에 차이점을 설명할 수 통해 신호. 이의 생리 적인 의미 완벽 하 게 공부 하지 않은 하지만 그것은 하나의 가능한 메커니즘 HN 조직 종속 응답을 제안할 수 있습니다.

ERK1/2 신호에 중요 한 역할을 담당 하는 ERK1/2의 인 산화 그리고 ERK1/2의 인 산화 상태 동적인 변화를 보여줍니다. ERK1/2 특정 조건/자극 아래 phosphorylated 찾을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell signaling	9102	Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Cell signaling	4370	Dilution 1:1,000
Lamin B1	Cell signaling	12586	Nuclear marker, Dilution 1:1,000
GAPDH	Cell signaling	5174	세포질 마커, Dilution 1:2,000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	미토콘드리아 마커, 희석 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated	Cell signaling	7074	희석 1:30,000
RIPA 용해 및 추출 버퍼	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm 배양 접시	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG 펩타이드	Genescript
25mm 실링 필터	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
glycerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	시그마	M1254
EGTA	시그마	E3889
설탕	시그마	S7903
트리스 베이스	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	시그마	H1758
PBS	Lonza	17-512F
세포 스크레이퍼	FALCON	353085
홀트&트레이드; 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
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Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
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복원 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
초음파 발생기, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12