Summary
Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.
Abstract
Eiwitten zijn in een dynamische staat van synthese en degradatie en hun halfwaardetijd onder verschillende omstandigheden kunnen worden aangepast. Echter, meest gebruikte benaderingen te bepalen eiwit half-life zijn ofwel beperkt tot bevolking gemiddelden uit lysed cellen of vereisen het gebruik van proteïne synthese remmers. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van de module-tag fusion eiwitten in combinatie met fluorescentie time-lapse microscopie. Een proteïne van belang gesmolten naar een module-tag kan worden covalent gebonden door een fluorescerende, cel permeabele kleurstof die is gekoppeld aan een benzylguanine-derivaat en het verval van de gelabelde eiwit bevolking kan worden gecontroleerd na wassen van de resterende kleurstof. Volgende cel bijhouden en kwantificering van de intensiteit van de geïntegreerde fluorescentie over tijd leidt tot een exponentiële afname kromme voor elke bijgehouden cel, zodat voor de bepaling van eiwit afbraak tarieven in afzonderlijke cellen door curve-fitting. Deze methode biedt een schatting voor de heterogeniteit van de helft-leven in een populatie van gekweekte cellen, die niet gemakkelijk worden beoordeeld door andere methoden. De hier gepresenteerde benadering is van toepassing op elk type van gekweekte Adherente cellen, uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten aan een module-code. Hier gebruiken we muis embryonale (ES) stamcellen gekweekt op E-cadherine-coated cel cultuur platen om te illustreren hoe één cel afbraak tarieven van eiwitten met een breed scala aan helft-leven kunnen worden bepaald.
Introduction
Het is algemeen bekend dat cellulaire eiwitten ondergaan uitgebreide omzet, met synthese en degradatie tarieven specifiek voor elke proteïne en onder voorbehoud van fysiologische regelmechanismen. Traditioneel, zijn eiwit-afbraak-tarieven gemeten gebruik van bulk methoden, zoals radioactieve pulse chase analyse, of waarbij de eiwit synthese remmers zoals cycloheximide1. Meer recentelijk is te kwantificeren eiwit omzet op een wereldwijde schaal2stabiele isotoop labelen met aminozuren in celkweek (SILAC) in combinatie met massaspectrometrie opgezet. Echter, deze methoden worden beperkt door de bevolking gemiddeld, en informatie over de cel-naar-cel variabiliteit daarom verloren. Bovendien, voorbijgaande veranderingen in de afbraak van eiwitten die niet-gesynchroniseerde over de celpopulatie bevat zijn niet kunnen worden geïdentificeerd.
Als alternatief, eiwit halfwaardetijd kunnen ook worden bepaald door fluorescentie-gebaseerde benaderingen, die vaak het voordeel hebben van het verstrekken van eencellige resolutie. Bijvoorbeeld is een photoactivatable groen fluorescent proteïne (paGFP) gebruikt om te bepalen Oct4 halfwaardetijd in de vroege zoogdieren embryo3. Een andere methode om te controleren van eiwit verval in levende cellen is het gebruik van een module-tag in combinatie met fluorescentie time-lapse beeldvorming. De module-tag is een mutant versie van de DNA repair enzymen O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) die specifiek reageert met benzylguanine (BG) derivaten, die kunnen worden gekoppeld aan moleculaire sondes4,5, 6. daarom elke module-tag fusieproteïne onomkeerbaar kan worden aangeduid met een fluorescente, cel permeabele kleurstof. Pulse labeling van een proteïne van belang gesmolten tot de module-tag, gevolgd door wegspoeling van de resterende kleurstof, staat voor het toezicht op de afbraak van de gelabelde eiwit bevolking en dus voor de bepaling van eiwit half-life. MODULE-tags zijn met succes gebruikt voor het labelen van de puls-chase van eiwitten en voor de bepaling van eiwit halfwaardetijd in aanhanger cel cultuur en in vivo5,7,8,9. Een grote verscheidenheid van module-tag substraten die betrekking hebben op gebruikte TL spectra zijn commercieel verkrijgbaar, waardoor de selectie van de optimale kleurstof voor elke specifieke toepassing. MODULE-tags kunnen dus ook worden gebruikt voor multicolor imaging in combinatie met andere tl fusie-eiwitten of kleurstoffen. Cel-ondoordringbare kleurstoffen zijn geschikt voor het labelen van membraan-aangebonden proteïnen, terwijl cel-permeabele kleurstoffen die van toepassing zijn zijn voor het toezicht op zowel intracellulaire en membraan-gebonden eiwitten. Bovendien, sommige van deze sondes bijna geen basale fluorescentie vertonen en pas uitstoten een sterk fluorescerende signaal op binding aan een module-tag10.
Dit protocol beschrijft hoe meet je de tarieven van de afbraak van verschillende eiwitten van belang in afzonderlijke cellen met behulp van een module-tag. Hier wij deze methode toepassen op muis embryonale stamcellen (ES) cellen gekweekt op E-cadherine, maar het moet mogelijk zijn om het te gebruiken met elk celtype aanhangend gekweekte. We laten zien dat pols labeling van module-tag fusion eiwitten gevolgd door fluorescentie time-lapse imaging zorgt voor het bepalen van het eencellige half-leven van verschillende eiwitten van belang en schatting voorziet in de cel-naar-cel variabiliteit van helft-leven in een bevolking van gekweekte cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: In deze studie, de E14 ES-cellijn werd gebruikt. Dit protocol is echter direct van toepassing op alle andere muis ES cellijn uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten aan een module-code, door de endogene proteïne te labelen of met behulp van overexpressie. Voor een voorbeeld in het gedeelte ' resultaten ', doxycycline-afleidbare module-tag fusion cellijnen werden gebruikt (module-tag gesmolten aan de volgende eiwitten: Nanog, Oct4, Srsf11, of de mOrange2 van fluorescente proteïnen en sfGFP, en onder de controle van een Doxycycline-afleidbare promotor. (Zie11 voor meer informatie over de plasmiden gebruikt voor de generatie van de doxycycline-afleidbare fusion cellijnen van module-tag). De doxycycline-afleidbare systeem kunnen bijzonder nuttig, omdat het zorgt voor een strak controle van de timing en intensiteit van de uitdrukking van de proteïne van belang. C-terminal positionering van de module-tag wordt aanbevolen, als het veranderen van het N-terminaal aminozuur volgorde is meer kans om te veranderen de halfwaardetijd van het target-eiwit (N-einde regel12).
1. E-cadherine coating en cel zaaien
- Het genereren van een ES-cellijn uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten met de module-label4.
- Jas 100 mm cel cultuur gerechten met 4 mL 0,1% gelatine (verdund in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 +/Mg2 +) voor 1 h. gelatine verwijderen en laten drogen voor 1 h. gebruik onmiddellijk of opslaan van de gecoate gerechten voor maximaal 2 maanden.
- Groeien de cellijn van belang in het kweekmedium cel van ES (Glasgow Minimum essentiële Medium, aangevuld met 10% ES cel-gekwalificeerde foetale runderserum met 2 mM natrium pyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, 100 µM 2- mercaptoethanol, leukemie remmende factor (LIF), 3 µM CHIR99021 en 0.8 µM PD184352) op gelatine beklede gerechten bij 37 ° C en 5% CO2 voor 2 dagen tot het bereiken van een samenloop van 10-20 Mio cellen per schotel.
Opmerking: Hier, LIF werd geproduceerd door voorbijgaande transfectie van HEK 293T cellen, gevolgd door supernatant collectie en filteren. Elke batch van LIF is getest voor zijn potentieel te handhaven pluripotent, maar concentraties waren niet bepaald. Echter recombinante LIF ook commercieel beschikbaar is en de concentratie gebruikte voor de cultuur van de cel van de muis ES is 1000 eenheden/mL13. - Jas van een 96-wells-plaat geschikt voor imaging met 30 µL van recombinante muis E-cadherine Fc chimera eiwit (E-cad-Fc) per putje (5 ng/µL, verdund in PBS met Ca2 +/Mg2 +. Gebruik van voorraad concentraties van 100 ng/µL, opgeslagen bij-80 ° C). Vermijd uitgebreide pipetteren, zoals E-cad-Fc erg kwetsbaar is. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
Opmerking: Afhankelijk van de Microscoop, andere indelingen kunnen worden gebruikt. - De E-cad-Fc gecombineerd, eens wassen met 100 µL van PBS met Ca2 +/Mg2 +en voeg 100 µL voorverwarmde ES cel kweekmedium.
- De cellen van belang met 5 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +wassen. Gecombineerd en voeg 2 mL trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Voeg 4 mL ES cel kweekmedium, resuspendeer en spin down bij 1000 x g gedurende 4 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver vers ES cel kweekmedium.
Opmerking: PBS zonder Ca2 +/Mg2 + moet worden gebruikt voor het wassen van de cellen voor trypsinebehandeling om te verwijderen van Ca2 + -ionen, die nodig voor cel adhesie zijn. Daarentegen voor de E-cad-Fc verdunnings- en coating (stap 1.4), gebruikt PBS met Ca2 +/Mg2 +, sinds de hechting van ES-cellen naar E-cad-Fc gecoate gerechten is Ca2 +-afhankelijke14. - Verdun de geresuspendeerde cellen 1:10 in 1 mL ES cel kweekmedium en tellen, met behulp van een tellen kamer (belasting 10 µL voor een kamer van 0.1 mm diepte).
- Zaad 30.000 cellen/cm2 in de E-cad-Fc gecoat imaging plaat. Vul tot 200 µL per putje met ES cel kweekmedium. Voor doxycycline-afleidbare cellijnen, veroorzaken met een passende dosis van doxycycline (optimaliseren dosis en tijdstip van de inductie van tevoren. De hier gebruikte cellijnen werden behandeld met 500 ng/mL doxycycline 24 h vóór imaging). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 en ga verder met de pols labeling en imaging 24 h na het zaaien van de cel.
2. pulse labeling van de module-tag
Opmerking: Voor eiwit verval experimenten is het cruciaal om te gebruiken een adequate module kleurstof concentratie. De concentratie moet hoog genoeg om de opbrengst van een helder signaal in het begin van de tijd-tijdspanne, zoals de fluorescentie in de tijd afnemen zal. Echter, het gebruik van teveel kleurstof concentraties kan veroorzaken residuele kleurstof in het medium of in de cellen wordt overgelaten zelfs na het wassen. De gratis kleurstof kan het vervolgens binden aan nieuw geproduceerde module-tag moleculen in de loop van de film, die de verval-curve vervormen zal. De waargenomen fluorescentie signaal zal afhangen van de eigenschappen van de kleurstof, de cellijn gebruikt, evenals het niveau van de expressie van het overeenkomstige eiwit. Het is daarom van cruciaal belang voor het optimaliseren van de kleurstof concentratie door het testen van verschillende verdunningen, vanaf de verdunning voorgesteld voor beeldvorming van de levende cel door de fabrikant. Voor deze studie, werd een far-red fluorescerende substraat gebruikt. Een optimale concentratie van 12 nM was vastbesloten voor doxycycline-afleidbare overexpressie cellijnen.
- Verdun de kleurstof van de module naar de juiste concentratie in voorverwarmde ES cel kweekmedium. Gebruik een pipet zachtjes het medium verwijderen uit de cellen die eerder in de 96-wells-plaat zaadjes en voeg 50 µL van verdunde module kleurstof per putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- De verdunde kleurstof met een pipet gecombineerd en 3 x met 200 µL voorverwarmde PBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) wassen. Voeg 200 µL van ES cel cultuurmedium en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Herhaal de vorige stappen van wassen tweemaal meer.
Opmerking: De uitgebreide wassen is belangrijk om een ongebonden kleurstof te verwijderen. De stappen van de herhaalde wassen met PBS verwijdert de residuele extracellulaire kleurstof in het medium, overwegende dat de 15 min incubations robuuste labeling van de module-tag fusion eiwitten zorgen vóór het opstarten van de beeldvorming experiment. Echter de stappen wassen door zachte pipetteren en gebruik niet een automatische aspirator, zoals cellen ontpit op E-cad-Fc de neiging om gemakkelijk los te maken. - Voeg 200 µL van imaging medium. Vermindering van de fluorescentie-achtergrond, het gebruik van fenol red gratis medium (aangevuld met 10% ES cel-gekwalificeerde foetale runderserum 2 mM natrium pyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 en 0.8 µM PD184352).
3. time-lapse microscopie
- Gebruik een Microscoop geschikt voor levende imaging, waardoor gecontroleerde temperatuur en CO2. Stel de temperatuur tot 37 ° C en de CO-2 tot 5% voorafgaand aan gebruik en laat equilibreer gedurende 1-2 h.
- Plaats de plaat in de Microscoop en plekken te vinden die geschikt zijn voor imaging. Selecteer de plekken waar de cellen zijn gelijkmatig verdeeld, maar niet te dichte, aangezien dit de analyse zal vergemakkelijken. Aanpassen van het aantal geselecteerde plekken om het aantal cellen die nodig zijn voor de analyse. In deze studie, werden 3-5 plekken per cellijn geregistreerd.
- Selecteer het doel. Een 20 X doelstelling is geschikt voor de grootte van ES-cellen.
- Selecteer de instellingen van de verlichting voor de fluorescerende zender (s) worden geregistreerd. Het aanpassen van de kracht van de laser en de blootstelling volgens de intensiteit van de fluorescentie-signaal uit de cellen van belang. Zorg ervoor om het verkrijgen van een sterke eerste signaal, aangezien het zal in de loop van de film dalen, maar vermijd laser bevoegdheden hoger dan 30% om te minimaliseren van fototoxiciteit en photobleaching. Voor deze studie, een filter van de excitatie van 632/22 nm (golflengte/bandpass), emissie filter van 679/34 nm (golflengte/bandpass), laser macht van 10% en de blootstelling tijd van 100 ms werden gebruikt.
- Selecteer de imaging-intervallen en de duur van de time-lapse experiment. Kies voor eiwitten met verwachte half-leven van 2-20 h, tijden van de acquisitie van 12-24 h met tijdsintervallen van 15 min. Voor shorter-lived eiwitten, verminderen de intervallen en overname keer, voor de verhoging van de eiwitten van de langduriger dienovereenkomstig.
- Imaging starten
4. verwerking en analyse van het beeld
- Het verzamelen van de verworven beelden als een stapel in TIFF-indeling. Gebruiken voor verdere verwerking en analyse, de FIJI software15. Als de time-lapse gegevens worden niet verzameld als een stapel door de Microscoop software, opent u alle frames van de time-lapse experiment in de software (hetzij door te klikken op bestand | Open... of slepen en neerzetten van de bijbehorende bestanden naar de werkbalk) en klik op afbeelding | Stapels | Afbeeldingen stapelen.
- De functie aftrekken achtergrond te verwijderen van de achtergrond van alle afbeeldingen in de stack. Om dit te doen, klik op proces | Aftrekken van de achtergrond. Selecteer de rolstraal van de bal in het pop-upvenster. Gebruik een straal die minstens de grootte van de cellen beeld. Als u wilt aftrekken van de achtergrond toepassen op alle cellen in de stack, selecteert u Ja in het proces stack? pop-upvenster.
- Selecteer een cel van belang en een streek van belang (ROI) rond met behulp van de werkbalk Tekenen. Voor nucleaire signalen, gebruikt u de ovaal selectie door eerste op het overeenkomstige tabblad op de werkbalk te klikken en vervolgens te klikken op de kern van belang en aanpassing van de ovaal rond het. Gebruik de freehand selectie voor zitten kundig voor volgen de contouren van de cel voor cytoplasmatische signalen of zeer dichte regio's. Vermijd met inbegrip van te grote gebieden van de achtergrond, hoewel het is niet nodig om te volgen de contouren van de cel juist als gevolg van de latere aftrekken van alle achtergrondpixels (stap 4.8-4.9).
- De regio van belang aan de ROI-manager toevoegen door te klikken op analyseren | Tools | ROI manager | Toevoegen, of door op T te drukken op het toetsenbord.
- Het volgende frame gaan door het tabblad in het venster van de stapel te bewegen of door te drukken op shift + < op het toetsenbord, herhaalt u de vorige acties. Volg de cel van belang in de loop van de film en de ROI van elk frame toevoegen aan de manager van de ROI. Opslaan van de laatste ROI voor elke bijgehouden cel instellen door te klikken op meer | Opslaan... in de manager van de ROI.
Opmerking: Na celdelingen, volgen beide dochtercellen afzonderlijk en optellen van hun geïntegreerde intensiteiten na achtergrond aftrekken (Zie stappen 4.6-4.9) ter verantwoording voor eiwit verdunning tijdens de celdeling. Sla de ROI-sets voor beide dochtercellen. - Zodra de cel van belang wordt bijgehouden gedurende de film, klik op de maatregel, met het oog op de waarden voor de gemiddelde intensiteit en het gebied van de ROI. De verkregen waarden in een elektronische spreadsheet-programma kopiëren en de ruwe geïntegreerde intensiteit van de cel voor elk tijdstip als volgt berekenen:
waar bedoelcis de gemiddelde intensiteit engebiedChet gebied van de bijbehorende ROI. - Toevoegen als u wilt schatten de lokale achtergrond, een ROI dicht bij de cel van belang voor elk frame van de tijd. Vermijd met inbegrip van elke cellulaire fluorescentie-signaal. Gebruik een circulaire ROI dat is ongeveer de grootte van een cel en verplaatsen of verschrompelen op dienovereenkomstig indien nodig, bijvoorbeeld als naburige cellen bemoeien. Ga verder zoals eerder beschreven met de cellular ROI ingesteld met het oog op een achtergrond ROI instellen en de van de gemeten intensiteitswaarden naar het werkblad kopiëren.
- Voor het verkrijgen van een achtergrond-gecorrigeerde waarde voor de geïntegreerde intensiteit van de cel, eerst de geïntegreerde intensiteit van de achtergrond voor elk tijdstip te berekenen:
waar bedoel vanBG is de gemiddelde intensiteit van het signaal van de achtergrond en het gebiedC is het gebied van de ROI rondom de cel. Gebruik niet het gebied van de achtergrond ROI, tenzij beide gebieden dezelfde grootte hebben. - Bereken de definitieve achtergrond-afgetrokken geïntegreerde intensiteit van de cel voor elk punt van de tijd:
- Verdeel de intensiteitswaarde van elke tijd-punt door de intensiteitswaarde van de eerste tijd-punt om te normaliseren de eencellige verval curven.
Opmerking: De curve-fitting (zie stap 4.11) kan worden uitgevoerd op elke één cel of op de gemiddelde bevolking. Een normalisatie is vereist als het gemiddelde van een populatie, op basis wordt berekend om te voorkomen dat de vooroordelen van verschillende fluorescentie intensiteiten tussen cellen. De normalisatie zorgt dus voor dat elke cel met hetzelfde gewicht aan de kromme definitief verval bijdraagt. Bovendien, kan de normalisatie zinvol zijn om te visualiseren de eencellige vervalt onafhankelijk van hun absolute fluorescentie intensiteiten (Zie Figuren 3A-3 C). Echter als er slechts het half-leven van eencellige worden bepaald en de gegevens niet is gemiddeld, de normalisatie stap mag achterwege blijven en de curve-fitting kan rechtstreeks worden uitgevoerd op de ruwe gegevens. - Gebruik het hulpmiddel van de montage van een gebogen lijn voor de schatting van de eiwit-halfwaardetijd. In deze studie werd de MATLAB-curve passend werkset 3.4.1 gebruikt, die zich standaard in de Apps sectie van de MATLAB-gebruikersinterface bevindt. Importeren van de intensiteit van de fluorescentie en tijdwaarden uit de elektronische spreadsheet in MATLAB door te klikken op de tab Gegevens importeren de curve passend werkset openen en selecteer de tijdstippen en de fluorescentie decay gegevens in de X gegevens en Y gegevens tab. Kies Aangepaste vergelijking in de curve-fitting tab en geef de vergelijking voor een exponentiële afname:
waar f(t) de intensiteit van de fluorescentie op een bepaald tijdstip is, een de eerste intensiteit en b het verval tarief. In de Opties passen... tab, Selecteer 0 voor de ondergrens van zowel a en b. De geschatte waarden voor a en b wordt vervolgens weergegeven in het resultatenvenster. De halfwaardetijd als volgt berekenen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven protocol biedt een schatting van de variabiliteit van cel naar cel in half-life voor een bepaald eiwit gesmolten aan een module-code. Het gebruik van recombinante E-cadherine-Fc afdekhoes voor de beeldvorming plaat zorgt voor eencellige resolutie in ES-cellen, die anders in kolonies groeien. Afzonderlijke cellen kunnen afzonderlijk worden bijgehouden in de loop van de film ( figuur 1A).
Om te bepalen de halfwaardetijd eiwit voor elke één cel, is het van cruciaal belang voor het meten van het geïntegreerde, achtergrond-afgetrokken module-tag fluorescentie signaal na verloop van tijd ( figuur 1B), met een opsomming van de geïntegreerde intensiteiten van beide dochtercellen in geval van divisies. Dit resulteert in een exponentiële afname kromme voor elke cel, waaruit de verval-tarief, en dus de halfwaardetijd kunnen worden geëxtraheerd door curve passend ( Figuur 1 c). Nog belangrijker is, als een gemiddelde verval kromme wordt berekend, moeten de eencellige sporen worden genormaliseerd naar het eerste frame om ervoor te zorgen dat elke cel hetzelfde gewicht op het gemiddelde, ondanks vermeende verschillen in intensiteit van de fluorescentie van de oorspronkelijke cellen heeft.
De concentratie voldoende kleurstof hangt af van de soort kleurstof en cellijn gebruikt, en dus moet worden geoptimaliseerd voor elk experiment. Om dit te illustreren, toont Figuur 2 de verval-curven van de verschillende concentraties van de far-red fluorescerende coating gebruikt voor alle experimenten die hier is afgebeeld, getest op een doxycycline afleidbare module-tag fusion-cellijn. Een eerste kleurstof concentratie van 3 µM werd gekozen volgens de instructies van de fabrikant en een seriële verdunning van 1:3 werd opgevoerd tot het bereiken van een concentratie van 1,4 nM. Voor de twee hoogste concentraties het signaal neemt niet af, terwijl het waargenomen verval exponentieel voor concentraties beneden 111 is nM. Een optimale concentratie van 12 nM van kleurstof werd gekozen voor verdere experimenten, aangezien er gezorgd minimale hoeveelheid residuele kleurstof links in het medium na het wassen, maar het signaal was nog steeds helder genoeg om te observeren duidelijk verval curven voor een verscheidenheid van doxycycline afleidbare cellijnen.
Cijfers 3A - 3C Toon representatieve resultaten, waaronder de eencellige vervalt en de gemiddelden van de bevolking, voor 3 eiwitten met verschillende gemiddelde halfwaardetijd: de pluripotent verbonden transcriptiefactoren Nanog (gemiddelde half-life 2.9 h) en Oct4 (gemiddelde Half-Life: 4.8 h), en de veel langere woonde pre-mRNA verwerking factor Srsf11 (gemiddelde half-life 25.3 h). De boxplots ( figuur 3D) vertegenwoordigen de helft-leven uit de eencellige verval curven verkregen door curve-fitting en illustreren de heterogeniteit van de helft-leven voor de drie eiwitten.
Figuur 1 : Time-lapse verwerving en analyse
A: aantal representatieve afbeeldingen tonen het verval van fluorescentie in cellen pulse aangeduid met module kleurstof. Cel lijn: doxycycline afleidbare TRE3G-Oct4-SNAPtag, veroorzaakte met 500 ng/mL doxycycline 7 h voor imaging.
B: film analyse en berekening van de geïntegreerde intensiteit. Ikc: geïntegreerd intensiteit van de cel, ikBG: geïntegreerd intensiteit van de achtergrond, ikC-BG: achtergrond-gecorrigeerde geïntegreerd intensiteit.
C: exponentiële curve-fitting uitgevoerd in MATLAB. Voorbeeld van een trace van eencellige verval, de bijbehorende pasvorm en de resulterende ramingen voor de verval-parameters een en b. De halfwaardetijd wordt als volgt berekend: t1/2 = ln (2) / b. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Optimalisatie van de kleurstof concentratie.
Fluorescentie decay voor cellen pulse aangeduid met verschillende concentraties van module kleurstof. Een seriële verdunning van de kleurstof vanaf 3 µM werd uitgevoerd. De sporen zijn gemiddelden van elk, 5 cellen genormaliseerd naar het eerste frame en bijgehouden voor 12 h. cellijn: doxycycline afleidbare TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-PEST, geïnduceerde met 500 ng/mL doxycycline 24u voor imaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Één cel variabiliteit van halfwaardetijd voor verschillende module-gelabeld kandidaat eiwitten.
A-C: Eencellige vervalt (lichtblauw) en bevolking gemiddelden (donkerblauw) voor doxycycline afleidbare Nanog-, Oct4- en Srsf11-module-tag fusion eiwitten.
D: halfwaardetijd van afzonderlijke cellen, die werden berekend door exponentiële curve passend voor elke één cel. De boxplots worden weergegeven in de logschaal2 . De vakken geven de interkwartielafstand (IQR), de zwarte lijn geeft de mediaan. De snorharen vertegenwoordigen de minimale en maximale waarden, met uitzondering van de uitschieters (zwarte puntjes), die worden gedefinieerd als waarden afwijken van meer dan 1,5 x uit de IQR. N = 20 cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest cruciale stap bij het gebruik van een module-tag controleren eiwit verval om ervoor te zorgen is dat geen residuele ongebonden kleurstof niet in het medium of in de cellen na het wassen, anders het zou kunnen binden aan nieuw geproduceerd module-tag moleculen later in de loop van het experiment en ther Eby compromis de verval-curve. Dit is aan de ene kant bereikt door alle beschreven wassen stappen zorgvuldig uitvoert. Aan de andere kant, de kleurstof concentratie moeten zo laag mogelijk te houden, terwijl nog steeds in een bereik die het mogelijk maakt voor het verkrijgen van een goede signaal / ruisverhouding. Zoals blijkt uit Figuur 2, moet de concentratie van de kleurstof voor elk experiment worden geoptimaliseerd door het testen van verschillende verdunningen. In ons geval hebben de doxycycline afleidbare cellijnen relatief hoge expressie niveaus, waardoor een concentratie laag kleurstof gebruiken.
Dit protocol beschrijft een algemene aanpak om de aantasting van het eiwit in afzonderlijke cellen te kwantificeren door time-lapse fluorescentie imaging en diverse aspecten van het protocol kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de experimentele omstandigheden en het doel van de desbetreffende experiment. Eiwit-afbraak volgt meestal een eerste bestelling exponentiële afname. Voor de proteïne is vervalt hier is afgebeeld, de R-2 waarden voor de past waren vrij hoog (0.95-0,99) en het gebruik van multi-matrixcalculus niet aanzienlijk verbeterd de past. Als de verkregen resultaten van enkele exponentiële past niet bevredigend, montage van multi-matrixcalculus kunnen echter beschouwd, die zou impliceren het bestaan van meerdere gelabelde eiwit subpopulaties rottend met verschillende tarieven. Bovendien houdt onze afbeelding analyse pijpleiding aanzienlijke handmatige werk, dat alleen haalbaar is als beperkte aantallen cellen worden geanalyseerd. Voor hogere aantallen cellen, moet een meer geautomatiseerde aanpak worden overwogen. Verschillende geautomatiseerde gereedschappen zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren, waardoor voor het segmenteren en bijhouden van grotere aantallen cellen16,17. Het verkeer tussen de cellen en frequente celdelingen zijn echter uitdagende en onderhevig aan segmentatie fouten veroorzaken. Bovendien wanneer imaging eiwit vervalt, zal de fluorescentie signaal afnemen in de tijd, waardoor de selectie van een drempel voor segmentatie nog moeilijker. Dus, bijhouden van hulpmiddelen moet worden zorgvuldig getest alvorens zij worden toegepast voor dit protocol, zoals segmentatie fouten kunnen de gegevens aanzienlijk verstoren. Bovendien, kan een andere achtergrond aftrekken methode worden overwogen, afhankelijk van de kwaliteit van de verworven beelden. We gebruiken hier FIJI rollende bal correctie, die geschikt is voor gelijkmatig verlichte beelden met nogal dun geplaatste cellen. Vooral als de afbeeldingen last heeft van oneven verlichting, kunnen meer gespecialiseerde achtergrond aftrekken methoden echter toegepaste18,19.
Een beperking van onze benadering is de duur van de time-lapse opnamen dat kan worden geanalyseerd. Voor relatief korte duur eiwitten volstaat een Acquisitietijd van ongeveer 12 h. Voor langduriger eiwitten, zoals bijvoorbeeld Srsf11, is het uitvoeren van een curve passend op een tijdsbereik van 12u mogelijk. Het is echter belangrijk om in gedachten houden dat de exponentiële past misschien wel minder nauwkeurig voor langduriger proteïnen, waarvoor de Acquisitietijd en de beeldvorming intervallen moeten worden verhoogd. Als snelle fietsen cellen zijn image wordt gemaakt, zal langer overname keer bemoeilijken de analyse, als gevolg van het toenemende aantal dochtercellen te analyseren. Nogmaals, in dit geval een meer geautomatiseerde analyse pijpleiding kan zinvol zijn. Bovendien wanneer u module-tag fusion eiwitten om te bepalen eiwit verval tarieven, moet de mogelijkheid van de module-tag wijzigen de halveringstijd van de endogene eiwit worden beschouwd. In het geval van de cellijnen gebruikt hier zie we geen bewijsmateriaal voor dergelijke effecten, als het vastberaden half-leven van Oct4 en Nanog aansluiten op gepubliceerde waarden3,20,21,22. Verder uit te sluiten een effect van de module-tag op eiwit-afbraak, vooral wanneer geen gegevens over de halfwaardetijd beschikbaar is, zou één optie blokkeren eiwitsynthese door cycloheximide en uit te voeren westelijke vlekken op verschillende tijdstippen met behulp van een antilichaam herkennen van de endogene proteïne en direct vergelijken het verval van het module-gelabeld kandidaat-eiwit met de niet-gecodeerde endogene versie.
Meest eerder gepubliceerde gegevens op eiwit half-life is gebaseerd op bulk biochemische experimenten, voornamelijk tijdsverloop westelijke vlek experimenten op remming van de eiwitsynthese door cycloheximide. Echter deze benadering biedt geen enkele cel resolutie en de temporele resolutie is laag vanwege het beperkte aantal tijd-punten waarmee rekening kan worden gehouden. In tegenstelling, onze eencellige aanpak vereist niet het gebruik van proteïne synthese remmers en cel-naar-cel variabiliteit in eiwit afbraak tarieven kan identificeren. Het staat ook voor het identificeren van potentiële subpopulaties van cellen met verschillende helft-leven, die misschien wel met name interessant voor het onderzoek van ongelijkmatig uitgedrukte proteïnen. Een ander voordeel van onze methode is de mogelijkheid om in silico synchroniseren van de cellen en dus monitor voorbijgaande wijzigingen in halfwaardetijd, bijvoorbeeld gedurende de levenscyclus van de cel. De module-tag technologie vereist echter de generatie van een bijbehorende module-gelabelde cellijn, die misschien wel zijn belangrijkste nadeel. Nog belangrijker is, kan onze aanpak ook worden toegepast op endogeen tagged eiwitten9. Zoals hierboven vermeld dat niet respecteren we enig bewijs van de module-tag wijzigen de halfwaardetijd van de endogene eiwit voor de eiwitten die we hebben bestudeerd, suggereert dat de nauwkeurigheid van de benadering van de module-tag in hetzelfde bereik als andere methoden is.
De methode die hier gepresenteerd zal zitten nuttig voor diverse toepassingen. Belangrijker, biedt het de mogelijkheid te bestuderen van cel naar cel variabiliteit in half-leven voor een fusieproteïne module-tag van belang. Er zijn verschillende andere labels beschikbaar (zoals de CLIP-tag23 of de Halo-tag24) waarvan werkingsprincipe is hetzelfde. Pulse labeling en wassen van de resterende kleurstof zal leiden tot een verval-curve, die het mogelijk maakt voor de bepaling van eiwit half-life, terwijl het verlaten van de kleurstof in het medium (in het geval van een ligand thats niet-belichting fluorescerende tenzij gebonden aan de tag) kunnen op lange termijn beeldvorming van een eiwit van belang. Als gevolg van de grote selectie van beschikbare fluorescerende liganden, kan de module-tag dus worden gecombineerd met andere codes of met meerdere andere fluorescently geëtiketteerde molecules, waardoor voor de toepassing van de techniek in verschillende contexten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Time-lapse microscopie experimenten werden uitgevoerd op de Biomoleculaire Screening faciliteit (BSF), EPFL. Wij danken Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) voor de videografie en het bewerken van de film.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | - | - | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | - | - | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | - | |
| Microsoft Excel | Microsoft | - |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al.
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
