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방법 논문

관찰 및 깜박이 표면 강화 된 라만 산란의 분석

7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56729

⸱

2018년 1월 11일

1Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

이 논문에서

요약

표면 강화 라만 점멸의 분석이이 프로토콜에 설명 합니다 전원 법을 사용 하 여 실버 표면에 단일 분자의 랜덤 워크 인 비 산.

초록

nanoaggregate 접속점에 단일 분자에서 관찰 표면 강화 된 라만 산란 (SERS) 점멸 합니다. 여기, 프로토콜 관련 활동을 준비 하는 방법에 선물 된다 nanoaggregate 실버, 미세한 이미지에서 특정 깜박이 명소의 비디오를 기록 하 고 깜박이 통계 분석. 이 분석에서 전원 법률 그들의 지속 시간에 상대적인 밝은 이벤트에 대 한 확률 분포를 재현합니다. 어두운 이벤트에 대 한 확률 분포는 지 수 함수 전원 법으로 적합 하다. 전원 법의 매개 변수는 모두 밝고 어두운 상태에서 분자 동작을 나타냅니다. 랜덤 워크 모델 및 전체 실버 표면에서 분자의 속도 추정 될 수 있습니다. 평균, 자기 상관 함수 및 슈퍼 해상도 관련 이미지를 사용 하는 경우에 추정 하는 것이 어렵습니다. 점멸의 기원만이 분석 방법에 의해 확인할 수 없습니다 때문에 미래에 전원 법 분석 스펙트럼 이미징, 함께 결합 되어야 합니다.

서론

표면 강화 라만 산란 (SERS) 고귀한 금속 표면에서 고감도 라만 분광학 이다. 금속 표면에 단일 분자의 정보를 조사 수 이후 기능적인 그룹 분자에서 진동 모드를 통해 날카로운 피크 위치에 따라 분자 구조에 대 한 자세한 정보를 제공 하는 라만 스펙트럼 관련1,2,3을 사용 하 여. 단일 분자 수준에서 흡착과 실버 nanoaggregate에서 깜박이 신호 관찰1,2,3,,45,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16, 그리고 스펙트럼 변동1,2,3,,45,6,7,8, 9,10,11,12,,1314. 깜박임 무작위로 나노미터 크기의 nanoaggregate 접속점에 향상 된 전자기 (EM) 필드 밖으로 이동 하는 단일 분자에 의해 유도 될 수 있다. 따라서, 점멸 SERS 농도 및 bi 분석2,,317의 포아송 분포를 사용 하는 기술에 비해 단일 분자 검출에 대 한 간단한 증거를 간주 됩니다. 그러나, 강하게 Ag 표면에 분자 행동에 달려 있습니다, 깜박이 변동 스펙트럼의 상세한 메커니즘은 아직도 논란이 있습니다.

이전 학문에서는, 점멸 관련 분석 된 고 확산 계수는 향상 된 EM 필드12,13,14 밖으로 이동 하는 분자의 농도 계산할 수 있습니다 자기 상관 함수를 사용 하 여 . 또한, 불안정 총 강도 나타내는 정규화 된 표준 편차 점수는 신호15시간 프로필에서 파생 되었습니다. 그러나, 이러한 분석 방법 몇 가지 분자의 동작에 따라 수 있습니다. 반면, 깜박이 SER의 슈퍼 고해상도 이미징, 향상 된 EM 필드에 단일 분자 동작 확인 된16될 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 향상 된 EM 필드에만 이러한 매개 변수를 얻을 수 있습니다. (예를 들어, 깜박이 SERS)에서 넓은 범위 내 단일 분자의 임의의 동작 전원 법 보다는 평균4,,56,7,8로 대표 될 수 있다 ,,910,11, 단일 반도체 양자 점 (QD)18,19의 점멸 형광 비슷합니다. 전원 법 분석4,5,6,7,,89,10,11, 분자 동작을 사용 하 여 (향상 된 EM 필드)에 밝은 상태와 어두운 상태10;에서 예상할 수 있는 즉, 전체 실버 표면 분자의 행동은 추정 될 수 있습니다.

이 기술에 대 한 실버 콜 로이드 nanoaggregates는 사용된4,5,6,7,,89,,1011. 이러한 nanoaggregates 그들은 특정 한 파장에 흥분 하는 때 강력 하 게 향상 된 전자기 필드를 영향을 미칠 다양 한 지역화 된 표면 플라스몬 공명 (LSPR) 밴드를 표시 합니다. 따라서, 관련 액티브 실버 나노 콜 로이드 서 스 펜 션, 그리고 일부 데이터에 존재 하는 즉시 얻을 수 있습니다. 특정 크기, 모양, 그리고 준비는 간단한 nanostructures의 경우 SER 점멸의 LSPR 의존 다른 의존7;을 숨길 수 있는 즉, LSPR에 좋은 소식이 나 나쁜 nanostructure 사용 하는 경우 매개 변수 상수, 되며 다른 의존 따라서 숨겨져 있을 것 이다. 전원 법 분석 실버 콜 로이드 nanoaggregates4,,56,7,8, 에서 깜박이 관련의 다양 한 종속성을 발견 하는 데 사용 되었습니다. 9 , 10 , 11.

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프로토콜

1. 샘플 준비

  1. 실버 콜 로이드 나노 입자의 준비 20
    1. 조작 실버 콜 로이드 나노 입자, 실버 질산염의 그리고 150 mL 200 mL 둥근 바닥 플라스 크에 물이 수화물 trisodium 시트르산의 0.030 g 0.030 g을 분해.
    2. 플라스 크를 결합 하 여 환류 (Dimroth) 콘덴서와 함께.
    3. 마그네틱 교 반기 및 저 어 바와 플라스 크에 솔루션을 저 어. 그런 다음 60 분 동안 150 ° C에 기름 목욕에서 플라스 크에서 감동적인 솔루션 열.
      참고: 솔루션은 노란색, 다음은 하 회색을 돌 것 이다.
    4. 서 스 펜 션, 실내 온도에 냉각 하 고 냉장고에 알루미늄 호 일로 덮여 플라스 크에 정지를 유지.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지이 시점에서. 콜 로이드 나노 입자를 사용 하 여 1 개월 이내는 냉장고에 저장 후.
  2. 다중 색에 대 한 샘플의 준비 점멸 방출 11
    1. 현미경 슬라이드를 준비, 유리 접시 비누를 손으로 세척 하 고 물으로 씻어.
    2. 유리 접시에 0.1% 폴 리-L-리 신 수성 솔루션을 추가 하 고 솔루션을 제거 하는 송풍기와.
    3. 유리 접시에 실버 콜 로이드 현 탁 액을 추가 하 고 송풍기와 현 탁 액을 제거.
    4. 액체 차단 펜으로 유리 접시에 드롭 영역을 묶습니다.
    5. 유리 접시에 증류수를 삭제 하 고 다른 유리 접시 현미경 슬라이드를 만들고 증발에서 물을 방지 하기를 다룹니다.
  3. 단조로운 색된 점멸 관련에 대 한 샘플의 준비 7 , 8 , 9 , 10
    1. 현미경 슬라이드를 준비, 유리 접시 비누를 손으로 세척 하 고 물으로 씻어.
    2. Thiacyanine 또는 thiacarbocyanine 염료와 실버 콜 로이드 현 탁 액을 혼합 (25 또는 4 µ M, 각각)와 2의 볼륨 비율로 NaCl (10mm) 용액: 1:1.
    3. 유리 접시에 샘플 중지를 삭제 하 고 송풍기와 현 탁 액을 제거.
    4. 액체 차단 펜으로 유리 접시에 드롭 영역을 묶습니다.
    5. 나노 입자를 고정을 유리 접시에 NaCl (1 M)의 수성 해결책을 삭제 하 고 다른 유리 접시 현미경 슬라이드 플레이트를 만들고 솔루션에서 증발 방지를 커버.

2입니다. 점멸은 나노 입자의 관찰

  1. 샘플의 조명
    1. 1.2 또는 1.3 프로토콜을 사용 하 여 거꾸로 현미경의 스테이지 준비 샘플 유리 접시를 놓습니다.
    2. 목표 렌즈 (60 X)를 사용 하 여 유리 접시에 다양 한 색된 반점 (, 녹색, 노란색, 파란색과 빨간색)에 어두운 필드 콘덴서와 통해 하얀 빛을 사용 하 여 샘플 유리 접시 켜.
    3. 밝게 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도 다이오드 펌프 고체 (DPSS) 연속파 (cw) 레이저 간섭 필터를 통해 전달 감쇠 광속을 사용 하 여 샘플 유리 접시.
    4. 사용 하 여 레이저 조명 같은 색 주변에 단조로운 색된 반점으로 실버 nanoaggregates 관찰, 보기의 센터에 레이저 조명 영역을 이동 하 고 z-방향으로 단계를 조정 하 여 유리 접시에 반점에 초점.
  2. 점멸의 관찰
    1. 목표 렌즈 후 긴-패스 필터를 삽입 하 고 간섭 필터를 통해 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도에서 전달 DPSS cw 레이저 광선을 사용 하 여 샘플 유리 접시를 조명.
    2. 그림 1 에서 보듯이 명소 점멸 찾기 (참고 그림 S1 보충 자료에서) 무대에는 x-및 y-방향으로 이동 하 여.
    3. 거꾸로 현미경, 냉각된 디지털 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라, 61-120 ms의 시간 분해능이 20 분에 대 한 결합으로 깜박이 명소의 기록 영상.

3입니다. 깜박이 SER의 분석

  1. 비디오에서 시간 프로필의 유래
    1. CCD 카메라를 제어 하는 소프트웨어에서 비디오 파일을 엽니다.
    2. 깜박이 관광 명소 및 어두운 영역을 선택 하려면 별도로 지역 명소 비디오 이미지 없이 커버 하는 영역을 드래그 합니다.
    3. 깜박이 관광 명소와 비디오에서 어두운 영역에서 신호 강도 시간 프로필 파생, 분석, 임시 분석 을 선택 하 고 임시 분석 창에서 계산 을 클릭 합니다.
    4. 텍스트 파일로 데이터를 저장.
  2. 시간 프로 파일의 분석
    1. 어두운 영역 또는 그림 2A 와 2B와 같이 다항식 함수과 시간 프로필을 빼서 시간 프로필의 기준선을 평평.
    2. 약 2000 포인트, 난기본, 그리고 초기 농도의 표준 편차 σ, 그림 2C 및 2D에서 같이 구성 된 평균된 초기 강도 평가 합니다.
    3. 내가기본 + 3σ의 임계값 보다 큰 농도 사용 하 여 어두운 이벤트에서 밝은 이벤트를 구별 하 고 각 이벤트의 기간을 기록 합니다. 그림 3에서 예를 들어 0에서 3.5476 이벤트 기록 어두운 이벤트로 s ( t 기간 = 3.5476 s), 4.0981 3.5476에서 이벤트를 기록 하 고 밝은 이벤트로 s (기간 t = 0.5505 s). 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 반복 합니다.
    4. 표 2의 첫 번째 및 두 번째 라인에 표현 각 기간에 대 한 밝고 어두운 이벤트 수를 계산.
    5. 이벤트 기간 t보다 짧은 제외한 각 기간에 대 한 이벤트 수를 합계 하십시오. 표 2의 두 번째 및 세 번째 라인에 표현, 예를 들어 각 기간에 대 한 이벤트 수를 합계 ( t 에 대 한 이벤트를 제외 하 고 0.0612 = s) 41 + 18 + 9 +...; 결과 t 에 대 한 합계 = 0.1223 s, 즉, 103.
    6. 각 기간별로 합계를 분할 하 고 그들을 정상화. 표 2에 표현, 예를 들면, 기간 t 에 대 한 변론 분할 0.0612 = s 기간 0.0612 s. 결과 3,351.5791입니다. 그런 다음 표 2에 네 번째 줄에서 결과의 총 결과 나눕니다. 확률 분포는 0.64494 것 파생 됩니다.
    7. 밝은 이벤트 P(t)에 대 한 그들의 기간 t 로그-로그 그래프에 대 한 확률 분포를 플롯 및 로그10P에(t) 로그10에 의해 (figure-protocol-1)는 전원 법 지 수 α에에 깜박이 자리 특정 추론할. P에(t)는으로 장착 하는 경우 figure-protocol-2 , 그림 4A에 점선으로 표시 된 것 처럼 장착된 라인 P(t)의 값이 작은 플롯에서 일탈.
    8. 어두운 이벤트 P오프(t) 로그-로그 그래프에 그들의 시간 t 에 대 한 확률 분포를 플롯 및 로그10(로그10P오프(t) 맞는 figure-protocol-3 는 전원 법 지 수 α오프 와는 잘림 시간 τ 동일한 점멸에서 자리를 추론할. P오프(t)는으로 장착 하는 경우 figure-protocol-4 , 맞춤된 곡선 P오프(t)의 값이 작은 플롯에서 성적이 상자.
    9. 3.2.1 3.2.8 비디오에서 다른 깜박이 관광 명소에 대 한 반복 합니다.

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결과

그림 111에서 같이 폴 리-L-리 신 1.2 프로토콜에 의해 준비와 함께 실버 nanoaggregates에서 관련 및 표면 강화 된 형광 색된 점멸 명소 관찰 된다. 반면에, SERS에서 단조로운 색된 점멸 명소 프로토콜 1.37,8,,910에 의해 준비 된 염료 분자와 실버 nanoaggregates에 대 한 관찰 되었다. "부정적인" 결과의 두 가지 유형이 있다: 지속적인 결과, 또는 아무 관련은 관찰 결과. 전 고 후자의 결과 각각 콜 로이드 실버 표면에 분자의 높은 또는 낮은 농도 의해 발생할 수 있습니다.

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토론

실버 nanoaggregate 접합에서 SER는 발생 합니다. 따라서, 우리는 시트르산 음이온으로 덮여 있다 콜 로이드 나노 입자, 보다는 오히려 nanoaggregates를 준비 해야 합니다. 실버 집계 효과 폴 리-L-리 신,-NH3+ 이며는 SER의 기원의 추가 의해 만들어진 소금에서 형성 된다 또는 NaCl, 보충 자료의 그림 s 2 와 같이에서 Na+ 양이온. 또한, 넓은 지역에 많은 관광 명소를 밝히는, 산만된 레이저 빔 현미경에 부착 되지 않은 렌즈를 통해 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도에서 전달 된다. 관측 영역 조명 하지 가능성이 있다. 우리는 조정 하 고 높은 확대와 함께 관찰 영역을 밝게 하려면 레이저 영역 이동. 이 최적화 후 단조로운 색된 반점 같은 색 주변에서 볼 수 있습니다. 이들은 관련 관찰을 깜박이 위한 중요 한 단계입니다.

여기, 전력 법 분석에 대 한...

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공개 사항

저자는 공개 상관이 있다.

감사의 글

저자는이 작품의 그들의 유익한 토론에 대 한 교수부터 Y. 오자키 (간사이 학원 대학) 및 박사 T. 이토 (국립 연구소의 첨단 산업 과학 및 기술)을 감사합니다. 이 작품의 교육부, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (No. 16 K 05671)에서 KAKENHI (선진적인 과학 연구 c)에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
질산은, 99.8%Wako194-00832
구연산 삼나트륨 이수화물, 99.%Wako191-01785
폴리-L-라이신 수용액, 0.1%Sigma-AldrichP8920
3,3'-디술포프로필티아시아닌 트리에틸아민Hayashibara Biochemical LaboratoriesNK-2703티아시아닌 염료
의 일종3,3'-디에틸-5,5'-디클로로-9-메틸티아카르보시아닌 요오드염하야시바라 생화학 연구소SMP-9티아카로보시아닌 염료의 일종
염화나트륨, 99.5%Wako191-01665
Dimroth 콘덴서이와키61-9722-22AS ONE
마그네틱 교반기CorningDC-420D
오일 배스어드밴텍OS-220
유리판MatsunamiS-1112현미경 슬라이드
송풍기HozanZ-288에어 더스터
리퀴드 블로커 펜Daido SangyoLIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). 면역조직화학 응용을 위해 설계된 즉시 사용 가능한 소수성 장벽 펜
반전 현미경OlympusIX-70
대물 렌즈OlympusLCPlanFl 60×북미 0.7
암시야 콘덴서OlympusU-DCDNA 0.8– 0.92
냉각 디지털 CCD 카메라HamamatsuORCA-AG소프트웨어로 제어
냉각 디지털 CCD 카메라HamamatsuAquaCosmos비디오의 깜박이는 지점에서 시간 프로필을 유도하는 데에도 사용됩니다.
컬러 CCD 카메라ELMOTNC-C920분석에 사용되지 않음
DPSS 레이저RGB 레이저 시스템NovaPro532-75λ = 532 nm;
60 mW (600 W/cm2의 전력 밀도에 해당)
간섭 필터SemrockLL01-532-12.5
롱 패스 필터SemrockBLP01-532R-25
밝기/어두운 이벤트의 구별 및 계산을 위한 소프트웨어C++에 의해 프로그래밍홈 메이드
멱법칙에 의한 피팅을 위한 소프트웨어LightStoneOrigin6.1
되는 소프트웨어는 된

참고문헌

  1. Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
  2. Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
  3. Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
  4. Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
  5. Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
  6. Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).
  7. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
  8. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
  9. Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
  10. Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
  11. Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
  12. Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
  13. Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
  14. Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
  15. Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).
  16. Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
  17. Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
  18. Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
  19. Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).
  20. Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
  21. Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
  22. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).

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