Summary
Vi beskriver den optisk avbildning av möss som infekterats med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) använder reporter enzym fluorescens (REF). Detta protokoll underlättar det känsligt och specifikt påvisande av M. tuberculosis i prekliniska djurmodeller för patogenes, therapeutics och vaccin forskning.
Abstract
Reporter enzym fluorescens (REF) använder tredjeparts substrat som är specifika för enzymer som förekommer i målorganismer av intresse för imaging eller detektering av fluorescens eller Mareld. Vi använder BlaC, ett enzym som konstitutivt framfört alla M. tuberculosis stammar. REF tillåter snabb kvantifiering av bakterier i lungorna av infekterade möss. Samma grupp av möss kan avbildas på många punkter, kraftigt minska kostnaderna, enumerating bakterier snabbare, så att nya observationer i värd-patogen interaktioner och ökande statistiska makt, eftersom fler djur per grupp lätt underhålls . REF är extremt känsligt katalytisk pågrund av BlaC enzymatisk reportern och specifikt på grund av de anpassade våglängdsområde resonans energiöverföringen (bandet) eller fluorogenic-substrat som används. REF kräver inte rekombinant stammar, att säkerställa normal värd-patogen interaktioner. Vi beskriver avbildning av M. tuberkulos infektion med bandet substrat med maximal utsläpp vid 800 nm. Våglängden av substratet kan känsliga djup vävnad imaging i däggdjur. Vi kommer att beskriva aerosol infektion i möss med M. tuberculosis, anestesi av möss, administration av REF substrat och optisk imaging. Denna metod har tillämpats framgångsrikt utvärderade värd-patogen interaktioner och effekt av antibiotika inriktning M. tuberkulos.
Introduction
Den långsamma tillväxten M. tuberkulos är en stor vägspärr i snabb diagnos av tuberkulos1,2,3. Medan kultur baserad diagnos tar veckor att producera resultat, har syrafasta utstryk diagnostiska begränsningar4 barn5 och patienter Co-infekterade med humant immunbristvirus6,7. Optisk imaging teknik har nyligen erkänts som ett alternativ till traditionella diagnostiska metoder för tuberkulos8,9. Fluorescens och Mareld kan användas till optiskt bild M. tuberkulos hos levande djur i realtid10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Optisk imaging har fördelen av en snabb och specifik bedömning av en infektion med M. tuberculosis20,21,22.
Vi beskriva Detaljer för optisk imaging M. tuberkulos i levande möss använder REF. Denna metod är mycket specifika och känsliga23,24 och liknar andra optiska metoder, är mindre dyra än andra metoder för tuberkulos (tbc) imaging25, inklusive datortomografi (CT)26, magnetiska resonance imaging (MRI)27, och F-fluorodeoxyglucose positronemissionstomografi/CT (F-FDG PET/CT)28. REF använder tredjeparts anpassade fluorescerande eller självlysande substrat som vid klyvning av en bakteriell enzym, producerar en fluorescerande produkt8,29. Därför har det fördelen av att inte kräva en rekombinant mykobakteriella reporter stam30,31. FRET substratet beskrivs består av en fluorokrom och en törstsläckare som förbinds med en β-laktam-ring som hydrolyseras av BlaC (β-laktamas), naturligt konstitutivt uttryckta av tuberkulos-komplex Mycobacterium8, 32. bakterierna direkt generera signal på grund av REF katalytisk aktivitet som gör att förstärkning av många storleksordningar och känslig detektion av M. tuberkulos.
Det REF substrat som används i denna studie har utmärkt vävnad penetration i levande djur och minskat bakgrund på grund av dess långa våglängd. Med detta lång våglängd substrat är det möjligt att uppnå ett tröskelvärde för upptäckt för M. tuberculosis nästan 100 kolonibildande enheter (CFU) i vitro och < 1000 CFU i lungorna av möss i vivo (hela djur)8, 33. REF kan användas som ett diagnostiskt verktyg för sputum, kliniskt material och även direkt hos patienter med micro endoskopisk system16,32,33,34 på grund av dess höga känslighet och specificitet. REF kan tillämpas på någon tuberkulos kliniska stam, eftersom den använder ett naturligt producerat bakteriell enzym, BlaC, för detektering i alla stammar. Dessa egenskaper gör REF imaging ett värdefullt verktyg i prekliniska tuberkulos forskning i allmänhet för att underlätta terapeutiska samt vaccin utvärdering och analys av patogenes, men också i slutändan får tillämpas på diagnos i tuberkulos patienter.
Protocol
Djurstudier har utförts enligt de riktlinjer som anges av den institutionella djur vård och användning kommittén av Texas A & M University. Granskning och godkännande från en biohazard föreståndaren eller kommittén vid din institution kan krävas.
Varning: Alla förfaranden kräver BSL3 inneslutning. Personalen är skyldiga att personliga skyddsutrustning vid alla tidpunkter. Alla manipulationer utförs inuti biosäkerhet skåp (BSC) och vassa instrument kasseras på sharps containers. Arbete ytor och BSC städas med buffrad fenol och 70% etanol innan arbete och efter jobbet. Förfaranden skulle normalt göras på biosäkerhet nivå 3 med Mycobacterium tuberculosis, men för illustration och filmning ändamål, författarna visar dessa förfaranden på biosäkerhet nivå 2 med mindre virulenta bakterier.
1. stammar och kultur villkor
Obs: M. tuberculosis stam CDC1551 används i denna studie, men någon M. tuberculosis stam kan användas på samma sätt.
- Växer bakterier i M-OADC-TW (7H 9 buljong kompletteras med 0,5% glycerol, 10% oljesyra dextros komplexa utan katalas och 0,05% Tween-80) medelstor stående vid 37 ° C till en OD600 0,5 (~ 0,2 x 107 CFU).
- Späd kulturen i M-OADC-TW (rad 1:10 utspädningar av bakterier). Platta till utspädningarna av bakterier (105, 106107, 108) i tre exemplar på selektiv 7 H 11 plattor att möjliggöra bestämning av CFU.
- Inkubera plattorna i fyra veckor vid 37 ° C eller tills kolonier kan räknas noggrant.
- Centrifugera det bakteriella inokulatet vid 8,534 x g i 5 min att få en pellet. Tvätta pelleten en gång med 10 mL koksaltlösning (0,9% NaCl) och resuspendera pelleten i 15 mL koksaltlösning (0,9% NaCl).
2. aerosol infektion i möss med en Madison kammare
- Tillåta möss anpassa sig till den nya omgivningen i en vecka.
- Väga mössen innan du laddar dem i kammaren.
- Anslut tre sladdar till grenuttag: huvudsakliga kammaren kraften, vakuumpump och Luftkompressor, i den ordningen.
- Skruva försiktigt glasburken. Glasburken på biosäkerhet skåp och tillsätt den utmaning inokulum upphängd i 15 mL koksaltlösning (0,9% NaCl) att uppnå ~ 104 - 106 CFU av bakterier i lungorna.
- Stäng locket på glasburken i biosäkerhet skåp. Fäst burken till nebulisatorn enheten och justera vertikala rostfria röret så att den nedre änden (intag) är ungefär en fjärdedel av en tum under nivån för vätskan i burken.
- Ladda alla djur behövs för experimentet (salen rymmer upp till 90 möss) in i kammaren och Stäng alla spärrarna på dörren.
- Kontrollera viktigaste (rum) luft flödesmätare. Se till att mitten av flottören (boll) kör ca 50 L/min mätt på skalan till vänster.
- Tryck på Start-knappen på Kontrollpanelen på avdelningen. Ange luftflöde genom kompressorn luft flödesmätaren (mindre mätaren till vänster) som 4 L/min på skalan. Kontrollera visuellt att det utmaning inokulatet är att vara nebulized.
- Efter 15 min, när den röda lampan på framsidan av kontrollpanelen visas och en ljudsignal anger slutet av körningen, tryck på Reset-knappen på det nedre högra hörnet av Kontrollpanelen för att nollställa tidmätarna.
- Håll ned den lilla röda knappen på dörren till kammaren till frigör vakuumet.
- Öppna dörren kammaren och ta bort djuren. Placera mössen tillbaka i sina burar.
- Ta bort nebulisatorn glasburken och placera i en förseglad och läckagefri transport container. Placera behållaren inuti skåpet biosäkerhet och kassera utmaning suspensionen i en utsedda avfallsbehållare.
- Placera burken används nebulisatorn inuti en biohazard påse och förslut påsen för transport till autoklav.
- I slutet av förfarandet infektion, spraya insidan av kammaren med buffrad fenol och 70% etanol och låt kammaren att sitta i 10 min.
- Torka sedan ner alla tillgängliga invändiga ytor mycket noggrant. Bortskaffa alla förorenade pappershanddukar, etc. i biohazard papperskorgen. Autoklav papperskorgen, avfallsbehållare och används nebulisatorn burkar.
- Placera djuren tillbaka i inneslutning rummet tills den imaging tid-punkten.
- På dagen för imaging, överföra djuren i en sekundär behållare imaging rummet.
3. djur anestesi
- Söva möss med isofluran använder en anpassad gassystemet anestesi.
- Väga in var och en av två kolfilter kapseln ligger på toppen av anestesi-enheten.
- Ersätta med en ny behållare om vikten är 50 g ovanför den ursprungliga vikten.
- Kontrollera enhetens spridare för att säkerställa tillräcklig isofluran för förfarandet.
- Placera hållaren näskotten inuti imaging kammaren. Lägg antal nose kottar krävs för förfarandet och försegla de återstående öppningarna med näsan konen blockers.
- Slå på syretillförseln från högtrycks cylindern och ställa in den på 55 psi.
- Slå på evakuering pumpen ligger framför anestesi enheten och ange det till 8 L/min.
- Slå på syre växlingsknappen ligger framför enheten anestesi.
- Slå på gasflödet till anestesi induktion kammaren att kvitta flödet av gas på 1,5 L/min. Vänd gasflödet.
- Slå på gasflödet till imaging kammaren att kvitta flödet av gas på 0,25 L/min. Vänd gasflödet.
- Slå på den isofluran spridare och ställa in den på 2-2,5%. Justera isofluran beroende på antal och vikt av djur som används för experimentet genom att vrida ratten på den isofluran spridare (2-2,5% för en mus väger ~ 20 g; 4% för ett marsvin som väger 300 g).
- Placera möss i anestesi kammaren och Stäng locket. Slå på gasflödet till anestesi induktion kammaren.
- Lämna mössen i anestesi induktion kammaren för 5-10 min tills helt sövd.
- När mössen är sövda, tillämpa en optisk salva till ögonen för att skydda dem medan imaging.
- Placera möss i ventrala eller sternala koordinationsrubbning så att deras näsor är placerade i näsan konen att underlätta anestesi av möss under förfarandet för bildbehandling.
4. reporter enzym fluorescens (REF) imaging
- Injicera substratet (20 µM, 2,5 µL/g vikt) av intraperitoneal injektion i den infekterade samt kontroll möss. Mössen är under narkos inne i imaging kammaren för mindre än 1 min.
- Starta bildsystem.
- Initialisera systemet genom att klicka på initiera. Vänta tills temperaturen baren blir grön.
Obs: Imaging kammaren består av en uppvärmd plattform att upprätthålla kroppstemperaturen hos djuret medan imaging. - För imaging förvärv inställning, Välj lysrör | Trans-belysning för hela djuret eller Epi-belysning för lungvävnad, struktur och överlägg i förvärvet Kontrollpanelen.
- Ställa in synfält till B för enkel mus och lampa nivå till hög.
- Ställa in exponeringstiden till auto, medellång binning, 2-3 för f/stopp och excitationsfilter på 745 nm och utsläpp filter från 780 nm till 840 nm.
- För sekvens inställningar, klicka på sekvens inställningar, markerar 9-12 Trans-belysning i lungan området.
- Klicka på skaffa för bild förvärv.
- Placera musen tillbaka i buren efter bildtagning.
- Övervaka möss tills helt återställd eller offra för att kvantifiera CFU om imaging vid en tidpunkt av experimentet. Utföra en modifierad Karnofsky Poäng för att övervaka välbefinnandet hos möss efter imaging.
5. analys av REF imaging
- Öppna avbildningsprogrammet.
- Ladda bildfiler genom att klicka på bläddringsikonen.
- För spektral minoriteter, på spektral Unmixing i verktygspaletten och klicka på de spectra som krävs för att unmix. Klicka på start minoriteter.
- För optisk yta återuppbyggnad, klicka på ytan topografi.
- Välj orientering till dorsala, omfattas av päls mus och klicka på generera yta.
- Rita Beskär bild och ange tröskelvärde bild för en region av intresse. Klicka på klar.
- För orgel registrering, gå till fliken registrering i 3D optiska verktyg dropdown-menyn.
- Registrera organ av intresse i en orgel atlas.
- Justera orgel storlek eller läge till genererade ytan topografin med hjälp av omformningsverktyget / på ligger på panelen-registrering verktyg.
- Gå till fluorescerande tomografi (FLIT) 3D rekonstruktion och välj analysera tab. Välj bilder som ska ingå för analys, bild typ till normaliserade överföring fluorescens (NTF) effektivitet, klicka på Start.
- Kolla på Markera alla och rekonstruera Dataförhandsgranskning på fliken.
- För fluorescens kvantifiering, gå till regionen av intresse (ROI) verktyg, lägga till ROI kuben i organ av intresse och justera kuben storlek för att täcka organ av intresse. Klicka på Mät 3D ROIs.
- I fönstret ROI mätningar, gå till 3D ROI-mått, Välj datatyp till voxlar och mätningar källenheten till pmolM-1cm-1.
- Spara eller exportera resultatet av FLIT 3D rekonstruktion analys i en figur eller data fil.
6. kvantifiering av bakterier av CFU
- Euthanize möss av intraperitoneal injektion 0,1 mL pentobarbital natrium (390 mg/mL).
- Kontrollera för pedal reflex genom att klämma kuddar av fötterna på möss till att det finns ingen reflex reaktion.
- Explant lungvävnad från mössen med steril pincett och sax. Homogenisera lungvävnad i 1 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Gör 10-faldig seriespädningar av lung Homogenatet i sterila 1 x PBS.
- För plätering, plats tre portioner av 20 µL varje respektive utspädning på en agarplatta.
- Inkubera plattorna i en inkubator vid 37 ° C och monitor för bakterietillväxt.
- Räkna kolonierna i varje plats efter inkubationstiden och express som CFU / mL genom att korrigera för volym och utspädning med hjälp av följande ekvation:
CFU / mL = (C/V) x M
Där C = kolonin räknas per plats, V = volym av provet inokuleras på varje tallrik (mL) och M = multiplikationsfaktor (ömsesidiga av utspädningsfaktorn används).
Obs: Om 11 kolonier räknas på ett ställe för en provvolymen 0,002 ml på en provspädning av 10-4, med hjälp av ekvation, koloni räkningen kommer att räknas som
(11/0,02) x 104 = 5,5 x 106 CFU / mL
Representative Results
REF avbildning av möss som infekterats med M. tuberculosis tillsammans med oinfekterade kontroll musen visas i figur 1A. De infekterade möss produceras en signifikant (P = 0,0057) högre fluorescens signal från lungorna på 6 veckor efter infektion jämfört med kontrollgruppen vid administrering av substrat. En typisk tid kurs att studera den terapeutiska effekten mot M. tuberculosis använda REF kunde tänkbar vecka 1, 2, 4, 6, 15, 24 efter infektion. Fluorescensintensiteten kvantifieras med epi-belysning för lungvävnad (figur 1B). Konsekvent ökande signalen från vecka 2 till vecka 6 i lungorna av infekterade möss antyder att REF är framgångsrikt kan upptäcka M. tuberculosis in vivo. En droppe i bakgrunden signalen kontroll möss vid en senare tidpunkt (figur 1B) kunde tillskrivas ökningen i kroppen massa och volym av möss under en 6 veckorsperiod därigenom minska magnetiseringen våglängd penetration. 3D FLIT rekonstruktion av fluorescens källor i möss som infekterats med M. tuberculosis är representerade i figur 2A. Bildsekvenser förvärvas vid flera trans-belysning punkter i mus med samma excitation och serien av utsläpp filter. Dessa bildsekvenser används sedan för 3D FLIT återuppbyggnad för fluorescerande distributionen inom djur ämnet. Figur 2 A-D visar de olika riktningarna (koronala, sagittal och transaxial) av mus tomografi med lung orgel registrering. NTF effektivitet kartor för att kontrollera återuppbyggnad kvaliteten är representerade i figur 2E. NTF kan subtrahera bakgrunden ljus läckaget från trans-belysning bilder genom en extra bild fångas med neutral densitet filter. Bilden med den specifika excitationsfilter (figur 2E-mätt) är normaliserade i överföring bilden mäts med samma utsläpp filter och en öppen excitationsfilter (figur 2E - simulerade) att ge den signalen produceras av substratet ensam. Den liknande uppmätt och simulerad NTF effektivitet profil i både horisontellt (figur 2F) och vertikala (figur 2G) profiler med nästan 0% procentandel fel (figur 2E-% fel) ger bevis på en god kvalitet 3D rekonstruktion med reducerad artefakter och förbättrad signal lokalisering och känslighet.
Figur 1 . Avbildning av M. tuberculosis med REF. (A) i vivo imaging av möss infekterade och infekterade med M. tuberkulos vid 2, 4 och 6 veckor efter infektion. Stapeln representerar intensiteten av fluorescerande signalen i fotoner per sekund per cm2 från låg (gul) till hög (röd). (B) kvantifiering av fluorescensintensiteten från möss som infekterats med M. tuberkulos. Fluorescens värden för både kontroll (svart) och infekterade (röd) representerade tillsammans med standardfelet för varje tidpunkt. Betydelsen av resultat bestämdes av studenter t-test, p -värden för < 0.05 ansågs betydande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . 3D FLIT rekonstruktion av fluorescens källor i möss som infekterats med M. tuberkulos. Mus tomografi representerade i olika riktningar; (A) koronala, B) sagittal, och (C) transaxial med (D) lungan orgel registrering. Intresse (ROI) 3D regionen representeras som en röd kub i lungan för källa mätningar. (E) NTF effektivitet kartor av uppmätt och simulerad för kontrollen återuppbyggnad kvalitet. Uppmätt och simulerad NTF effektivitet profilen jämfördes, som ger god kvalitet på 3D rekonstruktion (liknande uppmätt och simulerad NTF effektivitet). F) vågrätt och G) vertikala signal profiler som representerar uppmätta (blå) och simulerade (röd) NTF effektivitet kurva. De horisontella och vertikala röda staplarna anger källa position. Stapeln representerar intensiteten av fluorescerande signalen i fotoner per sekund per cm2 från låg (blå) till hög (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
När du använder avbildningstekniker, såsom REF, finns det viktiga strategier som tillåter generation av robusta och konsekventa uppgifter. Optisk imaging producerar spritt ljus i vävnader vilket kan påverka inträngningsdjupet, eftersom det är svårt att fånga ljuset i alla riktningar. Användning av en nära infraröd fluorophore (NIR) substrat för REF imaging med en excitation och utsläpp våglängd i Querange 700-900 nm underlättar minimal absorption av fluorescerande signalen från däggdjur vävnader. Anpassade utformade substratet konstruerades genom att länka en NIR fluorophore, IRDye 800Cw till en törstsläckare, IRDye QC-1, av en lactam ringen ger fluorescens resonans energi överföring-baserade snabbkylning. IRDye har utmärkt vävnad penetration och ljus spridning egenskaper och har inte någon uppenbar skadlig effekt på däggdjur36, rensas från blod och organ av 24 h. fluorescens signal betydligt ökar börjar 4 h efter substratet administration, nå en maximal nivå 6 h efter administrering.
Bakteriella infektionssjukdomar dosen, funktionsläget av administrering av smittsam dos och substrat samt tidpunkter Imaging post infektion genom att utföra pilotstudier bör standardiseras innan man börjar på stora, komplexa, experiment. Pilotstudier kan avsevärt minska tiden och kostnaden när imaging ett stort antal djur eftersom ett standardförfarande kan optimeras innan du gör det viktigaste experimentet. Bakteriella laster bör bestämmas i organ/vävnader av intresse efter hela kroppen imaging använder trans-belysning och ex vivo lung bildåtergivning med epi-belysning att validera källan av signalen och bestämma kvaliteten på korrelation med bakteriell nummer närvarande8. Pilotstudier kommer att ge inblick i tröskeln till upptäckt, dynamiskt omfång av tekniken samt bestämning av optimala experimentella förutsättningar för avbildning.
De främsta fördelarna med att använda REF imaging som jämfört med andra lysrör och självlysande strategier är dess höga känslighet och förmåga att bild naturliga M. tuberculosis stammar. REF imaging använder tredjeparts enzymet katalytiskt robust BlaC som är bevarad i alla M. tuberculosis kliniska isolat och tuberkulos-komplex stammar. Stor känslighet REF imaging beror på den katalytiska snabbt BlaC i kombination med bibehållande av klyvs fluorescerande produkten av värdcellen. Signalera kontinuerligt ökar så länge underlaget är tillgängliga vilket resulterar i nästan obegränsade uppbyggnaden av signalen inom infekterade celler och vävnader. Denna ökade känslighet för REF imaging jämfört med alternativa metoder för imaging tillåter specifika påvisande av M. tuberculosis både in vitro- och in-vivo8,23,24, 29.
REF imaging kan användas för bakteriell upptäckt utan genetiska modifieringar möjliggör dess direkta tillämpning till någon infektion modell, antingen laboratorium djur8,37 eller mänskliga kliniska material29,38 . REF kan användas för att upptäcka och bild ett brett spektrum av patogener39,40, eftersom fluorogenic substrat kan utvecklas för många enzymatiska mål än BlaC såsom proteaser, kinaser, ureases och β-galactosidases. Dock försiktig målet bör övervägas för att säkerställa det visar optimala egenskaper för avbildning. BlaC representerar en bra modell enzym för egenskaper som kommer att säkerställa framgångsrik tillämpning av denna strategi. REF imaging ger en omedelbar avläsning på bakteriehalten i lungorna under infektioner, vilket avsevärt snabbar framsteg i studie av tuberkulos patogenes, eftersom fastställandet av bakteriell siffror kräver normalt tre till sex veckor, men även i mer snabb-växande organismer detta tillvägagångssätt kommer att spara mycket tid. REF kan också användas för att diskriminera carcinom från tuberkulos, ett nyckelproblem diagnos av nodulär lesioner i patienter41,42. REF fungerar som ett nytt verktyg att påskynda translationell tuberkulos imaging och kan även tillämpas på människor, vilket kan möjliggöra snabb förutsägelse av terapeutiska resultat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| CNIR800 | Custom synthesized | ||
| Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| 7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
| OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
| Sporcidin | RE-1284F | ||
| 7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
| Madison Chamber | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
| Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
| Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
| M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
| Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |
References
- Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
- Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
- Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
- Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
- Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
- Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
- Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
- Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
- Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
- Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
- Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
- Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
- Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
- Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
- Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K.
- Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
- Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
- Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
- Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J.
- Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
- Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
- Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
- Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
- Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
- Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
- Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
- Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
- Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
- Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
- Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
- 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. , 20150219653 A1 (2015).
- Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
- Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
- Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
- Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).
