화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

요약

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

초록

DNA 메 틸 화 포유류 게놈에 안정적이 고 상속 후 성적인 수정 이며, 세포 기능 제어 유전자 발현 조절에 관여. DNA 메 틸 화, 또는 DNA demethylation의 반전은 dioxygenases의 10-11 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. 그것은 널리 알려졌다 탈 DNA 메 틸 화와 demethylation 발달 결함과 암와 관련 된, 있지만 어떻게 이러한 후 성적인 변경을 직접 기여할 진 식 또는 질병 진행에 후속 변경 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는 정의 된 시간적, 공간적 해상도에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족 때문에 크게 불분명 남아 있습니다. 이 장애물을 극복 하기 위해 우리는 분할 TET2 효소를 5-methylcytosine (5mC) 산화의 일시적인 제어 및 후속 개장 하는 포유류 세포에 있는 후 성적인 국가의 단순히 화학 물질을 추가 하 여 사용할 수 있도록 설계 되었습니다. 여기, 우리 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 (사이 다), 포유류 세포와 함께 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 화학 유도할 수 있는 생산 측정 조작된 분할-TET2 효소에 따라 도입 방법 설명 immunostaining, cytometry 또는 점 오 점 분석 결과. 이 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 유전자 코드를 변경 하지 않고 셀룰러 시스템 질문 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 시스템에서 epigenotype−phenotype 관계를 프로 빙에 광범위 한 사용을 찾을 것입니다.

서론

DNA 메 틸 화, 주로 5-methylcytosine (5mC) 형성 시 토 신의 탄소 5 위치에 메 틸 그룹의 추가를 나타냅니다, 그리고 DNA 메 틸-transferases (DNMTs)에 의해 촉매. 5mC transcriptional 억제, x 염색체 비활성화와 transposon 입을¹에 대 한 신호를 종종 포유류 게놈에 있는 주요 epigenetic 마크 역할을 합니다. DNA 메 틸 화의 반전 10-엘 프 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. TET 효소 철 (II)에 속하는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxycytosine (5caC)의 연속 산화 촉매는 종속 dioxygenases 2 oxoglutarate. TET 중재 5mC 산화 epigenetic 제어할 포유류 게놈의 추가 계층을 부과 한다. TET의 발견 TET 단백질의 생물 학적 기능 및 그들의 주요 촉매 제품 5hmC 공개 후 필드에 강렬한 관심을 촉발 했다. 5hmC 하지만 중간 TET 중재 활성 DNA demethylation^2,,3

프로토콜

1. 세포 문화, 플라스 미드 Transfection 및 화학 유도

1. 문화는 부착 셀 라인 (예, 인간 미 발달 신장 HEK293T 셀) Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)에 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 100 U/mL 페니실린, 5% CO₂와 37 ° C에서 스 보완.
2. 사과 쥬 스 플라스 미드와 셀 transfect
   1. Transfection 전에 적어도 18 h, 2.5 ml 당 적절 한 DMEM의 씨앗 0.3 x 10⁶ 셀 6 잘 플레이트에 고 37 ° C 하룻밤 60-80 %confluency 도달에서 세포를 품 어.
   2. 미리 사용 하기 전에 실내 온도에 transfection 시 따뜻한.
   3. 무 균 튜브에 혈 청 자유로운 매체의 장소 250 µ L.
      참고:이 금액은 80 %confluency 6 잘 플레이트에 대 한 맞춤형. 필요한 경우, 비례 또는 셀 숫자의 크기에 따라 중간 금액을 조정 합니다.
   4. 사과 쥬 스¹⁸ 또는 TET2의 촉매 도메인 인코딩 플라스 미드의 2.5 µ g 추가 (긍정적인 제어 TET2CD)

결과

유도할 수 있는 화학 5mC-5hmC 변환 단일 셀 수준, 교류 cytometry 분석, transfected (mCherry 양성) 세포 인구에 또는 더 양적 점 오 점 분석 결과 그림 1에서 볼 수 있듯이 immunostaining에 의해 유효성 수 있습니다. TET2, 또는 TET2CD의 촉매 도메인 긍정적인 통제로 연구에 걸쳐 사용 되었다. 5hmC 및 chromatin 접근성에 rapamycin 유도 변경의 게놈 넓은 매핑에 대 한 자세한 내용은 참조 18-20 참조.

그림 1: HEK293T 셀에서 유도할 수 있는 DNA hydroxym.......

토론

여기 우리 DNA hydroxymethylation의 일시적인 제어를 달성 하기 위해 설계 된 분할-TET2 효소를 사용 하 여를 일러스트 있다. TET 가족 5-methycytosine dioxygenase의의 발견, 많은 연구 해독 TET 단백질과 그들의 주요 촉매 제품 5hmC^,12,3,^{의 생물 학적 기능 수행 되었습니다. 4,5,6,7,,89,}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lipofectamine 2000 형질주입 시약	Thermo Fisher Scientific	11668027
Rapamycin	Sigma-Aldrich	37094
Paraformaldehyde, 16% 용액	VWR	100503-916
Triton X-100	Amresco	0694-1L
염산	Amresco	0369-500ML
알부민, 소	Amresco	0332-100G
Tween 20	Amresco	0777-1L
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) 항체 (pAb)	Active Motif	39769
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsosorbed Secondary 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)	Biotium	40043
SVAC1E SHEL LAB 이코노미 진공 오븐, 0.6 Cu.Ft. (17리터)	SHEL LAB	SVAC1E
UltraPure SSC, 20X	Thermo Fisher Scientific	15557036
Bio-Dot Apparatus	BIO-RAD	1706545
Anti-5-methylcytosine (5mC) 항체, 클론 33D3	Millipore	MABE146
Anti-mouse IgG, HRP 관련 항체	세포 신호 기술	7076S
Anti-rabbit IgG, HRP 결합 항체	세포 신호 전달 기술	7074S
West-Q Pico Dura ECL 솔루션	Gendepot	W3653-100