Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes

Summary

Ce protocole cible les cellules dans le tissu pour l’imagerie à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide d’un microscope électronique à balayage (SEM). Un grand nombre de coupes sériées de matériel biologique enrobées dans la résine est imagé tout d’abord dans un microscope photonique à identifier la cible, puis de façon hiérarchique dans le SEM.

Abstract

Cibler des cellules spécifiques à résolution ultrastructurale au sein d’une population de cellules mixtes ou un mouchoir en papier est possible en imagerie hiérarchique à l’aide d’une combinaison de microscopie photonique et électronique. Échantillons embarqués en résine sont sectionnées en tableaux composé de rubans de centaines de coupes ultrafines et déposés sur des morceaux de tranche de silicium ou de lamelles en liaison conductrice avec enduit. Les tableaux sont imagés à basse résolution à l’aide un consommateur numérique comme appareil smartphone ou microscope photonique (LM) pour avoir un aperçu rapide de grande surface ou un microscope à fluorescence grand champ (microscopie photonique de fluorescence (FLM)) après marquage avec des fluorophores. Après coloration par des métaux lourds, les baies sont imagés dans un microscope électronique à balayage (SEM). Sélection des cibles n’est possible de reconstructions 3D générées par FLM ou de reconstructions 3D issues les piles SEM d’image à résolution moyenne, si aucun des marqueurs fluorescents ne sont disponibles. Pour les analyses ultrastructurales, cibles choisies sont tournées enfin la SEM à haute résolution (quelques pixels de l’image de nanomètre). Un outil de gestion ruban qui peut être modifié à n’importe quel ultramicrotome est démontré. Il aide à la production de tableau et enlèvement de substrat du bateau sectionnement de couteau. Une plate-forme logicielle qui permet l’imagerie automatisée des tableaux dans le SEM est discutée. Par rapport aux autres méthodes de production de données de grand volume EM, comme îlot série SEM (SBF-SEM) ou faisceau ionique focalisé SEM (FIB-SEM), cette approche présente deux avantages principaux : (1) l’échantillon enrobées dans la résine est conservée, mais dans une version en tranches. Il peut être teinté de différentes manières et imagé avec des résolutions différentes. (2) ainsi que les sections peuvent être soit des traités, il n’est pas nécessaire d’utiliser des échantillons fortement colorés à bloc avec des métaux lourds pour introduire le contraste pour l’imagerie SEM ou blocs de rendu de tissu conducteur. Cela rend la méthode applicable à une grande variété de matériaux et de questions biologiques. Matériaux particulièrement préfixée par exemple, de banques de biopsie et les laboratoires de pathologie peuvent directement être incorporé et reconstruit en 3D.

Introduction

Pour la reconstruction de grandes quantités de tissus à résolution ultrastructurale, un certain nombre de différentes méthodes d’imagerie basée sur SEM ont été utilisés¹: révisions complètes sont disponibles par exemple., de SBF-SEM², FIB-SEM³et tableau Tomographie (AT)⁴. Alors que pour cette dernière méthode, le matériau de l’échantillon est conservé sous forme de tableau de coupes sériées sur un substrat, SBF-SEM et FIB-SEM sont des méthodes destructives, travaillant sur le bloc de l’échantillon et qui la consomme en imagerie. En raison de la charge de la résine dans le SEM, elles dépendent aussi fortement métallisé échantillon blocs⁵.

D’autre part, identifier certaines cellules ou structures d’intérêt au sein d’un échantillon de tissu peut bénéficier en particulier lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM)^6,7,8. À l’aide de FLM afin de cibler empêche l’application de grandes quantités de métaux lourds, car cela serait étancher le signal de fluorescence⁹. Pour ces seuls échantillons légèrement métallisés, AT est la méthode de choix car les tableaux peuvent être facilement après tachées et heavy metal, après imagerie LM. En outre, presque n’importe quel type d’échantillon peut être utilisé pour AT, des échantillons de même routine de la pathologiste au Trésor poitrine¹⁰.

Un autre grand avantage de la TA est la possibilité de hiérarchique¹¹ ou multirésolution d’imagerie¹²: il n’est pas nécessaire de tout à haute résolution d’image, comme cibles peuvent être sélectionnés dans une modalité différente (par exemple, FLM) ou en images de basse résolution SEM. Seules les régions intéressantes d’une population de tissus ou de cellules à haute résolution d’imagerie économise de l’espace de stockage de données numériques et produit des petits ensembles de données d’image, qui sont plus faciles à gérer. Ici, le flux de travail AT est démontrée en utilisant un échantillon assez faiblement métallisé : haute pression gelé les racines des plantes (Arabidopsis thaliana) incorporé en résine hydrophile.

Les baies sont préparés, colorés et imagés en FLM et SEM et découvrez comment les piles d’image sont enregistrés sont expliqués. Aussi, comment la reconstruction 3D du volume FLM peut être utilisée pour sélectionner des cellules spécifiques pour l’imagerie de la SEM à résolution nanométrique est illustrée.

Protocol

Remarque : Les blocs échantillon devraient être polymérisés et contiennent des métaux lourds. Fixation et incorporation des protocoles pour les deux échantillons, illustrés à la Figure 1 a-B ont été décrites ailleurs¹¹. En bref, l’exemple illustré à la Figure 1 a a été fixée chimiquement, traités en bloc première avec OsO 1 %₄, puis avec 1 % acétate d’uranyle et incorporé en résine de Spurr. L’exemple illustré dans la Figure 1 b haute pression a été gelée, gel substitués avec 0,4 % dans l’acétone, l’acétate d’uranyle et incorporé en résine Lowicryl HM20. Utiliser des gants libres de poudre pour les prochaines étapes de la préparation.

1. création de tableaux

1. Tailler le bloc de l’échantillon
   NOTE : Toujours serrer vis bien lors de l’insertion de pièces.
   1. Insérez le bloc de l’échantillon dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome, introduisez le porte dans le bloc de coupe et faites-la glisser dans l’étage inférieur de l’ultramicrotome.
   2. Tailler loin résine autour du tissu incorporé avec une lame de rasoir, laissant seulement un petit bord de résine autour de l’échantillon. Garniture du haut jusqu'à ce que la cible soit atteinte.
      NOTE : La forme de l’îlot peut être trapézoïdale ou rectangulaire (nous avons utilisé avec succès les deux formes). Il est important d’utiliser les bords les plus longs du rectangle d’attaque et bord de fuite pour s’assurer qu’une vaste zone est couverte par le mélange de colle stabilisant les rubans.
   3. Insérez le porte-échantillon dans le bras de l’ultramicrotome et remplacer le bloc de coupe dans l’étage inférieur par le porte-couteau. Insérer un couteau de garniture du diamant (normalement 45°), dans le support de couteau. Aligner l’îlot exactement parallèle à la lame de couteau garniture.
      Remarque : Pour produire exactement parallèle début (en bas) et fin des bords (supérieurs), tourner ou déplacer uniquement le couteau pour tailler les côtés opposés. Pour les gros volumes (plus de plusieurs centaines sections), un couteau de garniture de 90° est avantageux.
   4. Lisser les quatre côtés, puis faites pivoter le porte-échantillon d’attaque et bord de fuite sont maintenant en position horizontale.
   5. Soigneusement, enduire les côtés de début et de fin du bloc avec le mélange de colle. Utilisez une petite brosse formé de quelques poils, fixés sur un cure-dent¹³. Effectuez cette étape rapidement car le solvant de ce mélange s’évapore en quelques secondes. Ne pas contaminer l’îlot avec ce mélange. Laissez le bloc échantillon enduit sécher pendant 5-10 min.
      Remarque : pour un plus grand nombre de sections (> 200), il peut être préférable d’enduire le bord d’attaque seulement, parce qu’avec le temps, un renflement de la colle peut s’accumuler sur le bord de fuite et potentiellement tirez des sections sur la lame des couteaux.
2. Préparation du substrat
   1. Couper les morceaux de plaquettes de silicium à une taille qui s’insère dans le bateau de couteau (environ 2 x 2, 5 cm² au couteau Jumbo). Le cas échéant, marquer les pièces de wafer (chiffres ou lettres) avec une pointe à tracer diamant avant de nettoyer ou marqueur permanent après le nettoyage. Nettoyer la plaquette de silicium manuellement avec l’isopropanol et pelucheux.
      Remarque : Pour l’imagerie corrélatif utiliser oxyde indium-étain (ITO)-enduit couvre-objet en verre. Ils doivent être manipulés avec beaucoup d’attention, et n’est pas nécessaire de nettoyage supplémentaire.
   2. Fixer le substrat à une extrémité de la plaque de support à l’aide d’un adhésif enlevable.
      Remarque : Vous pouvez également les bords du substrat peuvent être coincées parallèle à la lame des couteaux à l’aide de deux bandes de ruban adhésif.
   3. Plasma activer (lampe à décharge luminescente) le substrat à l’air pour obtenir une surface hydrophile. Cela devrait être fait de telle façon qu’une goutte d’eau placés sur les spreads de substrat d’une couche très mince (angle de contact faible, Figure 2, D). HYDROPHILISATION paramètres dépendent de l’unité de plasma utilisée ; pour les paramètres utilisés ici, consultez la Table des matières.
      Remarque : L’activation de Plasma est très volatile, donc cela effectuer immédiatement avant utilisation du substrat.
   4. Insérez le support dans la fixation d’un porte-substrat, avec le substrat monté plus près de la lame des couteaux pour atteindre une humidification optimale du substrat dans le bateau de couteau.
      NOTE : Une description détaillée de la porte-substrat, y compris les dessins de conception assistée par ordinateur (CAO), est donnée à Wacker et al. ¹¹
3. Préparation de sectionnement
   1. Insérer un couteau diamant de Jumbo dans le porte-couteau, régler l’angle de dégagement (0° pour couteau Jumbo) et remplir le bateau de couteau avec de l’eau distillée. Le couteau d’approche à une distance de 1 à 2 mm pour l’échantillon.
   2. Abaissez le substrat dans l’eau à l’aide de la vis 1 – 3 (Figure 2 a) de la porte-substrat. Vérifiez que la ligne de flottaison se trouve dans le tiers supérieur du substrat.
      Remarque : Vérifier que la colle entre le substrat et support plaque est bien guérie en poussant le substrat avec une pince propre. Il ne doit pas bouger.
   3. Parce qu’il est difficile de voir la garde au sol lors de l’utilisation d’une tranche de silicium, abaisser le substrat jusqu'à ce qu’elle touche le sol. Maintenant soulevez le substrat une petite quantité. S’assurer que le substrat, ni le transporteur touche le bateau de couteau pendant la coupe.
   4. Utiliser une seringue ou une pipette pour ajuster le niveau d’eau dans le bateau. Tout en regardant dans les jumelles, ajoutez ou supprimez l’eau jusqu'à ce que toute la surface de la surface de l’eau montre une réflexion homogène de l’illumination lumineuse supérieure de l’ultramicrotome.
   5. Allumez la lumière du bas de l’ultramicrotome. Assurez-vous que le bras est en position centrale et pas de rétraction à l’aide de la molette de l’ultramicrotome. Approche le couteau à l’échantillon jusqu'à ce que le reflet de la lame des couteaux est visible sur la face du bloc.
   6. Utilisez les options d’ajustement de l’ultramicrotome pour aligner l’échantillon au couteau. Tout d’abord tourner le couteau, puis faire pivoter et incliner l’échantillon.
      Remarque : Il est aligné correctement si la bande lumineuse, qui peut être vu dans l’écart entre l’échantillon et le couteau, montre des bords parallèles (lignes droites parallèles et non cunéiforme).
   7. Vérifiez l’inclinaison de l’échantillon : Assurez-vous que la bande lumineuse ne devienne plus épaisse ou plus mince tout en déplaçant l’échantillon de haut en bas. Si nécessaire, utilisez la vis de réglage d’arc pour corriger cela. Déplacer le couteau plus près à l’échantillon jusqu'à ce qu’il est juste au-dessus de l’îlot (mais sans le toucher).
   8. Définir l’épaisseur de coupe (alimentation), coupe de vitesse et la fenêtre de découpe à l’unité de commande.
   9. Commencer la coupe. Si nécessaire, attendre que la première section complète a été réduite. Couper certaines sections pour être sûr qu’ils collent aux rubans de forme (sinon la colle doit être appliquée à nouveau). Commencez avec une haute valeur fourragère (maximum, 200 nm pour le couteau Ultra) jusqu'à ce que la première section complète a été réduite. Ensuite, définissez la valeur fourragère souhaitée. Pour une stabilité suffisante de ruban, une épaisseur de coupe de 100 nm et une vitesse de coupe de 1 mm/s est un bon point de départ. L’épaisseur de coupe réalisable le plus bas est environ de 60 nm, selon la qualité de l’échantillon.
   10. Arrêter de sectionnement. Supprimer toutes les sections (partiellement coupées) inutiles de la lame des couteaux et en bateau à l’aide de cheveux d’un cil/chat. S’il y a beaucoup de petits débris flottant autour, retirez l’eau complètement avec une pipette et remplir le bateau à l’eau douce. Le processus est maintenant prêt pour le premier ruban productif.
4. Sectionnement
   1. Commencer la coupe. Une fois un certain nombre de sections (le nombre réel dépend de la taille des sections et substrat) a été coupé, arrêter le processus de découpe et libérer le ruban de la lame des couteaux en caressant doucement au fil de la lame des couteaux avec un cils¹⁴ ou mieux encore, avec une très cheveux doux de la fourrure du chat.
   2. Manipuler (push/pull) le ruban avec les cils vers le substrat et fixer le premier au substrat.
      Remarque : Il est nécessaire de pousser doucement le ruban jusqu'à ce qu’elle adhère à la partie sèche du substrat.
   3. Continuer le sectionnement et y attacher les rubans sur le substrat. Commencez sur un côté et passer peu à peu plus à l’autre avec chaque nouveau ruban.
      Remarque : Éviter les mouvements de l’eau massive pour éviter que desserré les rubans déjà attachés. Il en va de même pour les courants d’air. Utiliser le bouclier souffle livré avec l’ultramicrotome. Dans des conditions environnementales défavorables, un enclos pour l’ultramicrotome est recommandé¹⁵.
   4. Lorsque le substrat est complètement recouverte de rubans (généralement 4 à 5 rubans sont réalisables), doucement élévateur rabattable le substrat du bateau de couteau avec les vis micromanipulateur du porte-substrat.
      NOTE : Les mouvements appropriés sont : soulever verticalement (vis 1) et de rotation/inclinaison (3 vis), ou une combinaison des deux.
   5. Sécher le tableau ruban avant de le ranger dans un environnement sans poussière. Après séchage, retirer l’adhésif substrat monté dès que possible auprès du transporteur (le même jour, sinon le substrat peut être trop difficiles à enlever ou peut-être même se rompre pendant le démontage).

2. la coloration pour l’imagerie de LM

NOTE : Différentes méthodes de marquage/étiquetage sont possibles, y compris les protocoles d’immunofluorescence. Ici une coloration directe, plutôt imprécise est choisie pour décrire les parois cellulaires.

1. Iodure de propidium
   1. Ligne du bord du récipient avec un tissu humide pour construire une chambre humide et couvrir le fond d’un grand verre de Pétri (30 cm de diamètre) avec parafilm.
   2. Utilisez environ 300-500 µL de solution par lamelle couvre-objet. Déposer une goutte de chaque lamelle sur le parafilm et mettez le verre à l’envers sur la baisse, afin que les sections sont en contact avec le liquide de coloration. Couvrir le plat et l’envelopper avec du papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière. Incuber les échantillons pendant 16 h à 4 ° C.
   3. Retirer la lamelle avec une pince et lavez-le en le déplaçant de haut en bas dans un bécher de 100 mL rempli avec 80 mL d’eau distillée. Répétez cette opération dans un autre bol avec de l’eau fraîche. Sécher la lamelle soigneusement à l’air comprimé.

3. enregistrer l’Image pile dans la FLM

1. Placez le couvre-objet sur la scène d’un FLM de grand champ commun.
2. Choisissez le jeu de filtre approprié (Table des matières) pour la fluorescence à observer.
3. Avec un objectif approprié, prendre une image de l’objet dans chaque section : essayez de remplir le champ de vision et de maintenir l’orientation constante. L’apex racinaire, on a utilisé un objectif 40 air.
   Remarque : Si les rubans ne sont pas parfaitement droites, une scène tournante peut aider à réorienter les sections tout en prenant des images. Si possible, de centrer l’image sur une fonctionnalité spécifique ou garder une fonctionnalité comme le bord de la partie à égale distance du bord de l’image enregistrée.
4. Si possible, utilisez les 16 bits de limiter pixel saturé et garder le temps d’exposition constante.

4. l’enregistrement de la FLM Image pile

1. Importer les séries d’images dans Fidji¹⁶ comme une pile virtuelle.
2. Ouvrir un nouveau TrakEM¹⁷ (vide) dans le menu fichier.
3. Faites un clic droit dans le champ de l’image et importez la pile dans TrakEM comme « Une tranche par calque ».
4. Aligner les calques (clic droit dans le champ de l’image), de définir les limites (première image pour durer) et choisissez aucun comme référence. Pour tous les paramètres, les valeurs par défaut, puis choisissez rigide comme la transformation souhaitée.
5. Lorsque l’enregistrement est terminé et satisfaisante, enregistrez le groupe de données alignée par clic droit et choisissez Exporter. Faire une image plate, définir la plage de la première à la dernière image et laissez le logiciel montrent la pile résultante. Enregistrez la pile au format tif.

5. coloration et montage pour l’imagerie SEM

Remarque : Pour préparer des solutions de coloration voir Table des matières. Des solutions peuvent être conservées à 4 ° C jusqu'à 12 mois, protégé de la lumière et l’air.

Mise en garde : Acétate d’uranyle et de citrate de plomb contiennent des métaux lourds toxiques. Porter des gants et éliminer les déchets conformément aux instructions des autorités locales.

1. Ligne du bord du récipient avec un tissu humide pour construire une chambre humide et couvrir le fond d’un grand verre de Pétri (30 cm de diamètre) avec parafilm.
   Remarque : Il est important que plusieurs pastilles de NaOH sont placés dans la boîte de Pétri près les gouttes coloration pour empêcher la précipitation excessive du citrate de plomb.
2. Coloration de l’acétate d’uranyle
   1. Centrifuger la solution d’acétate d’uranyle à 2 680 x g pendant quelques secondes pour les petites particules et les sédiments.
   2. Utilisez environ 300 – 500 µL de solution par lamelle couvre-objet. Déposer une goutte de chaque lamelle sur le parafilm et mettez le verre à l’envers sur la baisse, afin que les sections sont en contact avec le liquide de coloration.
   3. Incuber pendant 10 min à température ambiante et couvrir le plat pendant la coloration.
   4. Enlever le couvre-objet avec forceps et lavage en la déplaçant verticalement dans un bécher rempli d’eau distillée (voir étape 2.1.3).
3. Entraîner une coloration citrate
   1. Au cours de l’incubation de l’acétate d’uranyle, préparer la solution de citrate de plomb.
      NOTE : Citrate de plomb doit toujours être filtrée immédiatement avant usage afin d’éliminer toute précipités. Centrifuger aussi la solution de citrate de plomb à 2 680 x g pendant quelques secondes comme au point 5.2.1.
   2. Utilisez environ 300 – 500 µL de solution par lamelle couvre-objet. Déposer une goutte de chaque lamelle sur le parafilm immédiatement avant de vous laver les lamelles après la coloration de l’acétate d’uranyle et mettez le verre à l’envers sur la baisse, afin que les sections sont en contact avec le liquide de coloration. Placer les gouttes (300 – 500 µL) sur du parafilm immédiatement avant de vous laver les lamelles après la coloration de l’acétate d’uranyle.
      Remarque : Pour éviter la formation de précipités, ne pas respirer sur les gouttelettes de citrate de plomb.
   3. Placer la lamelle lavée à l’envers sur la baisse (il n’y a pas besoin de sécher).
   4. Incuber 5 min à température ambiante et couvrir le plat pendant la coloration.
   5. Enlever le couvre-objet avec une pince et le laver comme indiqué ci-dessus dans un bécher d’eau fraîche (étape 5.2.4).
4. Sécher la lamelle soigneusement à l’air comprimé.
5. Montage des échantillons pour l’imagerie SEM
   1. Monter les plaquettes de silicium sur talons en aluminium avec un tampon de carbone collante.
      Remarque : ITO-enduit lamelles peuvent soit être monté à l’aide de peinture argentée et Cu-bande — Assurez-vous que la surface conductrice est connectée à la longrine — ou, avec plaquettes carbone comme ci-dessus. Dans ce cas, une connexion conductrice de l’ITO-surface vers le stub est possible avec une goutte de peinture argentée.

6. hiérarchique d’imagerie dans le SEM

Remarque : Dans une émission de champ SEM, choisissez une faible énergie primaire (3 kV ou moins), un courant dans une gamme de 50 à 800 pA afin d’éviter le chargement et une distance de travail adapté pour une collecte efficace des électrons secondaires et/ou éparpillés à l’arrière du faisceau. Sélection du courant du faisceau repose sur les propriétés de l’échantillon (e.g., enrobage résine) ; la dose d’électron sera aussi un compromis entre un courant faible (moins nocif pour l’échantillon) et un courant élevé, ce qui est bénéfique pour l’imagerie de vitesse et donc réduit le temps d’acquisition total image. Des détecteurs dédiés pour les électrons dispersés à l’arrière offrent bon contraste, sont moins sensibles à la charge de l’échantillon et montrent moins d’artefacts de surface de l’échantillon (plis, les marques de couteau). Contraste et la luminosité doivent être ajustées de telle que l’histogramme est centrée.

1. Imagerie de la SEM
   1. Tout d’abord définir les quatre coins du tableau en saisissant une image de chaque coin à faible grossissement, environ 100 x. Créer une région d’intérêt (ROI) englobant l’intégralité du tableau. Assigner un protocole d’imagerie avec les paramètres suivants : utilisez un détecteur d’électrons secondaires (SE), qui permet l’imagerie haute vitesse à une taille de pixel d’image grand (par exemple 1 000 nm) et un temps de pause court (par exemple, 0,2 µs).
      Remarque : Pour surmonter les limitations optique électronique à un grand balayage champs de vision (FOV), qui pourrait entraîner des distorsions en périphérie des images, utilisez les modes dédiés à faible grossissement (fournis par la plupart des fabricants de SEM) ou utilisez moyen, 1 à 2 k scan champs de images simples.
   2. Générer une section de la valeur en créant un ROI décrivant simplement le tissu dans la première section. Il clone à toutes les sections subséquentes à l’aide de l’outil tampon. Faire pivoter la ROIs quand nécessaire pour accueillir les rubans pliés.
   3. Enregistrer les séries d’images en utilisant une taille de pixel intermédiaire (environ 50 nm) et un temps assez long d’identifier et de reconnaître la structure cible. Utilisez un champ de vision pour des images individuelles dans une gamme de 6-10 k pixels.
      Remarque : Le logiciel Atlas 5 peut recueillir automatiquement des mosaïques composées d’images adjacentes pour couvrir de grandes surfaces ROI/section dans les coupes sériées.
   4. Créer un site situé dans cet ensemble de section, contenant la structure cible pour l’imagerie de résolution SEM plus élevé. Faire le retour sur investissement est assez grand pour tenir compte de la précision de la scène. Vérifier et ajuster les positions des sites.
      Remarque : Il est important de placer la ROIs de telle sorte que le centre, où l’autofocus et l’autostigmation seront effectués, ne pas s’asseoir sur des matières « vide » avec aucun détail structurel, par exemple., vacuoles.
   5. Définissez les paramètres de mise au point automatique et vérifier les performances sur au moins la longueur d’un ruban (c'est-à-dire, la plus longue distance que le stade doit voyager) sur un petit ROI près du site qui sont projeté.
   6. Définir un protocole d’imagerie pour l’acquisition de SEM à haute résolution. Pour afficher les compartiments membranaires, choisissez taille de pixel image 3 à 5 nm. Sélectionnez un temps de pause selon le détecteur afin que l’image n’est pas trop bruyant.
   7. Avant de commencer l’acquisition, définir les valeurs de mise au point au moins la première partie de chaque ruban à l’aide de l’option de protocole de vérification.
   8. Recommencer toute la série des ROIs de cible de l’imagerie automatisée de SEM.
   9. Exportez les données acquises comme des séries d’images, de préférence en format tif.

7. inscription de la pile de SEM Image

1. Importer des séries d’images dans les Fidji comme une pile virtuelle.
   Remarque : Ce seront des fichiers de données volumineux dans la gamme de quelques Go selon le nombre de sections et de la taille du ROI.
2. Cadrer l’image SEM empiler pour un traitement ultérieur dans une région aussi proche de la structure d’intérêt possible et ajuster la luminosité et le contraste.
3. Ouvrir un nouveau TrakEM¹⁷ (vide) dans le menu fichier.
4. Faites un clic droit dans le champ de l’image et importez la pile dans TrakEM comme « Une tranche par calque ».
5. Aligner les calques (clic droit dans le champ de l’image), choisissez la méthode des moindres carrés comme mode, définissez la plage (première image pour durer) et choisissez aucun comme référence. Pour les paramètres, les valeurs par défaut et choisissez rigide comme la transformation souhaitée.
6. Lorsque l’enregistrement est terminé et satisfaisante, enregistrez le groupe de données alignée par clic droit et choisissez Exporter. Faire une image plate, définir la plage de la première à la dernière image et laissez le logiciel montrent la pile résultante. Enregistrez la pile au format tif.

Representative Results

Le flux de travail décrit ici (Figure 1) commence avec un échantillon incorporé dans un bloc de résine. Au cours de la préparation de l’échantillon, certains métaux lourds devraient être introduit dans les tissus, mais il n’est pas nécessaire d’utiliser les protocoles optimisés pour métallisation assez forte. Figure 1 a montre une racine de plante (cress) bloc coloré classiquement avec 1 % OsO₄ et 1 % acétate d’uranyle, tandis que la racine de l’Arabidopsis dans la Figure 1 b est seulement faiblement métallisé en utilisant l’acétate d’uranyle 0,5 %. Le type de ce dernier exemple est plus adapté pour approches corrélatifs comme certains métaux lourds ont tendance à étouffer la fluorescence. Avec un support dédié de substrat (Figure 2), les tableaux de centaines de plusieurs sections peuvent être produites (Figure 1). Après marquage fluorescent, tels tableaux est imagés dans un FLM de grand-angulaire standard (Figure 1), puis colorées avec des solutions de métaux lourds et photographiée sur un SEM à différentes résolutions (Figure 1E–G).

Des outils importants pour la génération reproductible des tableaux, en particulier lorsque vous placez plusieurs rubans de bateau couteau du microtome sur un substrat, sont le porte-substrat (Figure 2 a, conçu sur mesure en laboratoire des auteurs) et un diamant de Jumbo couteau avec un bateau assez grand pour accueillir des lames de microscope (Figure 2 b). Un ménisque plat, permettant la bonne observation des rubans, est nécessaire et peut être réalisé par plasma, nettoyage du substrat : une petite goutte d’eau distillée ne devrait pas constituer une structure en forme de lentille sur le substrat comme dans la Figure 2 (substrat non traitée), mais un film mince (Figure 2D, substrat de plasma activé). Dans ces conditions, les rubans attachés à la partie sèche d’une lamelle couvre-objet revêtu ITO sont facilement visualisée (Figure 2E) et peut être observée et contrôlée pendant la levée du substrat de l’eau.

À titre d’exemple, tableaux colorés à l’iodure de propidium d’étiqueter les parois cellulaires des plantes ont été photographié avec un champ large standard FLM (Figure 3 a). Les sections étant seulement 100 nm d’épaisseur, même trop de coloration comme indiqué ici introduit peu flou. Après l’enregistrement, les deux cellules encaissées dans le volume reconstruit ont été choisis dans la pile d’image (Figure 3 b) pour l’imagerie haute résolution en 3D (voir aussi le Supplément S1 du film). Après coloration supplémentaire avec citrate d’uranyle de l’acétate et le plomb, les baies ont été photographiés dans la SEM. Figure 3 C montre une vue d’ensemble, enregistré avec 60 pixels de l’image nm ; le carré sombre dans le centre de l’image indique la position où les fonctions de mise au point automatique ont été exécutées, et la dose supplémentaire a conduit à une légère contamination. Échéant des ROIs dans ces coupes sériées (tranches 51 à 248 de 435 tranches au total) contenant des cellules de deux cibles choisis dans la pile de la FLM étaient alors enregistrés avec une taille de pixel d’image nm 5 (Figure 3D; Voir aussi Supplemental film S2).

Automatisé imagerie hiérarchique des tableaux dans le SEM décrit ici a été fait avec la solution de plate-forme de logiciel/matériel ZEISS Atlas 5. Tout d’abord, un aperçu de l’ensemble a été créé à l’aide du détecteur SE, avec très grand (1 000 nm) image pixels et temps de demeure très faible (Figure 4 a). Un retour sur investissement décrivant uniquement les tissus a été placé sur la première section, puis propagée à toutes les autres sections du tableau. Cet ensemble de section est ensuite enregistré avec 60 pixels de l’image nm à l’aide d’un plus long temps de pause (Figure 4 b). Enfin, un ensemble de site, contenant les cellules deux cibles plus un « couche » qui entoure les cellules pour tenir compte de l’imprécision de la scène, a été mis en place avec les paramètres suivants : détecteur de ESB (rétrodiffusion sélective de l’énergie), image de nm 5 pixels, très longues (40 µs) habitent le temps ( Figure 4). Zoomer sur une telle image montre en détail subcellulaire (Figure 4) tels que les vacuoles (V), les mitochondries (M), noyau (N) et le réticulum endoplasmique (flèches). Voir aussi le S3 de film supplémentaire pour zoom avant d’un aperçu de l’ensemble au détail subcellulaire d’une cellule cible.

Le tableau ci-contre (200 articles) plus un supplément de 250 sections a pris environ 8 h pour produire, une nuit sur la tache pour LM et un jour enregistrer (manuellement) à la FLM. Après coloration prend environ 1-2 h au total, selon le nombre de tableaux individuels. Pour l’enregistrement de la SEM, quelques heures sont nécessaires pour configurer l’exécution de l’Atlas, et enregistrement automatisé a été de 3 à 4 h pour l’ensemble de section résolution moyenne (taille de pixel de 60 nm) (200 sections, 450 x 200 µm²) et environ 5 jours pour la haute résolution (5 nm taille en pixels) ROI contenant des cellules de deux cibles (200 sections, 55 x 30 µm²). Notez qu’en raison de la faible teneur en métal de l’exemple montré ici, une vitesse de balayage très lente devait être utilisée pour atteindre une bonne détection de signal-bruit, qui implique (pour le détecteur actuellement disponible) un temps de pause de 40 µs pour le ROI à haute résolution.

Il existe plusieurs étapes dans le workflow entier sujettes aux pièges : idéalement rubans devraient être plus ou moins droite et placé dans le bon ordre (Figure 5 a). Cependant, bent (Figure 5 b), courbe (Figure 5) ou même cassés rubans sont souvent produites. Ceci peut aboutir en raison de parage incorrect (attaque et bords de fuite pas parfaitement parallèles) ou adhésif non uniformément appliquée, mais aussi d’un échantillon d’asymétrique ou inégalement infiltré. Sont particulièrement gênants des échantillons contenant des composants douces et très durs. Les derniers éléments peuvent être difficiles à infiltrer tels que la paroi cellulaire des plantes racines ci-contre (Figure 5). Dans ce cas, les plis (pointes de flèches) peuvent facilement être causées par variable compression et détente pendant la découpe. Automatisé d’imagerie dans le SEM, rubans courbes ne sont pas un grand problème, puisque la ROIs peuvent être tournée pour tenir compte de la courbure du ruban.

La coloration est une autre étape essentielle dans le protocole : lavage insuffisant peut entraîner des résidus sur la section (Figure 5E, F) et dans le pire des cas, recouvrir la surface plus intéressante (cercle sur l’une des cellules deux cibles Figure 5F). En outre, poussière (Figure 5, les particules de diffusion de la lumière fortement) introduit dans le bateau de couteau, par exemple, avec un transporteur de substrat sale, peut causer de sérieux problèmes : dans la FLM, la poussière peut être très fluorescent (cf. quelques tranches dans film supplémentaire S1) à tel point que certains algorithmes d’enregistrement ne fonctionnent pas. La fonction « aligner » dans TrakEM¹⁷ , toutefois, peut gérer ces piles comme illustré dans le Supplément S1 du film.

Figure 1 : Workflow pour l’imagerie hiérarchique corrélatif. À partir d’un échantillon incorporés dans un bloc de résine (A, échantillon fortement métallisé), l’échantillon est premier Paré (B, échantillon faiblement métallisé) et ensuite les tableaux consistant en plusieurs rubans de coupes sériées (C), placé ici sur un ITO-enduit lamelle couvre-objet, sont fabriqués avec un ultramicrotome. Après coloration avec un colorant fluorescent, piles d’images sont enregistrées dans un grand champ FLM (D). Après que coloration plus rondes et heavy metal, sels, les piles sont imagés dans un SEME–(G) à différentes résolutions (tailles pixel d’image). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : outils pour la préparation de tableaux de. Porte-substrat assemblés à partir de micromanipulateurs avec sept axes de mouvement attaché à un ultramicrotome standard (A) : les vis, a mis en évidence avec des cercles, sont pour la verticale (1) et (2) déplacement horizontal et inclinaison (3) du transporteur substrat . Le couteau diamant jumbo avec un bateau surdimensionné pour accueillir de grands substrats (flèche), ici avec un morceau de gaufrette de silicium activé par plasma monté sur un support aluminium taille lame (B). 20 gouttes µL d’eau distillée placée sur un substrat de gaufrette de silicium non traitées (C) ou sur un substrat activé par plasma (D). Quatre rubans flottant dans le bateau de couteau, attaché à une lamelle de ITO-enduit par leurs extrémités inférieures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : corrélation des données avec des données SEM LM. Vue d’ensemble (A, C) et des cellules cibles (B, D) enregistrement avec FLM (A, B) et SEM (C, D). (B) est un zoom de logiciel et les données d’origine ont été enregistrées avec une lentille d’objectif X 40 sur une puce de 1 388 x 1 040 pixels appareil photo, tandis que (C) est enregistré avec 60 taille de pixel image nm et (D) avec 5 nm pixel taille de l’image illustrant le vrai augmentation de la résolution dans la SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : hiérarchique d’imagerie dans le SEM à l’aide de ZEISS Atlas 5 AT. Vue d’ensemble d’un tableau enregistré avec 1 000 pixels de l’image nm en utilisant le détecteur SE (A). L’article définit avec le ROI placé sur le tissu dans chaque section et enregistré avec 60 pixels de l’image nm (B). Site des ensembles avec un retour sur investissement série placés sur des cellules cibles et enregistré avec 5 pixels de l’image nm (C). Lorsque vous zoomez dans ces images à haute résolution (D), compartiments de membrane intracellulaire comme vacuoles (V), noyau (N), (M) les mitochondries et le réticulum endoplasmique (flèches) deviennent visibles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : problèmes typiques. 1. compte tenu du processus de découpe : rubans placés sur les lamelles ITO-enduit compression sont idéalement droite (A), mais irrégulière au cours de la section peuvent causer un bent (B) ou rubans courbes (D) ou même des plis (C). 2. causés par la manipulation de substrat et rubans dans l’eau, par exemple, lors de coupes et de coloration : diffusion de particules sur le substrat (D) de la lumière, jante de gouttelettes sur la section (cercle E) ou de la saleté barbouillé dehors sur des tissus due à l’insuffisance lavage après coloration (F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

S1 de film supplémentaire : pile FLM image. 435 images alignement en Fidji¹⁶ à l’aide de TrakEM¹⁷ et enregistré en tant que fichier vidéo (.avi). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

S2 de film supplémentaire : pile d’image SEM. 210 images alignées en Fidji¹⁶ à l’aide de TrakEM¹⁷. Le tapis de départ (300 images) de cet ensemble de données a été 15GO. Pour réduire la pile de 3,3 Go (après l’alignement et le recadrage à seulement deux cellules ciblent), il a été mis à l’échelle en x et y d’un facteur de 0,2 à l’aide de Fidji et puis enregistré sous film .avi. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

S3 de film supplémentaire : zoom avec niveaux de résolution différente dans la SEM. Film créé en et exportés du logiciel Atlas 5 au format .mp4. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Un flux de travail afin de cibler des cellules spécifiques dans un tissu par multimodale AT hiérarchique a été démontrée : un échantillon enrobées dans la résine est tranché vers le haut dans les tableaux de coupes sériées, qui sont placés sur un substrat conducteur à l’aide d’un porte-substrat sur-mesure. Après marquage avec un fluorophore et imagerie de la FLM, le volume reconstruit est utilisé pour sélectionner les cellules cibles. Après que coloration supplémentaire tours avec des métaux lourds qui va présenter le contraste, ces objectifs sont imagés sur plusieurs sections de centaines à résolution nanométrique dans une SEM à l’aide d’une plate-forme logicielle automatisée.

Pour produire des tableaux avec plusieurs longs rubans, un porte-substrat similaire à celle décrite ici est nécessaire. Une personne habile et patiente peut être en mesure de fixer plusieurs rubans sur un substrat de silicium, semi immergé dans le bateau de couteau et de récupérer le tableau en abaissant progressivement le niveau d’eau jusqu'à ce que les rubans sont assis sur le substrat. Toutefois, dans le notre expérience, on a tendance à éclater en formation lorsque le substrat est en contact avec n’importe quelle partie du bateau couteau (cf. Remarque dans la section 1.3.2 dans le protocole). En outre, cette procédure est beaucoup plus difficile avec des substrats enduits ITO : (1) grâce à la transparence du verre-ITO, il est difficile de voir le bord de l’eau où les extrémités des rubans doivent être joints ; et (2) parce que la surface enduite ITO est beaucoup plus rude que la plaquette de silicium poli, les rubans ont tendance à casser pendant le levage et petits fragments composé de quelques tronçons peuvent flotter, détruisant ainsi l’ordre des sections.

Le workflow entier est aussi possible et sans corrélation avec les données de la FLM. Dans ce cas, la collecte de données dans le SEM peut-être avoir à accomplir lors de plusieurs séances. Une reconstruction 3D initiale ou du moins l’évaluation des données de faible ou moyenne résolution peut être nécessaire d’identifier les cibles. En outre, les colorants histologiques conventionnels pour fond clair LM (FLM pas exigeant) peuvent être appliqués. Bien sûr, les autres options^6,,^7,8 sont anticorps étiquettes apposées sur les tableaux, comme déjà démontré dans le document initial sur¹⁸, ou génétiquement codé protéines fluorescentes (XFPs) ou enrobage préalable d’étiquetage avec préservation de la fluorescence au cours de la préparation de l’échantillon.

Une limitation générale de la méthode discutée est l’utilisation de sections d’une certaine épaisseur et l’échantillonnage discret résultant du volume 3D : résolution en Z ne peut être aussi bonne que l’épaisseur des sections puisque la SEM recueille des seules données de la surface de section (d elon l’énergie énergie primaire/atterrissage sélectionné). Cela signifie que le volume 3D a voxels anisotropes, par exemple., 5 x 5 x 100 nm³ si 100 sections nm et une taille de pixel d’image de 5 nm sont utilisés. Pour les très petites entités dans une portée de taille inférieure à 1 µm, cela peut-être pas suffisante pour obtenir une vraie description ultrastructurale. Une limitation plus technique est la précision de la scène utilisée dans la SEM pour automatisé d’imagerie. Pour cette raison, il est nécessaire de choisir un retour sur investissement dépasse les spécifications de la précision de la scène afin de garantir que la zone cible complet est photographiée.

Par rapport à la SBF-SEM et FIB-SEM comme méthodes d’imagerie de l’îlot, corrélatif AT a le désavantage définitif de voxels anisotrope, tel que décrit ci-dessus. Avec FIB-SEM, des voxels isotropiques de 5 x 5 x 5 nm³ peut être obtenus lorsqu’une correction de dérive appropriée est en place.

Les lacunes dans le volume reconstruit en raison de la perte des articles lors de la préparation des tableaux peuvent être aussi un sujet de préoccupation qui n’est pas rencontrée avec SBF-SEM ou FIB-SEM Avec stabilisation bon ruban de colle, c’est habituellement seulement une question pour la dernière section d’un ruban : il pourrait être endommagé lorsque dégageant de la lame des couteaux à l’aide de la cil. Toutefois, selon notre expérience, la perte d’une section dans chaque sections de 20 à 50 n’influence pas d’image.

En revanche, la possibilité de colorer les tableaux confère bon signal et contraste pour l’imagerie SEM, même sur des échantillons faiblement métallisés comme l’anticyclone congelés apex racinaires illustré ici. Par conséquent, il n’est pas nécessaire de compromettre la préservation optimale de nombreuses fixation chimique et les étapes de la métallisation. En outre, des échantillons de routine du laboratoire de pathologie avec des degrés intermédiaires de métallisation livrer excellentes données¹⁰. Une telle amélioration du contraste après incorporation n’est pas possible pour SBF-SEM et FIB-SEM en général. En outre, étant donné que ces méthodes sont destructeurs, c'est-à-direconsommer l’échantillon pendant l’imagerie, hiérarchique d’imagerie sur sites et différentes résolutions ou imagerie répété aux points plus tard dans le temps est impossible. En principe, volumes illimités, composé de grandes FOVs (p. ex., jusqu'à plusieurs millimètres de cerveaux de souris tout en connectomics) créé par piqûre des mosaïques, et grand nombre de sections peut être acquise par AT, tandis qu’en FIB-SEM, FOVs au-delà de 100 µm x 100 µm sont difficiles à atteindre avec des instruments courants.

Une automatisation supplémentaire du AT-workflow décrit serait un avantage certain, car les méthodes susmentionnées SBF-SEM et FIB-SEM effectuent de sectionnement et d’imagerie au sein d’un même instrument d’une manière entièrement automatisée. Il existe une sorte d’automatisation de sectionnement : The ATUMtome¹² peut générer et collecter des milliers d’articles, mais l’utilisation de ruban Kapton comme un substrat fait de tels tableaux difficiles à l’image dans un FLM. Sur les lamelles de ITO-enduit utilisé ici, l’imagerie même Super-résolution devrait être possible. Une cible de plus, très souhaitable pour l’automatisation serait l’enregistrement des piles de données FLM. En revanche, automation peut être coûteuse et sauf pour le porte-substrat, le flux de travail présentée ici s’appuie (en termes de matériel) que sur l’instrumentation habituellement disponible dans une routine EM laboratoire ou core installation, rendant faible niveau d’accès.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).