Summary
Ein Verfahren ist für die Fraktionierung von löslichen und unlöslichen mutierte Huntingtin Arten aus Maus Gehirn und Zelle Kultur beschrieben. Die beschriebene Methode eignet sich zur Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteins Flussmittel und hilft bei der Analyse von Protein-Homöostase in der Pathogenese der Krankheit und in Anwesenheit von Störungen
Abstract
Die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine ist zentral für Pathologie bei Chorea Huntington (HD) und vielen anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Insbesondere eine pathologische Hauptmerkmal der Huntington-Krankheit ist die anomale Ansammlung von mutierten HTT (mHTT) Protein in hochmolekularen komplexe und intrazelluläre Einschlusskörperchen bestehend aus Fragmenten und andere Proteine. Herkömmliche Methoden zu messen und zu verstehen, dass die Beiträge der verschiedenen Formen der mHTT-haltige Aggregate Fluoreszenz-Mikroskopie, western-Blot Analyse und Filter enthalten trap Assays.
Die meisten dieser Methoden sind jedoch bestimmte Konformation, und können daher nicht die volle staatliche mHTT Protein Wandel aufgrund der komplexen Natur der aggregierten Löslichkeit und Auflösung lösen.
Für die Identifizierung der aggregierten mHTT und verschiedene modifizierte Formen und komplexe ist Trennung und Solubilisierung der zellulären Aggregate und Fragmente obligatorisch. Hier beschreiben wir eine Methode um zu isolieren und zu visualisieren, lösliche mHTT, Monomere, Oligomere, Fragmente und eine unlösliche hochmolekularen (HMW) angesammelt mHTT Arten. HMW mHTT tracks mit Fortschreiten der Erkrankung mit Maus Verhalten anzeigen entspricht, und hat durch bestimmte therapeutische Interventionen1nutzbringend moduliert wurden. Dieser Ansatz kann mit Mausgehirn, peripheren Geweben und Zellkulturen verwendet werden aber kann auf andere Modellsysteme oder Krankheit zusammenhängen angepasst werden.
Introduction
Die Unterbrechung der Protein-Qualitätskontrolle-Netzwerke, die korrekte Faltung sicherstellen und Abbau von zellulären Proteinen ist wahrscheinlich im Zentrum Pathologie in der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und anderen "Protein misfolding" 2,3-Störungen. Ein detailliertes Verständnis der Proteostase-Netzwerk-Komponenten und ihre Beiträge zur Pathologie sind daher entscheidend für verbesserte therapeutische Interventionen zu entwickeln. HD wird durch die abnorme Erweiterung des CAG-Wiederholung innerhalb des Huntington-Gens, wodurch eine erweiterte Strecke der Polyglutamines (PolyQ) im Huntingtin (HTT) Protein4verursacht. Konsequente zeichnet pathologischen HD Pathogenese sich der daraus resultierenden Fehlfaltung, Anhäufung und Aggregation von HTT in Regionen des Gehirns und in peripheren Geweben, die nachweislich in mehrfacher Hinsicht stören normale Zelle Homöostase und Funktion 5 , 6. während HTT drückt sich ubiquitär, mittelgroße bedornten Neuronen im Striatum sind selektiv anfällig und meist offen betroffenen mit bemerkenswerten kortikale Atrophie, die auch im Zusammenhang mit HD Pathogenese.
Die Bildung von Aggregaten des HTT in das Gehirn von Huntington-Patienten und Tiermodellen hat in der Regel als Proxy-Marker für die Progression der Erkrankung und Dominant-Negative Verstärkung der Funktion für mHTT7serviert. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche, die Protein misfolding und Aggregation mHTT-induzierten Toxizität beitragen können, unklar bleiben, ist die Bildung dieser Einschlüsse im Gehirn von Huntington-Patienten und verschiedenen Tiermodellen eine Invariante und unvermeidbare Funktion. Einschlüsse auftreten, besteht weitgehend aus angesammelten HTT-Fragmente mit der N-terminalen erweitert PolyQ, darauf hinweist, dass Proteolyse und Verarbeitung von Full-length HTT sowie Alternative Spleißen8,9 spielen kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese der HD. N-terminale HTT Fragmente kann eine pathologische Form der HTT darstellen, die schnell zu aggregieren, Siedelinie, und beschleunigen oder propagieren die Aggregation Prozess10.
Das Vorhandensein dieser Einschlüsse korreliert jedoch nicht unbedingt mit HTT-induzierten Toxizität oder Zelle Tod11. HTT ist vorgeschlagen worden, eine Aggregation von einem löslichen Monomer durch lösliche Oligomere Arten und β-Sheet Fibrillen unlösliche Aggregate und Einschlüsse12durchlaufen. Diese verschiedenen Protein-Arten über standard biochemischen Assays zu lösen ist eine Herausforderung im Bereich aufgrund ihrer Stabilität in niedrig-Reinigungsmittel-Lyse Puffer und Schwierigkeiten bei der Visualisierung mit standard biochemischen Assays gewesen. Somit sind methodische Überlegungen entscheidend bei der Aufdeckung der Grad und die Muster der kumulierten und aggregierte mHTT.
Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zum mehrere Zwischenprodukte der HTT, speziell die Bildung einer unlöslichen HMW HTT-Spezies zu visualisieren, die offenbar eng mit HD Pathogenese und Krankheit Fortschreiten1,13 verfolgen ,14. In der Lage, zu beheben und verfolgen Sie mehrere Arten von mHTT bietet Forschern eine biochemische Tool zur Pathogenese der Krankheit untersuchen und bewerten mögliche therapeutische Interventionen durch Modulation und Auswirkungen auf die Pathogenese der Krankheit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tier-Ethik-Anweisung - Experimente wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health und einer genehmigten Tierversuche-Protokoll von der institutionellen Animal Care und Use Committee ( IACUC) an der University of California, Irvine, ein AAALAC akkreditierte Institution. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Leiden der Tiere zu minimieren.
1. Vorbereitung der Lyse Puffer
- Vorbereiten "Wasserlöslich" Lyse-Puffer (10 mM Tris pH 7.4, 1 % Triton X 100, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin) und Sterilfilter durch 0,22 µm-Filter.
- Für eine funktionierende "Wasserlöslich" Lyse Puffer messen N-Ethylmaleimide (NEM) und gründlich lösen sich in 100 mM Phenylmethysulfonyl Fluorid (PMSF) aufgelöst in 100 % EtOH.
Hinweis: Lysis Puffer-Hemmer: (i) 20 mM N-Ethylmaleimide (NEM); (Ii) 0,2 mM PMSF; (Iii) 1 mM Natrium Orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL Leupeptin; (V) 1 µg/mL Aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluorid (NaF).
Achtung: Tragen Sie eine Gesichtsmaske bei der Arbeit mit NEM im gesamten Protokoll. Lyse Puffer arbeiten muss frische, aktive Inhibitoren zu gewährleisten erfolgen. - Für lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren, fügen Inhibitoren in der folgenden Reihenfolge: Natriumfluorid (NaF), Volumen mit kalten Lyse Puffer, Natrium Orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin und Leupeptin.
- Für eine funktionierende "Wasserlöslich" Lyse Puffer messen N-Ethylmaleimide (NEM) und gründlich lösen sich in 100 mM Phenylmethysulfonyl Fluorid (PMSF) aufgelöst in 100 % EtOH.
- Für "Unlösbaren" Lyse Puffer Ergänzung zu 4 % SDS durch Zugabe von 500 µL 20 % SDS auf 2 mL "Lösliche" Lyse Puffer. Lassen Sie bei Raumtemperatur.
Hinweis: SDS wird sich überstürzen, wenn bei 4 ° C aufbewahrt; Beachten Sie dies bei Raumtemp. Endgültige Lysis Puffer Zusammensetzung: 10 mM Tris (pH 7,4); 1 % Triton x-100; 150 mM NaCl; 10 % Glycerin; 4 % SDS (nur unlösliche).
(2) lösliche/unlösliche Fraktionierung Protokoll
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen Schaltplan.
- Zwei Sätze von Rohren für jede Probe zu kennzeichnen: "Lösliche" und "Unlöslich."
- Fügen Sie X µL eiskalte arbeiten lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren (siehe 1.1.1) Gewebe ergänzt hinzu.
Hinweis: X = Volumen variiert je nach Gewebe; Siehe Tabelle 1. - Für die Maus Hirngewebe (d.h. Striatum) beschriftet Dounce langsam 30 Mal in Glas 1 mL Douncer und Pipettieren in "Unlöslich" Rohr (halten auf Eis).
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu brechen Oberfläche der Flüssigkeit nach dem Start von Douncing, wie Luftblasen bilden und möglicherweise unvollständig Homogenisierung führen. - Zellen (d.h., HeLa, HEK293T) Spülen Sie in Zellen einmal mit kalten, 1 X PBS. Entfernen Sie PBS und minimalem Volumen der Lyse Puffer auf Zellen anwenden und heben mit Zelle Schaber.
Hinweis: Für über Zell-Linien, Zellen waren vergoldet 5 x 105 Zellen pro 6-well-Platte und Konfluenz in der Nähe von gewachsen. Man ist gut vergleichbar mit Volumen für Maus Striatum verwendet. - Transfer Homogenat oder Zelle lysate in beschriftet, "Unlösbaren" Röhren und lyse auf Eis 1 h (Startuhr nach letzten Rohr verarbeitet wird).
Hinweis: Für die Zelle Lysates genannte mehrmals Zelle Klumpen vor Beginn der Inkubation aufzubrechen. Vermeidung von Blasenbildung. Vortex Puls kurz jede Probe für 1 s auf halbem Weg durch Lyse. - Zentrifugieren Sie Proben bei 4 ° C bei 15.000 x g für 20 Minuten.
- Überstand als "Lösliche" Bruch zu erholen.
- Entfernen Sie mit pipettieren, achten Sie darauf, Pellet/trübe Schicht zu stören, da dies den Bruchteil verunreinigen wird. Pipettieren löslichen Anteil in "Lösliche" mit der Bezeichnung Rohr. Halten Sie auf dem Eis.
- Waschen Sie nach jedem Waschen Pellet mit 500 µL Puffer lyse (x2) und Zentrifuge bei 4 ° C bei 15.000 x g für 5 min; Es ist okay, wenn einige der trübe Schicht ist aus pipettiert.
- Nach dem letzten Waschen entfernen Sie alle verbleibenden Waschpuffer verlassen nur das Gewebe Pellet.
Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt sind unlösliche Proben jetzt bei Zimmertemperatur aufzubewahren. - Aufschwemmen Pellet mit X-µL-Lyse-Puffer mit 4 % SDS ergänzt (Lautstärke kann eingestellt werden, je nach Größe der Pellets; siehe Tabelle 1).
- Beschallen Sie jede Probe für 30 s bei Raumtemperatur mit einer Sonde Sonikator (125 Watt, 20 kHz, Puls, Amplitude 40 %, siehe Tabelle der Materialien).
- Kochen Sie Proben (rollende Kochen) für 30 min; Zentrifugieren Sie kurz (15 s) bei 6.000 x g, jede Probe nicht zu verlieren.
- DC (Reinigungsmittel kompatibel) Protein Assay durchzuführen (siehe Tabelle der Materialien) oder Lowry Protein Assay, Proteinkonzentration (empfohlen begann Verdünnungen von 1/5 der Probe im jeweiligen Lyse Puffer für die Zellkultur und 1/10 für Gewebe Lysates) zu messen.
Hinweis: Proteinkonzentrationen müssen mit einen DC oder Lowry-Assay aufgrund der hohen Konzentration Waschmittel gelesen werden. - Aliquoten Proben in 50 µL Batches, Frost-Tausalz-Probleme zu vermeiden.
Hinweis: Protokoll kann hier vor weiteren biochemischen Analyse angehalten werden, indem Sie speichern beide Fraktionen bei-20 ° C.
3. Western-Blot und Quantifizierung
- Führen Sie westliche Flecken wie berichtet an anderer Stelle1,13 durch Verdünnung 30 µg Probe 1:1 im Ladepuffer (1.6 x laden Farbstoff, 1 x Reduzierung).
Hinweis: 30 µg Protein pro angebrochene reicht jedoch für optimale Auflösung eingestellt werden. 3 - 8 % Tris-Acetat Poly-Acrylamid Gele sollten für den unlöslichen Anteil verwendet werden. 4 - 12 % Bis-Tris Gele sind für die löslichen Fraktion empfohlen. - Proben (rollende Kochen) für 5 min. Zentrifuge kurz kochen (15 s) bei 6.000 x g Probe zu sammeln.
- Bruchteile von SDS-PAGE und western-Blot, laut Protokoll des Herstellers für reduzierte Proben zu analysieren.
Hinweis: Unlösliche Fraktion löst am besten, wenn auf 0,45 µM Nitrozellulose-Membran übertragen. 0,45 oder 0,2 µM Nitrozellulose einsetzbar für die löslichen Fraktion, abhängig von der Größe des Proteins des Interesses. Einige Optimierungen sein für beste Übertragung der HMW Materialien erforderlich. - Färben Sie Membran mit ganzen Protein Fleck (z. B.MEMcode, siehe die Tabelle der Materialien), Protein laden Effizienz zu visualisieren.
Hinweis: Westliche Flecken können durch mittlere Pixel Intensität analysiert werden. Löslichen Brüche können zu einem Haus-halten Protein am besten geeignet für das experimentelle System normalisiert werden. Unlösliche Bruch als relative Protein Fülle wurde durch reversible Protein beflecken oder Histon 3 Normalisierung auf separaten Blot überprüft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Auflösung von löslichen und unlöslichen Zelle Lysates nach Fraktionierung kann mit westlichen Analyse und Filter Retardierung Assays (Abbildung 2) erkannt werden. Als Beispiel HEK293T Zellen wurden transfiziert mit Transfection Reagens (z.B. Lipofectamine 2000), mit HTT Exon 1 Codierung cDNA enthält 97 Glutamin wiederholt15 gefolgt von Poly Prolin reiche Region und durften diese Zellen Express für 44 h. Zellen behandelt wurden mit entweder 5 µM MG132, das Proteasom zu blockieren oder DMSO als Steuerelement für 18 h vor der Ernte und lysierten wie oben beschrieben. Nach der Fraktionierung Protokoll löst mutierten HTT Exon 1 als lösliche Monomer rund 45 kDa auf 4-12 % Bis-Tris Seite Gele und als HMW unlösliche angesammelten Spezies auf 3 bis 8 % Tris-Acetat Seite Gele (Abbildung 2A). Lösliche Monomer kann quantifiziert und normalisiert zu einem Haus-halten-Protein (gezeigt hier als GAPDH). HMW, unlösliche mHTT wird als relative Protein Fülle durch mittlere Pixel Intensität quantifiziert. Wenn mit dem Inhibitor MG132 behandelt, sinkt spürbar in lösliche Monomer des mHTT zusammen mit einer entsprechenden Erhöhung HMW, unlösliche mHTT.
Unlösliche Brüche können durch zusätzliche Techniken wie einen Filter Retardierung-Assay aufzulösenden unlöslichen, fibrillären mHTT16 (Abb. 2 b) analysiert werden. HeLa-Zellen wurden in ähnlicher Weise wie oben beschrieben mit 97Q HTT Exon 1, und seine-SUMO-1 oder seinem SUMO 2 transfiziert. Zellen wurden für 18 h vor der Fraktionierung mit DMSO oder MG132 behandelt und mit western-Blot und Filter Retardierung Assays analysiert. Daten zeigen, dass das Vorhandensein von überexprimieren SUMO-Isoform HMW und fibrillary unlöslich mHTT erhöht. Zusatz von MG132 verschärft die Zunahme der unlöslichen mHTT Arten. HWM mHTT Arten können auch durch Überexpression oder Reduzierung der HD-Krankheit Ziel, PIAS1 in beiden HeLa Zellen13 und Maus Striata1 (Abbildung 2-D) moduliert werden. Knockdown von PIAS1 in der schnell voranschreitenden Mausmodell der Huntington-Krankheit, die R6/2, mit viralen Lieferung von einem SiRNA gegen PIAS1, reduziert die Ansammlung von HMW unlösliche mHTT. Virale Überexpression des PIAS1 in R6/2-Mäusen führt zu einer bemerkenswerten Zunahme HMW unlösliche mHTT (Abb. 2D)1. Die Veränderung der Löslichkeit zwischen Brüchen ist quantifizierbar und zeigt, dass dieses Protokoll Modulation von pathogenen mutierten Proteins Arten, so dass dies eine geeignete Technik für die präklinische biochemische Beurteilung der Krankheit Intervention verfolgen kann. Änderungen in unlösliche fibrillären Arten von mHTT erfassen auch Flussmittel zwischen Protein-Arten, die durch Behandlung mit MG132 oder Regulierung der mögliche therapeutische Ziele, z. B. PIAS11moduliert werden.
Abbildung 1: lösliche/unlösliche Fraktionierung Protokoll und Protein Auflösung. (A) visuelle Pipeline zur Fraktionierung Protokoll. Das hier beschriebene Protokoll auf Maus Gewebe- oder Kultur Proben angewendet werden kann aber eignet sich zur Anpassung an andere Probentypen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vertreter ergibt sich für lösliche und unlösliche Fractionations und Analysen. (A) lösliche und unlösliche Fraktionen aus HEK293T Zelle Lysates gelöst auf eine 4-12 % Bis-Tris und 3-8 % Tris-Acetat Seite Gele, respektvoll. Lösliche Anteil normiert auf GAPDH Ladekontrolle zeigt Schwankungen des mHTT Exon 1 lösliche Monomer basierend auf Exposition gegenüber MG132. Unlöslichen Anteil zeigt, dass HMW gesammelten Arten von mHTT auch durch MG132 Behandlung moduliert werden. (B) Analyse der löslichen und unlöslichen Fraktionen aus HeLa-Zelle Lysates western Blot und Filter Retardierung Analysen: HeLa-Zellen wurden mit seinem SUMO-1 oder SUMO-2 und/oder 97Q HTT Exon 1 transfiziert und behandelt mit 5 µM MG132 für 18 Std. (C) Lösliche und unlösliche Fraktionierung von HeLa-Zellen überexprimiert 97Q HTT Exon 1 und entweder überexprimiert PIAS1 oder behandelt mit SiRNA gegen PIAS1-Show-Regelung der HMW mHTT Akkumulation nach Modulation eine mögliche therapeutische target.* (D) Unlösliche Fraktionen aus Maus Striata mit MicroRNA gegen PIAS1 behandelt und 3-8 % Tris-Acetat Seite Gele zeigen Modulation der HWM unlösliche mHTT ** gelöst. Seitenteile (B-C) wurden mit Erlaubnis13geändert. Panel (D) wurde mit Erlaubnis1geändert. * Nachdruck aus O'Rourke Et Al. 13 mit Berechtigung. ** Nachdruck aus Ochaba Et Al. 1 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Gewebe (pro Hemisphäre) | Ungefähre Gewicht (mg) | Volume löslich (µL) | Volume unlöslich (µL) |
| Maus Striatum | 30 | 250 | 150 |
| Maus Cortex | 100 | 500 | 250 |
| Maus Hippocampus | 30 | 250 | 150 |
| Maus Kleinhirn | 40 | 250 | 150 |
| Maus skelettartigen Muskel * | 100 | 300 | 150 |
| Maus Leber (Lappen) | 100 | 400 | 200 |
| * Bindegewebe bildet milchig Schnittstelle; entfernen, um Verunreinigungen zu vermeiden | |||
Tabelle 1: Bände (X) für gewebespezifischen Fraktionierung für beide löslichen und unlöslichen Lyse Puffer vorgeschlagen. Unlösliche Lyse Puffervolumen anhand der Menge des Materials, die angepasst werden können entsprechend basierend auf unlösliche Pellet Größe ab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Für die oben genannten Protokolle, konsistente und quantitative Ergebnisse zu gewährleisten sind einige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Erstens mHTT in beiden Fraktionen bilden spontan Aggregate im Laufe der Zeit auf mehrere Einfrieren-Tau-Zyklen, insbesondere in hoher Konzentration. Es ist also entscheidend für Aliquote die Protein-Preps Einfrieren und Auftauen nur das benötigte Volumen vor dem Ausführen des Tests, wie im obigen Protokoll beschrieben. Wenn unlösliche Fraktion weiß Fällungsmittel beim Auftauen ergibt, kann Rekonstitution weiter, durch eine zusätzliche 5 s Beschallung Puls, 5 min kochen und erneute Quantifizierung vor der Analyse über biochemische Tests notwendig sein.
Quantitative Auflösung dieser Assay ist erreichbar durch die Normalisierung der mittleren Pixel Intensität der löslichen Fraktion darauf einen Laden oder Housekeeping Gene in jeder Probe. Wie hier gezeigt, GAPDH als Zimmermädchen gen für die löslichen Fraktion diente als es überwiegend um die Zellflüssigkeit (Abbildung 1) lokalisiert. Andere häufig verwendete Housekeeping Proteine sind Aktin, α-Tubulin und Erk 1/2. Jedoch sollten geeignete Normalisierung Proteine für das System untersucht dafür ein Steady-State Ausdruck für genaue und unbeeinflusste Normalisierung optimiert werden. Während der unlösliche Anteil als grobe nuklearen Bruch dient vom Vorhandensein von Histon 3 und Mangel an GAPDH1gesehen, verwendet Auflösung auf 3 bis 8 %, die Seite häufig Grenzen Nachweisbarkeit, Gele nuklearen Marker. Daher eignet sich der unlösliche Anteil zur Quantifizierung mithilfe den Rohsignal Intensitätswert als relative Darstellung der Protein-Fülle. Jedoch ganze Protein Marker wie reversibel Protein Flecke, dienen zur Kontrolle für Variationen im Protein geladen und können als ein Normalisierungsfaktor für unlösliche Bruchteil angepasst werden.
Fraktionierung ein Mittel zur Lösung von löslichen und unlöslichen mHTT Arten bietet, erfährt mHTT darüber hinaus zahlreiche Konformationsänderungen während Krankheit Pathogenese, von denen einige nicht in der unlösliche Fraktion unterscheiden. Darüber hinaus können einige Konformationen nutzbringend zur Krankheit Ergebnis beitragen und fungieren als stabile Abstand Zwischenprodukte. Es ist daher wichtig, andere mHTT Umformer, die korrelieren mit Ergebnissen für die Krankheitsentstehung zu identifizieren. Einige Optimierungen eventuell andere mHTT Zwischenprodukte zu visualisieren. Um dieses Problem anzugehen, kann SDS Prozentsatz auf 20 % erhöht werden, wenn das Aggregat resistent ist gegen Konzentrationen senken.
Dieses Protokoll zeigt Protein Fraktionierung Bedingungen und daraus resultierende Assays, die verschiedenen Konformationen und Fragmente von mHTT Akkumulation und Aggregation in Zellkultur und einem transgenen Mausmodell der Huntington-Krankheit zu erkennen. Diese Art der biochemischen Protein Isolierung ist für die Beurteilung des Fortschreitens der Krankheit in anderen HD-Modelle vorgestellt und kann dazu beitragen, das wachsende Verständnis von mHTT Dynamik innerhalb der Zelle und ihre Auswirkungen auf die Pathologie der Krankheit.
Nach der Fraktionierung können Proben in vielfältiger Weise verarbeitet werden. SDS-PAGE gefolgt von western-Blot Analyse löst löslichen und unlöslichen mHTT Spezies um eine relative Bewertung auf Ebenen mHTT Arten1liefern. Es ist auch möglich, Brüche in zusätzliche biochemische Tests mHTT Arten einzuschätzen zu bewerten. Zum Beispiel kann Agarose-Gelelektrophorese (Alter) lösen und löslich, Oligomere mHTT, zu erkennen, während ein Filter Retardierung (FR)-Assay ein leistungsfähiges Werkzeug ist, unlöslichen, fibrillary mHTT Arten16,17zu erkennen.
Ein weiterer Vorteil dieser Assay präsentiert ist die Bewertung von Protein Mislocalization Pathogenese zugeordnet. Wie wir in 18gezeigt, ermöglicht dieses Protokolls Fraktionierung der Visualisierung und Verfolgung von Proteine wie Rangap1, die offenbar durch große unlösliche Aggregate abgesondert werden und kann nicht auf einem standard Seite Gel lösen. Darüber hinaus dieser Assay dient auch als eine grobe nukleare/zytoplasmatischen Trennung, kann man auch Mislocalization von Proteinen, z.B., p65, in HD Maus Modelle1messen.
Eine prominente Motivation für die Analyse von mHTT Aggregation und Akkumulation ist die Entwicklung von neuartigen HD Diagnostik und Therapie. Verbindungen, die hemmen oder umkehren mHTT Aggregation wurden von Hochdurchsatz-Bildschirme und gezielte Tests1,12,19,20,21identifiziert. Aber war angesichts der Schwierigkeiten bei der Lösung vieler Formen von mHTT, Bewertung der Aggregation Modulation nicht immer machbar. Traditionelle Lyse Methoden können entsorgen gebeizte Zelltrümmer, die potenziell unlösliche aggregate Protein enthalten, oder Lyse Puffer können nicht genug Waschmittel für Solubilisierung enthalten. Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform für die Isolierung und Erkennung von aggregierter Form des mHTT, die als biochemische Marker in zellbasierten oder vorklinischen in-Vivo -Tests verwendet werden kann.
Die hier beschriebenen Assays können auf andere fehlgefaltete Proteine angewendet werden. Aufgrund der dynamischen Funktion fehlgefaltete Proteine können diese Tests effektiv mit anderen Analysen aufzudecken eingehende Mechanismen der Protein-Homöostase und Aggregation gekoppelt werden. Diese Analysen umfassen Messung der Steady-State-Ebenen der Aggregate und deren Partitionen in andere Zelle Fraktionen (Abbildung 1) oder Analyse der Faltung/Proteinaggregation mit gereinigten rekombinanter Proteine. Diese Tests helfen, um direkte oder indirekte Beeinflussung der genetischen oder pharmakologische Modulation Proteinabbau bzw. Aggregation zu unterscheiden. Aufbauend auf bisherigen in-vitro- pro-Synuclein fraktioniert Aggregation Bewertungen22, haben wir seit dieser Arbeit zu der Parkinson-Krankheit Mausmodellen aufzulösenden verschiedenen Konformationen von pro-Synuclein23angewendet. Daher Protokolle in dieser Arbeit beschriebenen zu anderen Modellen der Fehlfaltung von Proteinen und Aggregation angewandt werden, und können dazu beitragen, die Entdeckung und Entwicklung neuer Therapeutika auf aggregierte Proteine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das NIH (RO1-NS090390) unterstützt. Wir möchten auch danke Dr. Joan Steffanfor technische Hilfe und Diskussion während der Entwicklung des Assays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
