DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

요약

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA 분자를 얼룩이 지는 과학자를 실험 기간 동안 그들을 볼 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법에서 DNA 분자는 미리 형광 염료와 스테인드 하 고 메 틸 화 및 비 메 틸 화 과민 한 금지 효소로 소화.

초록

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA의 시각화 cyanine 염료 등 염료의 다양 한을 사용합니다. 이 염료는 DNA에 대 한 그들의 높은 선호도와 감도 활용 됩니다. DNA 분자는 실험의 완료 후 전체 길이 인지 파악 하는 방법 스테인드 분자 DNA를 제한 효소로 소화 하 여 전체 길이 인지 확인 필요 합니다. 그러나, 스테인드 DNA 메서드 하나 형광 색소를 사용할 수 있는 어떤 효소 DNA 스테인드 결정 하는 데 필요한 그래서는 효소를 억제 수 있습니다. 이 방법에서는 DNA는 염료 및 DNA equilibrate를 하려면 밤새 cyanine 염료와 스테인드. 다음, 스테인드 DNA는 제한 효소로 소화, 젤에 로드 이며 electrophoresed. 실험적인 DNA 다이제스트 밴드 제한 효소의 활동을 결정 하기 위해 실리콘에 다이제스트 비교 됩니다. 만약 예상 대로 동일한 수 밴드의 있으면, 반응 완료 됩니다. 더 밴드 부분 소화를 나타내는 예상 보다 적은 밴드 불완전 소화를 나타냅니다. 이 방법의 장점은 단순 하 고 그것은 그 과학자는 제한 효소에 대 한 필요 장비를 사용 하 여 시험 하 고 젤 전기 이동 법. 이 방법의 한계는 대부분의 과학자 들은 수 효소는 상업적으로 이용 가능한 효소; 그러나, 어떤 제한 효소 사용 될 수 있습니다.

서론

토토 시리즈 (토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 그리고 보 보-3; 표 1) DNA의 시각화가 필요한^{1,2,3,,45,6,7,} 실험의 다양 한 활용 ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15}

프로토콜

1. 염료, 버퍼의 Agarose 젤 준비

1. 얼룩이 DNA 또는 스테인드 DNA의 소화에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
   1. 1 x 테 (Tris HCl 및 ethylenediaminetetraacetic 산; 준비 EDTA) 버퍼 10 mM Tris HCl과 1 mM EDTA 졸업된 실린더 또는 부피 측정 플라스 크를 사용 하 여. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.
   2. 각 염료의 aliquots 만들기: 토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 보 보-3 (표 1). 어두운 주황색으로 1mm 염료의 4 µ L 플라스틱 또는 블랙 1.5 mL 튜브 및 1 x 테의 36 µ L을 추가, 피 펫을 사용 하 여 혼합 이 집중은 100 µ M 염료 솔루션 (총 40 µ L)입니다. 각 염료에 대 한이 단계를 완료 합니다. 4 ° c.에 게
      참고: photobleaching 또는 염료의 저하를 방지 하기 위해 빛을 염료를 노출 하지 마십시오.
   3. 1 10 mM Tris, Bis, HCl, 프로 판, 10 m m MgCl₂및 100 µ g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 버퍼 2 50 mM ....

결과

경우 intercalating 염료는 DNA를 소화 하는 제한 효소에 영향을 미칠 것 이다, 단계의 올바른 순서로 되어야 합니다 확인 (그림 1)를 따 랐 다. 일단 DNA 스테인드 이며 특정된 효소로 소화, 조각 및 그들의 크기 (그림 2)의 수를 결정 하 젤의 그림을 취할 수 있습니다. 위하여 효소 효율을 보이는 밴드의 수로 나눈 예상된 보이는 밴드의 총 수를 결정 합니다. 효소 효율 같게 화합, 밴드의 수를 예상 하는 경우 및 본된 일치. 다음 예상 젤에 더 많은 밴드 들이 있다면, 값 1 보다 큰 이며 부분적으로 소화 반응을 나타냅니다. 적은 밴드 예상 다음 경우 다음 값 1 미만, 불완전 소화를 나타내는입니다. 그림 2a, 밴드의 이동성은 감소 하 고, 3, 4 차선 표시에에서 우물 쪽으로 이동 하는 악.......

토론

붙일 레이블된 DNA (그림 1)을소화 하기 위해 일련의 단계를 제시해 주셔야 합니다. 첫째, DNA 하룻밤는 형광 색소로 얼룩진입니다. DNA 수 있습니다 알을 품 cyanine 이합체와 시간;의 짧은 기간에 대 한 그러나, Carlsson 외. 발견 DNA 이중 밴드 때문에 불완전 한 얼룩²⁰각 DNA 크기에 대 한 만든. 이 문제를 해결 하려면 DNA 수 있습니다 얼룩이 질 더블 밴드 발생 하지 않도록 하려면 하룻밤. 이 프로토콜에 중요 한 단계입니다. 염색 하지 오래 충분 한 시간 동안 incubated, 염료-DNA 평형 되지 않을 수도 있습니다 하 고 더블 밴딩 패턴을 줄 것 이다. 이 발생 하는 경우 시간이 더 긴 기간에 대 한 equilibrate를 DNA 염료 혼합을 수 있습니다.

다음, 제한 효소 DNA 염료 혼합에 추가.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메틸화되지 않은 람다 DNA	NEB	N3013S
YOYO-1	ThermoFisher Scientific	Y3601
TOTO-1	ThermoFisher Scientific	T3600
POPO-1	ThermoFisher Scientific	P3580
BOBO-1	ThermoFisher Scientific	B3582
YOYO-3	ThermoFisher Scientific	Y3606
TOTO-3	ThermoFisher Scientific	T3604
POPO-3	ThermoFisher Scientific	P3584
BamHI	NEB	R0136S
PmlI	NEB	R0532S
ScaI	NEB	R3122S
EcoRI	NEB	R0101S
HindIII	NEB	R0104S
SmaI	NEB	R0141S
트리스	피셔	BP152-1	자극성
EDTA	피셔	S316-212	독성
HCl	피셔	S25358	부식성 및 자극성
버퍼 1	NEB	B7201S	NEB 1.1
버퍼 2	NEB	B7202S	NEB 2.1
버퍼 3	NEB	B7204S	NEB Cutsmart
고겔화 온도 아가로스 젤	Lonza	50041
아세트산	Fisher	S25118	위험한
블루 라이트 트랜스일루미네이터	다크 리더	DR196	올바른 안경을 착용하세요
에티듐 브로마이드	피셔	15585011	발암 물질; 다른 대안으로는 Nancy 520, Gel red 등이 있습니다.
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Power Pac 기본 전원 공급 장치	Biorad	1645050
Ficoll	Fisher Scientific	BP525-25
브로모페놀 블루	Fisher Scientific	B-392
크실렌 시아놀	Eastmen	T1579