Summary
Nucleïnezuur afbraak in archivering weefsel, tumor heterogeniteit, en een gebrek aan vers bevroren weefsel monsters kan negatieve invloed hebben op kanker diagnostische diensten in pathologie laboratoria wereldwijd. Dit manuscript wordt beschreven voor het optimaliseren van een panel van biomarkers met behulp van een multiplex magnetische kraal assay te classificeren van kanker van de borst.
Abstract
Nucleïnezuur afbraak in archivering weefsel, tumor heterogeniteit, en een gebrek aan vers bevroren weefsel monsters kan negatieve invloed hebben op kanker diagnostische diensten in pathologie laboratoria wereldwijd. Gene versterking en expressie diagnostische testen met behulp van archiefmateriaal of materiaal waarvoor vervoer naar onderhoud van laboratoria, moet een meer robuuste en nauwkeurige test aangepast aan de huidige klinische werkstromen. Ons onderzoeksteam geoptimaliseerd voor het gebruik van Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) te kwantificeren van RNA in archiefmateriaal gebruiken (bDNA) vertakt-DNA-technologie voor Luminex xMAP® magnetische kralen. De bepaling van gen expressie beschreven in dit manuscript is een roman, snel en multiplex methode die nauwkeurig van borstkanker in de verschillende moleculaire subtypes classificeren kan, het weglaten van de subjectiviteit van de interpretatie die inherent zijn aan beeldvormende technieken. Bovendien, kunnen als gevolg van de lage input van materiaal vereist, heterogeen tumoren laser microdissected met haematoxyline en eosine (H & E) gekleurd secties. Deze methode heeft een breed scala van mogelijke toepassingen, met inbegrip van de classificatie van de tumor met diagnostische mogelijkheden en meting van biomarkers in vloeibare biopsieën, waardoor betere patiëntenbeheer en monitoring van ziekten. Bovendien, is de kwantitatieve meting van biomarkers in archiefmateriaal nuttig in oncologie onderzoek met toegang tot bibliotheken van klinisch-geannoteerde materiaal, waarin retrospectieve studies mogelijke biomarkers en hun klinische resultaten valideren kunnen correlatie.
Introduction
Optimalisatie van RNA gebaseerd testen met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) archiefmateriaal is uitdagend als gevolg van de variabiliteit in chirurgische weefsel verwerking en afbraak van RNA veroorzaakt door formaline gebruikt voor weefsel integriteit behoud1, 2. Om te overwinnen de beperking van het uitvoeren van nauwkeurige gen expressie studies van archiefmateriaal, onze groep gebruikt de bDNA multiplex magnetische kraal assay. In plaats van enzymatische versterking van een doel-sjabloon gebruikt de technologie van bDNA kruising van specifieke sondes en versterking van een verslaggever signaal3. De korte erkenning sequenties van de vangst en detectie sondes zijn ontworpen om te vermengen tot korte fragmenten van RNA doel4. Bovendien, overwint het gebruik van weefsel homogenates als de directe grondstof in deze test, de onvermijdelijke verlies van RNA die voortvloeit uit de testen waarvoor voorafgaande RNA extractie en zuivering. Signaal versterking, het gebruik van korte erkenning sequenties, en de uitsluiting van een zuivering, bijdragen aan het verminderen in technische variant van de bepaling. De technologie biedt de mogelijkheid om de bepaling (maximaal 80 RNA doelen) multiplex en meten van de expressie van een panel van doelstellingen uit lage materiaal ingang. Dit protocol beschrijft de voorbereiding en de kleuring van weefselmonsters voor laser microdissection. Vlekken op de membraan dia's vergemakkelijken de beeldvorming van de tumor en histologische architectuur om nauwkeurige selectie en profilering van: (1) de tumor en normale buizen in borstweefsel en (2) de kwaadaardige cel klonen binnen heterogene tumoren.
Moleculaire classificatie van borstkanker is een proces dat moleculaire merkers ondervraagt te categoriseren patiënt tumoren in drie moleculaire klassen, dat wil zeggen, luminal, menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2)-verrijkt en basale subtype. Het HER2-verrijkt subtype is goed gedefinieerd, met hoge uitdrukking van de HER2 receptor, als gevolg van de ERBB2 gene amplificatie, gecombineerd met lage of afwezige oestrogeen receptor (ER) en progesteron receptor (PgR). Het luminal subtype is over het algemeen positief voor ER en het basale subtype in het algemeen negatief voor de drie receptoren (HER2, ER, PgR), en aanzienlijk overlappingen met de triple negatieve borst kanker (TNBC) diagnostische subtype5,6 zijn. Andere markeringen worden gebruikt om te bepalen van epitheliale en mesenchymale kenmerken. Fibronectine (FN1) is een hoofdbestanddeel van de borst weefsel mesenchymale compartiment. Verhoogde FN1 meningsuiting gaat gepaard met hoge Ki67 kleuring, en toont een handtekening voor een meer invasieve tumor7,8 en wordt geassocieerd met metastase9. Interessant, werd FN1 gevonden in microvesicles van oorsprong uit de tumorcellen, die activering van mitogene signalen in ontvangende fibroblasten10geïnduceerde aanwezig te zijn. Vandaar, circulerende microvesicles zoals exosomes een potentiële marker van vroegtijdige opsporing of metastase zijn en11terugvallen.
Selectie van de gebieden van de tumor voor borst kanker transcriptionele subtypering werd productlevering uitgevoerd door macrodissection12,13. We hebben om te overwinnen weefsel heterogeniteit en verhogen van de gevoeligheid, betrouwbaar klassieke weefsel kleuring met multiplex moleculaire profileren methoden gecombineerd. Als een bewijs van beginsel, zijn twee verschillende borst kanker klonen gedefinieerd door hun epitheliale mesenchymale handtekening en gemetastaseerde potentieel. De workflow van de beschreven protocol kan gemakkelijk worden vertaald naar de huidige klinische setup en gebruikt om selectief isoleren en karakteriseren van weefsel subtypen met behulp van gerichte mRNA profilering.
Protocol
Ethische goedkeuring voor het gebruik van borst weefsel materiaal in deze studie werd verkregen van de Universiteit onderzoek ethische Commissie (UREC) van de Universiteit van Malta (Ref: 22/2012).
1. de weefsels voorbereiding
- Met behulp van passende H & E procedures14, bereiden gebeitst referentie weefselsecties en digitaal scannen van dia's voor verwijzing tijdens microdissection.
- Gebruikend microtome, cut 20 µm weefsels secties op een waterbad RNAse-gratis bij 40 ° C. Verzamelen in de secties over membraan dia's voor laser-microdissection met behulp van schone, RNase-ontsmet apparatuur en materialen.
- De membraan dia's bij 37 ° C in een droogrek incubator's nachts droog. Vlek met behulp van de juiste H & E procedure15 met moleculaire biologie grade oplossingen en het vergroten van de kleuring tijd van Haematoxyline tot 6 min. Indien nodig, vlek de membraan dia's met de juiste immunohistochemische protocollen16.
2. laser Microdissection
- Stel de dia en kalibreren van de fase-beweging.
- De weergave van de laser op een leeg gebied van de dia van een membraan verplaatsen. Kalibreer de laser focus door het afvuren van een laser focus intervallen (5%) te verhogen tot de laser begint te doorboren via het membraan beschoten. Loting en microdissect elke vorm en finetune de laser focus op het maximaliseren van de efficiëntie van de laser tijdens de dissectie van de laser.
- Verhoog de snelheid van de fase-beweging tot een punt waar de laser dissectie efficiëntie geen afbreuk wordt gedaan. Kalibreren van de laser op het geselecteerde objectief en als het veranderen van de doelstellingen (laser tempo 1 – 15%), focus op 70-75%, en macht op 90-100% wanneer het streven naar 4 X opnieuw te kalibreren.
- Scan de gebeitst membraan dia's met behulp van de 4 X doelstelling.
- Selecteer en omsingelen van de doelgebieden voor microdissection op de dia membraan. Laser ontleden een minimumoppervlakte van 42 mm2. Record het gebied ontleed om te bepalen van de omvang van de steekproef homogenisator buffer te worden gebruikt.
- Het GLB lift mechanisme gebruiken om op te halen de ontleed sectie op de diffusor caps van gelabelde buizen aangesloten op de juiste aanhangsel. Als de ontleed sectie wordt niet opgehaald op het GLB, herhaal de dissectie van de laser van het gebied.
3. de weefsels Lysis
Opmerking: Diverse oplossingen en materialen worden geleverd samen met kits die zijn vermeld in de Tabel van materialen.
- Bereid het vereiste homogenisator mengsel volume voor lysis van de monster met behulp van homogenisatie oplossing en proteïnase K bij een verhouding van 60:1.
- Pipetteer 2.4 µL van homogenisatie oplossing in elk buisje voor elke 1 mm2 van weefsel gebied, vortex voor 10 s bij de maximale snelheid, en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 s bij 2.500 x g.
- Bebroed in een blok van de verwarming bij 65 ° C gedurende 12 – 18 h met schudden bij 600 omwentelingen per minuut.
- Centrifugeer het lysates bij 21.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van een precisiepipet, zorgvuldig gecombineerd het duidelijke supernatant en afzien in een gelabelde verse buis. Vermijd aspirating van het weefsel/membraan fragmenten zoals kan hierdoor de kwaliteit van de resultaten.
- Bewaar het supernatant helder in een vriezer-80 ° C.
4. op kruising gebaseerde Assay
- De volgende preparaten uit te voeren.
- Vooraf het mengsel lysis te warm door het plaatsen van de fles reagens in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten en meng zachtjes door inversie.
- Als de homogenates van het weefsel zijn bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. Vortex de monsters op de maximale snelheid na de incubatie.
- De schudden incubator vastgesteldop 54 ° C en breng de sonde van de temperatuur validatie kit in een lege putje van een 96-wells-plaat. Na 2 uur controleren van de temperatuur op de digitale thermometer en stel de temperatuur van de delta van schudden incubator om te corrigeren voor eventuele temperatuurverschil.
- Dooi en vortex de sonde instellen en het blokkeren van reagens voor 10 s, centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 s bij 2.500 x g en houd op ijs.
- Houd de flacon proteïnase K op ijs tijdens gebruik.
- Bewerk ultrasone trillingen ten de parels van de vangst op 46 KHz voor 3 min, vervolgens vortex bij de maximumsnelheid voor een andere 3 min.
- Bereiden van een 25 µL werken kraal mix per putje door schaalvergroting de volgende reagentia dienovereenkomstig: 4,25 µL Nuclease-gratis water, 16.65 µL van lysis mengsel, 1.00 µL van het blokkeren van reagens 0,10 µL van proteïnase K, 0,50 µL van capture kralen, 2,50 µL van sonde set.
- Vortex de werkende kraal mix voor 10 s ter maximum-vaart, pipetteer dan 25 µL per putje in de magnetische scheiding plaat.
- Pipetteer 25 µL weefsel homogenaat een magnetische scheiding 96-wells-plaat en 25 µL homogenisatie oplossing voor 3 wells als de blanks.
- Afdichting van de plaat van de magnetische scheiding met behulp van een doorzichtige plastic Perspakking en plaats van de plaat in de incubator bij 54 ± 1 ° C voor 18-22 h terwijl het schudden bij 600 omwentelingen per minuut.
- Bereiden een 1 X wassen bufferoplossing voor 24 putten door 31.5 mL RNase-gratis water te vermengen met 0,1 mL van wash wassen buffer component 2 component 1 en 1,67 mL buffer.
- Verwijderen de plaat uit de incubator. De temperatuur van de schudden incubator ingesteld op 50 ± 1 ° C.
- De magnetische scheiding plaat op de wasmachine hand-held magnetische plaat monteren en vergrendelen. Verwijder de Perspakking en wacht 1 minuut voor de magnetische kralen te regelen.
- Wassen stap: Omkeren de magnetische scheiding plaat gemonteerd op het bord boven de wastafel en de vlek voorzichtig op een papieren zakdoekje te verwijderen van de resterende oplossing. Met behulp van een meerkanaalspipet Voeg 100 µL van 1 X wassen bufferoplossing in elk putje en wacht 15 s. Herhaal deze stap om de plaat 3 keer wassen.
- Pipeteer 50 µL van het reagens voorversterker aan elk putje. Afdichting van de plaat met een aluminium plaat zegel en schud de plaat bij 800 rpm voor 1 minuut bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 ± 1 ° C terwijl het schudden bij 600 omwentelingen per minuut.
- Herhaal stap 4.9 (wassen stap).
- Pipeteer 50 µL van het reagens van de versterker aan elk putje. Afdichting van de plaat met een aluminium plaat zegel en schud de plaat stap 4.10.
- Herhaal stap 4.9 (wassen stap).
- Vortex de label sonde voor 10 s op maximale snelheid. Aan elk putje 50 µL van de sonde label toevoegen Afdichting en schud de plaat (stap 4.10).
- Herhaal stap 4.9 (wassen stap).
- Vortex de streptavidine phycoerythrin (SAPE) voor 10 s op maximale snelheid. Voeg 50 µL van SAPE toe aan elk putje. Afdichting en schud de plaat (stap 4.10).
- Herhaal stap 4.9 (wassen stap) behalve gebruik de SAPE was buffer in plaats van de bufferoplossing wassen.
- Voeg 130 µL van SAPE was buffer aan elk goed en zegel plaat met een aluminium plaat zegel. Schud de plaat bij 800 rpm bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Start-up de magnetische kraal analyzer. Het uitvoeren van de calibratie and verificatie routinematige door het volgen van de instructies van de fabrikant.
- Een protocol betreffende de magnetische kraal-analyzer met behulp van de volgende parameters instellen: de grootte van steekproef: 100 µL; DD Gate: 5.000-25.000; Time-out: 90 s; Kraal gebeurtenis/kraal regio: 100; en klik op volgende. Selecteer de nummers van de respectieve parel in het deelvenster en de gebieden van de kraal met de respectieve doelgenen zoals aangegeven door de fabrikant definiëren.
- Voeg een nieuwe analyse door in het partijen tabblad 'Batch maken met behulp van een bestaand protocol' te selecteren. In de indeling van de plaat wijst de putten als onbekend of Blanco, respectievelijk en voorzien van een label voor elk monster in het deelvenster stalen .
- Verwijder de aluminium plaat zegel uit de reactie van de 96-wells-plaat. De plaat dienblad uitwerpen door te klikken op de Eject -knop, de plaat in de magnetische kraal analyzer laden. Klik op intrekken| Batch uitgevoerd tot de analyzer. Na de lezing uitwerpen en verwijder de 96-wells-plaat. Schoon en dicht waas de magnetische kraal analyzer, zoals aanbevolen door de fabrikant.
5. de gegevensanalyse
- In de Batch| Resultaten tab, selecteer het respectieve analyse-bestand en klik op de knop exporteren to.csv . Open the.csv bestand met behulp van een spreadsheet-software.
- Observeren van de graven van de kraal en geen resultaten met < 40 kralen/regio weglaten.
- Gemiddelde van de waarden van de lege putten en uitwerken van de standaarddeviatie (SD) en de limiet van detectie (LOD) (blanco gemiddelde + (3xSD)) per doel-gen. Stel de waarden lager zijn dan de LOD als onopgemerkt.
Opmerking: Als aan het normaliseren van de expressie waarden zijn onopgemerkt, de voorbeeldgegevens als onvoldoende beschouwen. Overwegen expressie waarden meer dan 20.000 als over de bovenste gevoeligheid te beperken. De lysates van deze monsters moeten worden verdund en opnieuw geanalyseerd. - Het lege gemiddelde van de ruwe gegevens per gene aftrekken.
- Berekent het meetkundige gemiddelde van de geselecteerde normaliserend genen per monster. Normaliseren van individuele voorbeeldgegevens aan de respectieve meetkundige gemiddelde.
- Analyseren van de gegevens op gegevens wetenschap platforms of met behulp van algoritmen gedefinieerd.
- Importeer de gegevens in de wetenschap dataplatform door te klikken op Gegevens toevoegen. Sleep het gegevensbestand in de Werkruimte van het proces en aan een marktdeelnemer [Selecteer kenmerken] vervolgens verbinding te maken met een belangrijkste componenten analyse (PCA) exploitant, en vervolgens naar de result poort.
- Selecteer de subset met gegevens van de genormaliseerde gen en een nominale variabele zoals borst kanker subtype in het Kenmerk Select exploitant. Het proces uitvoeren door te klikken op spelen. Selecteer in het tabblad grafieken de "verstrooien 3D kleur" in de stijl van de grafiek en de nominale variabele in het kleurveld . Beoordelen van de variabiliteit van de gegevens PCA op een 3-dimensionale perceel.
Representative Results
De beschreven methode is toegepast voor de gelijktijdige meting van 40 afschriften in H & E gekleurd (Figuur 1), microdissected (Figuur 2) zeer gedegradeerd FFPE materiaal. Met behulp van deze methode, tonen wij de nauwkeurige karakterisering van receptor status (figuur 3A), classificatie van tumoren in luminal en basale moleculaire subtypen17, en differentiële expressie van de mesenchymale markering, FN1, bij het vergelijken van de tumor en bijpassende besturingselement weefsel (figuur 3B), in de verschillende receptor positieve en negatieve subtypen.
Figuur 1: gen-expressie met H & E gekleurd materiaal. Correlatie tussen een expressie profiel is afgeleid van een sectie onbevlekt tumor in vergelijking met een gekleurd tumor-sectie. [Pearson correlatie p-waarde = 5.34E-26]. Gereproduceerd met toestemming17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Laser microdissection van FFPE weefsels. (A) H & E gekleurd dia; (B) immunohistochemische kleuring voor ER uitdrukking; (C) HER2 immunohistochemische kleuring; (D) onbevlekt 20 µm sectie op laser microdissection membraan dia's. De gele pijl geeft een gebied van invasieve tumor die is niet duidelijk afgebakend wegens gebrek aan kleuring. (E) A 20 µm sectie gekleurd met H & E voor een betere afbakening van gebieden van belang. Witte pijlen geven aan laser dissectie trail terwijl de rode pijl de laser focus tijdens dissectie toont. Alle illustraties werden veroverd op 10 x vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: expressie van (A) receptor status en (B) mesenchymale marker FN1, in de tumor van de borst in vergelijking met normale gematched. De klassieke diagnostische borst kanker subtypen worden gedefinieerd volgens diagnostische resultaat met behulp van immunohistochemie en -fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) voor HER2 dubbelzinnig immunohistochemische kleuring. De genormaliseerde expressie van (A) HER2 en ER, (B) FN1, afgemeten aan de hybridisatie gebaseerde bepaling wordt geïllustreerd in HER2 positieve, ER positieve en TNBC gevallen in vergelijking met patiënt afgestemd normale borstweefsel. De Kruskal-Wallis Test statistiek (K-W χ2) toont aan dat de uitdrukking van HER2 aanzienlijk (p < 0,05) hoger in de tumor weefsel in tegenstelling tot de gecompenseerde normale weefsel in de HER2 positieve cohort en beduidend lager in de TNBC cohort. ER expressie bleek niet significant hoger in de tumor weefsel in tegenstelling tot de gecompenseerde normaal in de ER positieve en TNBC cohorten. FN1 is significant hoger in het weefsel van de tumor in de HER2 en ER positieve subtypen en toont een tendens wordt aanzienlijk verhoogd in tumor weefsel ook in de TNBC cohort. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Case study: tumor heterogeniteit. Morfologisch verschillende tumoren waren microdissected en behandeld als afzonderlijke monsters. (A) de meester-scan van de H & E sectie. (B, C) Een 10 x en 40 x vergroting, respectievelijk voor elke morfologie van de tumor vastgesteld. (D) immunohistochemische kleuring voor ER bij 10 x vergroting. (E) immunohistochemische kleuring voor Ki67 bij 10 x vergroting een hogere mitotische activiteit in tumor 1 tonen. (F) genormaliseerd expressie niveaus voor het ESR1-gen in elke tumor tonen relatief hoog en gelijk expressie tussen tumoren zoals verwacht uit de immunohistochemische resultaat. (G) genormaliseerd niveaus van de expressie van FN1, een mesenchymale marker, waar verhoogde FN1 meningsuiting gaat gepaard met hoge Ki67 kleuring tonen een handtekening voor een meer invasieve tumor. De inverse wordt waargenomen in de tumor 2, die lijkt te zijn van een trager delende tumor met een lagere kwaadaardige potentieel vertegenwoordigd door verminderde FN1 expressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Een multiplex bDNA kraal gebaseerde bepaling is geoptimaliseerd om te kwantificeren van genexpressie aangetaste RNA afgeleid van het weefsel van de kanker van de borst van het FFPE en normale borst leidingen. Optimaliseren van de bepaling, normaliseren die betrokken zijn het ontwikkelen van een algoritme om het classificeren van borst kanker tumoren in luminal en basale subtypen met behulp van 8 bekende biomarkers en 5 potentiële genen. Normalisatie van gegevens werd gedaan met behulp van permutaties van de normaliserend genen. De selectie van de normaliserend genen was gebaseerd op de beste voorspelling van receptor status met behulp van de Luminal/basale classificatie genen. Als u wilt classificeren Luminal/basale subtypen van FFPE weefsels, waren de normaliserend genen geselecteerd Beta-actine (ACTB), Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) en Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
De methode kan worden aangepast voor gebruik in andere diagnostische en onderzoeksgebieden na adequate selectie van de normaliserend gen-set. Een belangrijke toepassing van deze methode in de onderzoekssector is de meting van biomarkers in archiefmateriaal dat goed is geannoteerde met klinische resultaten. Dit kan valideren van potentiële voorspellende markers in retrospectieve studies, snel en accuraat, en op lange termijn prospectieve studies wachten op ziektevrije overleving en algehele overleving gegevens voorkomen. Momenteel is onze fractie onderzoekt het gebruik van de test te sporen receptor-positieve exosomes, die de ontwikkeling van een nieuw algoritme met alternatieve normaliseren van genen voor de normalisatie van gegevens vereist. Het gebruik van vloeibare biopsieën en robuuste gen expressie vitrotests zal toestaan van hoge-doorvoer multiplex assays aangepast voor het beheer van de patiënt tijdens de behandeling, en een manier bieden waarmee de doeltreffendheid van de behandeling, mogelijke terugval als gevolg van de weerstand tegen therapie, volg en het metastatische capaciteit van de tumor.
Deze methode ook heeft een brede waaier van mogelijke toepassingen in de diagnose van tumoren en is aangepast aan de huidige diagnostische werkstroom. De belangrijkste voordelen van deze methode in het diagnostische veld opnemen: (1) de uitvoering van high throughput assays, (2) met uitzondering van subjectiviteit en onduidelijke resultaten afkomstig van beeld-gebaseerde metingen, (3) nauwkeurige detectie van meerdere doelen tegelijkertijd die nauwkeurigheid verbeteren en minimaliseren van het gebruik van kostbare patiënten stalen, en (4) geen behoefte aan gespecialiseerde voorzieningen en menselijke hulpbronnen. De geoptimaliseerde bemonstering proces, samen met de lage input van materiaal vereist voor de kraal gebaseerde multiplex assay, maakt het mogelijk verder onderzoek van de heterogeniteit van de tumor; met behulp van laser microdissection nauwkeurig scheiden meerdere foci van maligne weefsel van dezelfde patiënt sectie, is het mogelijk om te vergelijken meerdere genexpressie ertussen alsook met gecompenseerde normale weefsel (Figuur 4). Lage materiële input is van vitaal belang voor diagnostische toepassing op tumor biopsieën waarmee beperkte tumor weefsel. De capaciteit van de test voor het meten van de genexpressie van aangetaste RNA monsters kan gemakkelijk vervoeren van monsters voor analyse binnen een instelling of aan het onderhoud van de laboratoria. Analyse van de hele sectie was bovendien ook mogelijk met behulp van H & E gekleurd materiaal (Figuur 1).
Voor het welslagen van dit protocol, is het absoluut noodzakelijk is om: (1) zorgen voor juiste bemonstering van de tumor site/s die zijn lysed voor de assay en (2) de ontwikkeling van goed geoptimaliseerd en gevalideerde gegevens normalisatie algoritmen, voor elke gen expressie paneel en/of individuele prognostic of voorspellende biomarkers. De voormalige hangt af van de technische ervaring van de technicus/wetenschapper het uitvoeren van de bemonstering. Het wordt aangeraden om een extra pit en bereiden een weefsel microarray (TMA) in dezelfde indeling van de multiplex magnetische kraal assay (96-Wells-formaat). Dit zorgt voor een archief van tumor sites als een replica van monsters gebruikt voor de bepaling van RNA-gebaseerd. TMAs kunnen ook met andere technieken voor follow-up onderzoek of validatie van de resultaten worden beoordeeld. De ontwikkeling van normalisatie algoritmen is afhankelijk van het materiaal wordt onderzocht en de normaliserend genen geselecteerd voor normalisatie. Verschillende panelen voor het normaliseren van de genen zijn geselecteerd op basis van het niveau en de variabiliteit van de expressie in de steekproef geanalyseerd en dit varieert tussen kanker weefsels van verschillende oorsprong, exosomes uit plasma of circulerende tumorcellen. Validatie van de bepaling bevat monster verwerken aangezien diverse bereidingen ook leiden verschillende normalisatie algoritmen tot zal.
Om samen te vatten, het gebruik van bDNA technologie in combinatie met magnetische kraal technologie en de selectie van het juiste paneel van de doelgenen, zorgt het extra voordeel van het meten van de genexpressie rechtstreeks in weefsel lysates afgeleid van kleine hoeveelheden patiënt materiaal, met inbegrip van microdissected materiaal, exosomes en circulerende tumorcellen. Naast de detectie van tumor heterogeniteit heeft het juiste gebruik van panels het potentieel om het detecteren van tumor afgeleid exosomes voor vroegdiagnostiek en vroegtijdige opsporing van hervallen. Want er is geen noodzaak voor een nucleïnezuur amplificatie stap, de versterking van de signaal gebruikend de technologie van bDNA, gecombineerd met de kraal gebaseerde multiplex, meet meerdere genexpressie in klinisch-geannoteerde archiefmateriaal en bieden een bron voor biomerker validatie.
Disclosures
The Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay is eigendom van Thermo Fisher wetenschappelijke.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door (1) een borst kanker Project beurs (2014-2016) gefinancierd door de actie voor Breast Cancer Foundation en ALIVE 2013 door middel van het onderzoek, innovatie & Development Trust (RIDT) van de Universiteit van Malta, (2) de faculteit geneeskunde & Chirurgie, Universiteit van Malta en (3) Project ACT gefinancierd door de Maltese Raad voor wetenschap & technologie via FUSION: The O & I technologie ontwikkeling programma 2016. De publicatie van dit manuscript wordt ondersteund door middel van de subsidie Jove-Luminex.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
- Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
