Summary
I detta protokoll beskriver vi hur du utnyttjar [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emissions tomografi och datortomografi (18F-FDG PET/CT) imaging för att mäta den tumör metabola Svaren till riktad terapi MLN0128 i en KRAS/Lkb1 mutant mouse modell av lungcancer och kopplat avbildning med hög upplösning ex vivo autoradiografi och kvantitativa histologi.
Abstract
Ett signum för avancerade tumörer är en switch till aerob glykolys som lätt mäts av [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positronemissionstomografi (18F-FDG PET) imaging. Samtidig mutationer i den KRAS proto-onkogener och LKB1 tumör suppressor genen är frekventa händelser i lungcancer som kör hypermetabola, glycolytic tumörtillväxt. En kritisk väg reglerar tillväxt och metabolism av dessa tumörer är det mekanistiska mål av rapamycin (mTOR) väg, som kan riktas effektivt använda selektiv katalytisk mTOR kinashämmare. Den mTOR-hämmaren MLN0128 dämpar glykolys hos möss med tumörer med Kras och Lkb1 samtidig mutationer, kallad KL möss. Terapi svaret i KL möss mäts först genom 18F-FDG PET och datortomografi (CT) imaging före och efter leverans av MLN0128. Forskarna har genom att utnyttja 18F-FDG PET/CT, mäta dynamiska förändringar i glukosmetabolism i genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) av lungcancer efter en terapeutisk intervention med riktade terapier. Detta följs av ex vivo autoradiografi och en kvantitativ immunhistokemisk (qIHC) analys med morfometriska programvara. Användningen av qIHC ger detektering och kvantifiering av olika förändringar i biomarkör profiler efter behandling samt karakterisering av distinkta tumör patologier. Kopplingen av PET imaging att kvantitativa histologi är en effektiv strategi för att identifiera metabola och terapeutiskt svar i vivo i musmodeller av sjukdom.
Introduction
Vår forskning har fokuserat på att undersöka och inriktning cancer med mutationer i den levern Kinas B1 (LKB1, även kallad STK11) mutant cancer1. LKB1 är en master tumörsuppressor som förtrycker mTOR komplexa 1 (mTORC1) genom aktivering av AMP-Kinas (AMPK) som leder till regleringen av tillväxt och metabolism. Förlust av LKB1 leder därför till en ohämmad mTORC1 aktivering, aktivering av HIF1-alpha resultanten i en glycolytic metabola fenotyp kallas Warburg effekt2,3,4. LKB1 inactivating mutationer leder direkt till utvecklingen av en sällsynt familjär cancer före disposition syndrom känd som Peutz-Jeghers syndrom (PJS) som kännetecknas av utveckling av godartade gastrointestinala polyper kallas hamartom5 , 6 , 7. Dessutom LKB1 ofta samtidig muterar med onkogena KRAS resulterar i hypermetabola och aggressiva mänskliga lung tumörer8,9.
Lkb1-relaterade sjukdomar modelleras lätt i möss. Heterozygot inaktivering av Lkb1 hos möss leder till utveckling av hamartom korrekt modellering PJS10,11,12,13. Dessutom sammanfatta Lkb1 mutationer som lätt modelleras i möss korrekt cancer fenotyper i lungor, hud, bukspottkörteln, och bröst14. Den samtidig mutationen av Kras/Lkb1 i lungorna av transgena möss, använder en Cre recombinase-medierad aktivering av onkogena KrasG12D allel och biallelic radering av Lkb1, resulterar i bildandet av aggressiva och metastaserande lungtumörer15 ,16. Karakterisering av KrasG12D; Lkb1- / - (KL) lungtumörer isolerade från möss visar dessa tumörer har en hög mTORC1 aktivering och är mycket glycolytic, använder både direkta metabolit mätningar av glukos och laktat eller mäta förbrukningen av [18F] -2- fluoro-2-deoxy-D-glukos (18F-FDG) av positronemissionstomografi (PET) med datortomografi (CT) 17. MTORC1 hyper-aktivering i LKB1 muterade tumörer ger en tydlig logik för att testa båda Alloster och katalytisk kinashämmare av mTOR att behandla dessa cancerformer.
I en tidigare studie har visat vi att den Allosteriska mTORC1 hämmare rapamycin (RAPA) framgångsrikt hämmade tillväxten av och glykolys i gastrointestinal (GI) tumörer med en Lkb1+/- transgen musmodell av PJS3. RAPA är för närvarande godkänt som en enda agent terapi för behandling av njurcellscancer men visade begränsad effekt i NSCLC18,19,20. RAPA Alloster mTORC1 hämmar och kan förbättras genom utvecklingen av nästa generations mTOR katalytisk kinashämmare som levererar en mer nästan komplett inhibering av mTOR komplexen 1 och 2 (mTORC1 och mTORC2, respektive)21. Läkemedel såsom MLN0128 utvärderas nu i prekliniska studier och tidig fas kliniska prövningar22,23. En färsk studie från vårt laboratorium visade att MLN0128 är en potent mTOR-hämmare i människans lung tumör cellinjer och i vivo i KL GEMMs lung cancer15,16. MLN0128 undertryckt lung tumör tillväxt och glukos metabolism i dessa möss24.
I denna studie utnyttja vi de välkarakteriserad adenovirala Cre-inducerad musmodeller av lungcancer som initierats av en villkorligt aktiverade Lox-Stop-Lox-KRASG12D onkogen15,25. Mössen KrasG12D korsades med möss med floxed alleles av Lkb1 (Lkb1L/L) att generera KrasG12D; Lkb1L/L (KL) möss16. Efter intranasal leverans av adeno- eller lentivirus uttrycker Cre recombinase, utarbeta KL mössen tidiga lesioner av 4 veckor efter tumör induktion. Genom 6 veckor, tumörer på KL möss förändring från adenomatös tumörer en mer maligna, aggressiv tumör fenotyp typiska för lung carcinom, och 8-10 veckor utveckla mössen frank carcinom med en 100% penetrans16,26.
Båda PET/CT imaging och kvantitativa immunohistokemi kan användas för att bestämma de molekylära och metabola svar samt terapeutiska svaren i tumörer efter leverans av riktade terapier såsom MLN012817, 26,27. Beskrivs här är ett experimentellt protokoll som använder 18F-FDG PET imaging för att mäta metabola svaret på en MLN0128-riktad behandling. Koppling PET imaging med kvantitativa histologi möjliggör mätning av den molekylära svaren på mTOR-hämning och kvantifiering av tumör bördan och tumör histologi.
Protocol
Alla förfaranden beskrivs i protokollet har godkänts av den institutionella djurvård och använda kommittén (IACUC) vid University of California, Los Angeles.
1. 18F-FDG PET och CT Imaging hos möss
FÖRSIKTIGHET: Använd skyddsutrustning vid hantering av radioaktivitet. Följa alla tillämpliga rättsliga förfaranden vid hantering av radioaktivitet.
- Placera buren med mössen att avbildas på en varm bädd vid 37 ° C 1 h före 18F-FDG injektion för att minska den brunt fett 18F-FDG.
Obs: Fasta möss för 4-16 h kan du minska hjärtinfarkt förbrukning av 18F-FDG. - Väga musen och spela in sin vikt.
- Söva musen med 2-3% isofluran i syre vid 0,5 - 2 L/min för 2-3 min med en anestesi kammaren hålls vid 37 ° C. Se till att musen har varit sövd genom att nypa tån; ingen reaktion kommer att observeras om musen har varit sövd. Tillämpa oftalmologiska salva till ögonen för att förhindra eventuella torrhet under anestesi.
- Späd 18F-FDG (109 min radioaktivt halveringstit) i steril koksaltlösning på en justerad förfall-korrigerade injektion koncentration på 70-75 µCi/100 µL.
Obs: Följ PET-kamera tillverkarens rekommenderade 18F dosen för optimal scanner imaging. - Rita 70-75 µCi med en insulinspruta med 28 G nål, mäta radioaktivitet dosen med en dos kalibrator och registrera mätning och tid. Placera nålen i en hållare med bly i sprutan.
Obs: Mängden 18F-FDG radioaktivitet i varje dos mäts med en dos kalibrator, som är kalibrerad mot en standard referensmaterial, till exempel cesium-137, enligt tillverkarens protokollen. Tiden för läsning registreras också för att avgöra den förfalla korrigeringen. - Sticka den distala änden av mus svansen och mäta musens blodsockret med en Glukometer.
- Varma svansen för 1-2 min med en kompress indränkt i varmt vatten. Torka svansen med 70% isopropanol att vidga svans ven strax före injektionen. Administrera 100 µL av 18F-FDG (hela volymen i sprutan) med en bolus injektion via laterala svansen ven och registrera tiden för injektion. Mät den återstående dos i sprutan använder dos kalibratorn och anteckna mätning och tid.
Obs: Det kommer att finnas några belopp av sonden kvar i sprutan. Användning av insulinsprutor är att föredra framför sprutor ansluten till nålar via Luer lås på grund av den minskade mängden dosen instängd i sprutan/nålen efter injektionen administrerats. - Placera den injicerade mus i anestesi kammaren hålls under 1,5-2% isofluran vid 37 ° C så att sonden ska distribueras via musens systemiska cirkulationen för 1 h före i PET-bilden.
Obs: Det kan vara fördelaktigt att ogiltigförklara blåsan före skanning för att möjliggöra en enklare 18F-FDG PET visualisering av de tumörer som implanteras i lägre flanken av musen. - Efter 1 h, Placera musen i en tänkbar kammare under näsan-cone isofluran anestesi och vid 37 ° C, och säkra dess armar och ben på plats med medicinsk tejp i ryggläge.
- Placera imaging kammaren i PET/CT-skannern.
- Förvärva PET och CT skanningar som beskrivs i PET/CT scanner manuell28.
Obs: PET-bilder förvärvas för 600 s med energifönster av 150-650 keV, rekonstrueras med max-sannolikheten förväntan maximering med korrigeringar för photon dämpning, detektor normalisering och radioisotop decay (en scatter korrigering var tillämpas inte). CT bilderna förvärvas på ett kontinuerligt sätt för 50 s använder en 50 kVp, 200 µA röntgen källa och en platta detektor och de rekonstrueras med Feldkamp algoritm. - Efter PET/CT är klar, ta bort musen från imaging kammaren och låt den återhämta sig i sin bur. Övervaka musen tills den helt har återfått medvetandet och kan underhålla sternala koordinationsrubbning.
- Importera de rekonstruerade PET/CT-bilderna till AMIDE programvara genom att klicka på filenoch sedan Öppnaoch välja lämplig fil.
- Konvertera PET data till enheten för procent-injiceras dos per gram (%ID/g) genom att ange dosen vid tidpunkten för injektion efter redovisning för eventuella kvarvarande dos kvar i sprutan eller till enheten av standardiserade upptag värde (SUV) genom att dessutom ange motivets vikt. För att göra detta, högerklicka på PET datauppsättningen och leta upp fältet %ID/g på fliken Grundläggande information retur %ID/g spelats in tidigare.
- Rita den regioner-av-intressen (ROIs) på tumörer och normala vävnader (lever, muskel, lunga, hjärta, hjärna och underhudsfett). Att göra detta, klicka på Redigera, Välj Lägg till ROI, Välj ROI form och ge ROI ett namn. Rita ROIs över tumörer och vävnader och justera deras dimensioner för att täcka vävnad av intresse i alla 3 axlar.
Obs: För att redogöra för skillnader i PET sonden biodistribution mellan djur, tumör ROI värden kan ytterligare normaliseras till ROI värden i levern, en väl perfunderade orgel med minimala glycolytic aktiviteten representerar 18F-FDG i omlopp. ROI-analyser av tumör och normal vävnad utförs på samma mus. Lung tumör lesioner identifieras vanligtvis med 18F-FDG PET eftersom 18F-FDG lagring i en normal lunga är relativt låg. CT är också används för att identifiera lesioner, särskilt lesioner som är 18F-FDG icke-ivrig. En ex vivo analys av isolerade lungorna bidrar också till att lokalisera tumören lesioner.
2. 18F-FDG autoradiografi
- Förbereda musen för avbildning med 18F-FDG genom att följa steg 1,1-1.12, utom nu, utspädd 18F-FDG i steril koksaltlösning på en justerad förfall-korrigerade injektion koncentration av 1000 µCi/200 µL.
Obs: Högre doser av 18F-FDG används för autoradiografi för att redovisa ytterligare prov bearbetning tid och en optimal detektering av fosfor plattor. - Avliva den mus via en dödlig inandning av isofluran på 5% eller av CO2 (en IACUC-godkänt förfarande).
Obs: Cervikal dislokation bör inte användas eftersom detta kan skada lungorna. - Fästa ned musen med den ventrala yta som exponeras och spraya den med 70% etanol att matta ned dess hår innan snittet.
- Öppna brösthålan genom att tillämpa en mittlinjen snitt, skära bort membranet och ta bort bröstet väggar. Exponera luftstrupen genom att försiktigt ta bort den saliv-körteln. Placera bulldog klämman på luftstrupen som nära käken som möjligt, säkerställa en tight passform på luftstrupen. Plats 23 G nål bifogas en 3 mL spruta inuti luftstrupen nedanför bulldog klämman och injicera ~ 2 mL av OCT:PBS (1:1) (Optimal styckning temperatur: fosfat buffrad koksaltlösning) lösning.
Obs: OCT är mycket trögflytande och blandas med PBS som möjliggör en lättare injektion i lungorna. - Ta bort nålen från luftstrupen och använda pincett för att klämma på insprutningspunkten att förhindra eventuella läckage av OCT:PBS lösningen.
- Försiktigt bort lungorna från brösthålan och separera den vänstra loben från resten av lungorna. Placera den vänstra loben i märkta cryomold fylld med några droppar OCT. När lunglob är inne mögel, Fyll i cryomold till toppen med OCT.
- Upprepa samma procedur med den högra halvan av lungorna.
Obs: Om 18F-FDG signalen i hjärtat förväntas vara hög eller om lungtumörer ligger nära hjärtat, kan det vara fördelaktigt att ta bort hjärtat för att förhindra läckage tracer. Alternativt kan hela lungorna bäddas in i en enda cryomold. Det är viktigt att undvika luftbubblor när du arbetar med OCT. - Använd lång pincett, placera den förberedda cryomold i slutna celler extruderad styrencellplast behållare innehållande en blandning av torr-is och isopentan.
Obs: Denna blandning bör vid ca-70 ° C innan du placerar cryomold i det för frysning. Efter härdning blir OCT föreningen vit. Om flera prover bearbetas på samma gång, kan de frysta proverna i OCT cryomolds lagras tillfälligt på torris. - Bort det frysta blocket från cryomold och montera det på en kryostat för snittning. Avsnitt blocket 4 µm tjock använder mikrotomen blad (34°/80 mm, hög profil). Överföra avsnitten vävnad till en glasskiva som förvarats i rumstemperatur.
- Placera preparatglas på en fosfor imaging plate. Placera plattan i kassett och stäng försiktigt för att förhindra diabilder från skiftande. Förvaras kassetten i-20 ° C frys för plattan exponering, allmänt över natten.
Obs: Tallrikar och kassetter måste kylas före till-20 ° C före användning. Att placera proverna vid-80 ° C är acceptabelt samt. - Efter exponering, ta bort bilderna från plattan och läsa på plattan på bilden läsaren.
- Bilderna kan vara insvept i plastfolie och lagras vid-80 ° C, eller de kan vara beredda för hematoxylin och eosin färgning eller immunohistokemi.
3. skörd lungvävnad för histologi
- Följ steg 2.2-2.4, utom nu, istället för att använda den OCT:PBS lösningen, injicera 2-3 mL 10% normala buffrad formalin fixar lungorna.
- Ta bort nålen från luftstrupen och använda pincett för att klämma på insprutningspunkten att förhindra eventuella läckage av formalin. Försiktigt bort lungorna från brösthålan och placera dem i en 50 mL konisk tub innehållande ~ 20 mL 10% normala buffrad formalin för 16-24 h att säkerställa en fullständig fixering.
Obs: Fastställande lungorna tillåter för bevarandet av de optimala anatomiska funktionerna. - Nästa dag, överföra fast lungorna från formalin till 70% etanol och förbereda lungorna för att placeras i en kassett som vävnad.
- Förbereda lungorna för histologi av noggrant dissekera lober med sax för att klippa vid gren punkter mellan 5 lober, numrerade 1-5 som visas i figur 1D, och placera dem i en icke-överlappande orientering i vävnad kassett. Placera en skum pad försiktigt på lungvävnaden att hålla orienteringen intakt.
- Lagra dissekerade lungan loberna i 70% etanol tills för paraffin inbäddning.
- Paraffin-bädda in vävnaden i kassetter och skär 4 µm tjocka sektioner för färgningen, med standardförfaranden.
4. vävnad segmentering och kvantifiering med kommersiell programvara
- Bild hematoxylin och eosin (H & E) målat lung sektioner vid 1,25 X förstoring med hjälp av en kommersiell Multispektrala imaging system.
- Konvertera bilder till digital bild kuber och läsa in (klicka på filenoch sedan på Ladda spektrala bibliotek) färdiga spektrala bibliotek för H & E.
Obs: Spektrala biblioteken utvecklades i förväg genom att förvärva spektrala bilder från ensamma färgade lung sektioner, ett avsnitt färgas endast med eosin och den andra endast färgas med hematoxylin, som har sparats i en öppen källkod egenutvecklade spektrala bibliotek fil (.csl). Bildgivande systemet har operativsystem som förvärvar en bild vid varje våglängd som behövs (enligt definitionen av protokollet förvärv). Dessa bilder (”bild kuben”) lagras i en öppen källkod egenutvecklade Multispektrala-format (.im3). Spectra extraheras från bilden kuben med programvaran morfometriska och lagras i separata spektrala biblioteksfiler. - Spektralt unmix den pseudo-färgade H & E bilder av hela lungorna genom att klicka på knappen Unmix .
Obs: Minoriteter tar mindre än 1 s. Antalet pixlar i varje vävnadstyp kvantifierades med morfometriska bild analys programvara. - Visualisera varje bild kub genom att omvandla Multispektrala data till motsvarande 3-färg (röd, grön, blå) bilden med hjälp av ögats våglängd-beroende färg svar convolved med intensiteten i varje bild.
Obs: De resulterande 3 bilderna visas som standard 24-bitars färgbild. - Pseudo färg varje oblandade bild genom att skala bilden i en användaren valda färg (t.ex., röd, grön, lila, etc.) och Lägg som tillsammans med andra pseudo färgade oblandade bilder till en standard 24-bitars färgbild.
- Använda standardinställningarna för alla analyser.
Obs: I allmänhet, eftersom denna typ av segmentering är beroende av en visuell bedömning av resultaten (dvs., en bedömning av hur väl segmentering på bilderna utanför utbildningen ställa verk), är det viktigt att ordentligt dela bilderna upp i utbildning, test och validering uppsättningar. - Börja med 2-3 bilder som en utbildning (10-15 för mänskliga biopsiprover), tåg på dem tills resultaten ser bra ut, och sedan tillämpa det algoritmen för en annan 2-3 bilder. Applicera sedan, den resulterande algoritmen till den fullständiga validering uppsättningen.
Obs: Troligtvis några omskolning kommer att behövas. - Analysera området tumör i hela lungan sektioner genom att beräkna det totala pixelantalet för de röda pseudo färgade tumörerna i lober 1-5 av varje mus.
Obs: Den normala vävnaden var pseudo färgade grönt och blod eller blodceller fartygen pseudo färgade rosa som visas i figur 3. Den genomsnittliga tumör bördan för varje behandlingsgrupp beräknades genom att mäta det totala pixelantalet för varje mus i behandlingsgruppen.
Representative Results
18 F-FDG PET imaging utfördes på KL möss och visade att tumörerna hos dessa möss var mycket glycolytic som visas av en förhöjd 18F-FDG konsumtion (figur 1A), överens med tidigare publicerade studier26, 29. En resektion av hela lungorna visade förekomst av flera tumörer (figur 1B). Mus lungorna kan delas upp i 5 separata lober representerade i siffror 1 c och 1 D. Lober 1-5 var märkt på sektionerad lungorna som var målat med H & E eller glukos transporter 1 (Glut1) (figur 1D). Glut1 är primära transportör av både glukos och 18F-FDG och dess uttryck och lokalisering till plasmamembranet av tumörcellerna korrelerar direkt med 18F-FDG SUV29. En högre upplösning analys av Glut1 färgning (X 40) i 18F-FDG-ivrig lungtumörer visar en förhöjd uttryck och lokalisering av transportören vid plasmamembranet (figur 1D).
På grund av begränsad upplösning på PET imaging utfördes både PET/CT och vävnad autoradiografi. Den högre upplösningen av autoradiografi kan identifiera mindre tumörer och/eller heterogenitet av tumör 18F-FDG distribution. Efter tumör med induktion utfördes 18F-FDG PET/CT imaging på KL möss (figur 2A) följt av autoradiografi på lungorna som isolerats från dessa möss (siffror 2B och 2 C). Som sett i siffror 2B och 2 C, identifierat autoradiografi två ytterligare mindre tumörer som var positiva för 18F-FDG ännu inte var synlig av PET. Efter autoradiografi, bilderna med vävnad kan också användas för den immunhistokemiska (IHC) färgning av biomarker(s). H & E färgning för tumörer bekräftat förekomsten av tumörer i den vänstra loben (figur 2D).
Nästa, 18F-FDG PET imaging utfördes på MLN0128-behandlade KrasG12D; Lkb1- / - möss för att utnyttja 18F-FDG som en funktionell biomarkör för glukosmetabolismen i lungtumörer (figur 3). Vi har identifierat som en behandling med MLN0128 kraftfullt hämmas de mTORC1 signalering och glykolys vilket framgår av en minskad 18F-FDG förbrukning (siffror 3A och 3B). Dessa resultat håller med prekliniska studier att bedöma MLN0128 i KL möss som tidigare publicerats av vårt laboratorium17,27. Slutligen, IHC färgning utfördes på tumörer (figur 3C). Tumörer var färgas antingen för H & E eller med antikroppar mot phospho-S6, som är ett bevarat substrat för mTORC1 och används för att indikera en mTORC1 aktivering (P-S6) vs. inaktivering (S6). Figur 3 C visar en robust hämning av P-S6 av MLN0128 i KL tumörer jämfört med dem som behandlades med ett fordon som överensstämmer med tidigare publicerade arbete17. Utöver KRAS stöder onkogena drivrutiner såsom den epidermal tillväxtfaktor (EGFR) glycolytic metabolismen i lungtumörer samt. Därför testade vi om hämning av konstitutivt aktiv muterade EGFR med erlotinib undertryckta 18F-FDG metabolismen i mus xenograft. Siffror 3D och 3E visar att människans lung tumör linjen HCC827, som hyser en EGFR del19 mutation, visade en signifikant minskad 18F-FDG livsmedel efter fem dagar av erlotinib behandling.
Slutligen, morfometriska vävnad analysen utfördes på sektionerad lungor och lungtumörer att kvantifiera den totala tumör-bördan samt för att skilja tumör patologier som ingår vävnad subtyp, nekros, blodkärl från normal lungvävnad och luftar utrymme. De KL GEMMs utvecklat en komplex och patologiskt heterogen sjukdom som presenterade sig med lungtumörer av varierande histopathologies. Dessa inkluderar adenokarcinom (ADC) och skivepitelcancer (SCC)-denna heterogenitet gör behandlingen av denna cancer en formidabel utmaning. Figur 4 A visar en enda H & E färgade lunglob med två stora tumörer närvarande. Högre förstoring bilderna visas i figur 4B identifiera en normal lunga, fartyg, och luftrummet och tumör nekros samt adenokarcinom, kännetecknas av en väldefinierad papillär struktur och en skivepitelcancer. Figur 4 C representerar pseudo färgläggning av lunglob och tumör med informera morfometriska programvara. Figur 4 D visar procentuella normal lunga, fartyg och enskilda patologier som tumör nekros och tumör undertyper som segmenterad väl differentierat adenocarcinom från skivepitelcancer.
Figur 1 : Metaboliskt aktiva KrasG12D; Lkb1- / - (KL) mutant lungtumörer är 18F-FDG positiva och uttrycka höga nivåer av glukos transporter 1 (Glut1). Paneler A och B visar en maximal intensitet projektion [kallas även en 3-dimensionell (3D) bild] i 18F-FDG-PET och CT analys på vissa FDG-ivrig KL möss härbärgerat skivepitelcancer lungtumörer. Visas är (A) en 3D rekonstruktion och (B) transverse, sagittal och koronalt utsikt över lung tumor(s) som (T). (C) i denna panel visas en hela lungan histologi av KL musen avbildas i paneler A och B, antingen färgas för H & E (övre panelen) eller med en antikropp specifik för Glut1 (nedre panelen). Lungan loberna är numrerade. Skalstapeln = 2 mm. (D) det här diagrammet representerar orientering och nummer lober i möss (övre panelen) och högre upplösning 40 X bilder av H & E - eller Glut1-färgade tumörer från de bilder som visas i panelen C H & E (mellersta panelen) eller färgas med en antikropp specifik för Glut1 (nedre panelen). Skalstapeln = 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: 18 F-FDG autoradiografi kan identifiera små tumörer som är metaboliskt aktiva. (A) denna 18F-FDG PET/CT bild visar 18F-FDG-ivrig tumörer i en KL mus visas som en maximal intensitet projektionsbild. T1 och T2 = tumörer, H = hjärtat, B = urinblåsan, K = njurarna. (B) denna panel visar den ex vivo autoradiografi seriell delar av höger och vänster lungan loberna av musen. Lungorna i vänster och höger paneler är identiska. Lungorna i vänstra panelerna är pseudo färgad orange. Lungorna i de högra panelerna är färgade i svart och vitt. Tumörer (T1, T2 och T3) anges med pilar. (C) Detta är en förstorad bild av den autoradiografi pseudocolored orange (övre panelen) och svartvitt (nedre panelen). (D) i denna panel visas de H & E färgning av översta segmentet av den vänstra loben som visas i panelen B. Skalstapeln = 200 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Den mTOR-hämmaren MLN0128 dämpar glukos förbrukning i lungtumörer KL möss som upptäcks av 18F-FDG PET. (A) i denna panel visas representativa 18F-FDG PET/CT bilder av KL möss behandlades med ett fordon (18F-FDG ivrig, vänster) eller MLN0128 (18F-FDG icke-ivrig, höger). Den tvärgående (övre panelen) koronala (mellersta panelen) och sagittal (nedre panelen) vyer visas. Tumörer beskrivs med röda linjer; H = hjärtat, L = levern. (B) denna panel visar en kvantifiering av SUVmax (%ID/g) mellan de fordon - och MLN0128-behandlade tumörerna. (C) i denna panel visas de H & E och P-S6 färgning av hela lungan sektioner från KL möss behandlades med fordon eller MLN0128. Skalstapeln = 25 µm. (D), denna panel visar representativa 18F-FDG-PET och CT-bilder av HCC827 EGFR (del19) xenograft pre- och post-erlotinib behandling. Tumören (T) indikeras med en pil, K = njure, B = hjärnan. (E), denna panel visar en kvantifiering av SUVmax (%ID/g) för HCC827 xenograft före och efter behandlingen med erlotinib. n = 10 tumörer/grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Tumör börda och tumör histologi kvantifieras med morfometriska programvara.
(A) denna panel visar den H & E färgning av en enkel mus lunglob med en tumör som samlats in från en KL-mus. (B) dessa högre upplösning bilder visar skivepitelcancer (övre vänstra), normala lungan, fartyg, och luftrummet (överst till höger), och väl differentierade papillär adenokarcinom (nederst till vänster) och nekros (nederst till höger). (C), denna panel visar pseudocoloring H & E-färgade lung LOB med morfometriska programvara. (D) i denna panel visas procentsatserna för enskilda lungan LOB och tumör patologier mätt med Inform. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den här artikeln beskrivs en imaging strategi baserad på experimentella som utnyttjas 18F-FDG PET/CT imaging med qIHC för att mäta både metabola och molekylär svaren i lungtumörer efter leveransen av mTOR-hämmaren MLN0128. MLN0128 minska effektivt den 18F-FDG konsumtion, som visar en betydande metabola svar i tumörer. Genom att länka PET/CT imaging till immunohistokemi, kunde vi rumsligt registrera sektionerad tumörer till PET/CT-bilder i 3D och utföra en detaljerad undersökning av hela tumörer på cellulär och molekylär nivå. Detta gjorde det möjligt att bekräfta att MLN0128 hämmas av mTOR signalering, vilket bekräftar en på målet molekylär respons till drogen i tumörer. Slutligen, genom att utnyttja kvantitativa histologi, kunde vi kartlägga och separat distinkta tumör sjukdomar, såsom övergripande tumör massa från tumör nekros, definiera adenocarcinom från skivepitelcancer, och kompletterar microPET imaging.
MicroPET begränsas för närvarande av en rumslig upplösning på cirka 1 mm. Dessutom kan 18F-FDG retention i vissa vävnader påverkas av olika faktorer, inklusive plasma glukosnivåer, typ och varaktighet av bedövningsmedel exponering, miljömässiga temperaturen och den allmänna hälsan hos djuret, som kan påverka 18 F-FDG farmakokinetiken30. Dessa parametrar har optimerats för detta protokoll men bör optimeras för varje djurmodell. Reproducerbarhet studier av 18F-FDG avbildning av subkutana tumörer hos möss visar en variationskoefficient för den genomsnittliga %ID/g för ca 15%, vilket tyder på att tumören terapeutiska svaret av en individuell mus bedömts av 18 F-FDG PET bör vara större än detta tröskelvärde anses vara tillförlitlig och betydande31.
Den cellulära och även subcellulär fördelningen av PET-spårämnen kan bedömas av vävnad autoradiografi med avsnitten därefter målat och co registrerade hos qIHC. Samtidig registrering PET med CT tillåter en PET-bild sättas i en anatomisk sammanhang. Detta är oerhört värdefullt, även med låga mjukvävnad kontrast. Avsaknaden av mjuk vävnad kontrast av CT kan övervinnas med magnetisk resonanstomografi (MRT). Dessutom biomarkörer för fluorescens avbildning kan användas för att bedöma glykolys i vivo, men photon absorption och scatter i lungorna hålighet kan påverka den noggranna kvantitering eller upptäckt känslighet32. Sammanfattningsvis ger utnyttja hela djur PET/CT imaging med kvantitativa histologi en korrekt och realtid karta över tumörbiologi efter terapeutisk intervention.
Multispektral avbildning (MSI) är tillämplig i en situation där en färgbild kan användas. Åtminstone, MSI ger samma information som en färgbild, och för vissa program, MSI kan ge mer detaljerad information om ett prov spektrala egenskaper än en enkel bredband tre färger (RGB) bild. I allmänhet är begränsningarna av MSI color imaging, förutom att MSI är långsammare och tar längre tid att hämta bilder. Morfometriska programvaran användes för att erhålla reproducerbara, korrekt segmentering resultat för bilderna och beskrivs i Tabell för material. Det finns ytterligare kommersiellt tillgängliga produkter som kan användas för vävnad segmentering och kvantifiering av histologi.
Komplexiteten i cancer metabolism sträcker sig bortom den Warburg effekt och glukos metabolism33,34. Det är mycket troligt att tumörer kommer att lätt anpassa till monoterapi behandlingar som hämmar glykolys. Beroendet av aminosyra metabolismen är väl dokumenterat i cancer, och det förväntas att tumörer är beroende av en mängd amino acids såsom glutamin och glycin, serin, liksom andra metaboliter såsom fria fettsyror35,36, 37. Utöver 18F-FDG, har sonder som 18F - och 11C-märkt glutamin, kolin, acetat, 1-(2'-Deoxy-2'-fluoroarabinofuranosyl) cytosin (FAC) och fluorothymidine (FLT) framgångsrikt använts för att bilden amino syra, nukleotid och lipidmetabolism i djurmodeller av cancer38,39,40,41. Automation och hur provtagningsutrustningen skall tracer radiokemi teknik tillsammans med högre upplösning, högre känslighet PET skannrar kommer att förbättra tillgängligheten till PET för att mäta olika biologiska förfaranden42,43. Som förståelsen av ämnesomsättning ökar är det logiskt att repertoaren av PET radiotracers kommer att öka liksom, så att forskare och läkare till noninvasivt profil tumör metabolism.
Användningen av PET/CT imaging och kvantitativa histologi adresser en kliniska behov, vilket är att snabbt översätta bänk upptäckter till klinisk användning. För att åstadkomma detta, måste forskarna kunna mäta det terapeutiska svaret samt den förvärvad resistensen mot droger, som PET/CT-avbildning gör. Dessutom en PET/CT och immunhistokemisk analys av lungtumörer används som standardbehandling för patienter, och således är direkt översättas till klinisk praxis. Ännu viktigare, identifierar PET/CT imaging lätt terapi-resistent tumörer, där forskare kan isolera och förhöra på molekylär nivå för att bättre förstå mekanismerna bakom sjukdomen. Detta är en iterativ process som har gjort det möjligt att bättre förstå mekanismerna bakom motstånd och utforma effektivare behandlingsstrategier för kliniska översättning.
Disclosures
Kevin P. Francis är anställd i Perkin Elmer. James Mansfield är offentliga aktieägare i PerkinElmer, Inc (PKI) aktier på NASDAQ. Författarna har inget annat att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar University of California Los Angeles Crump preklinisk Imaging Technology Center för deras hjälp med PET/CT bildtagning av möss, translationell patologi Core laboratoriet samt statistik kärna på University of California Los Angeles' David Geffen School of Medicine för deras hjälp med tumör provberedning och analys. För finansiering, David B. Shackelford stöddes av CTSI och KL2 translationell Science Award bevilja nummer KL2TR000122 och UL1TR000124 vid den David Geffen School of Medicine vid UCLA och av den avdelning av försvar Lung Cancer Research Program translationell Forskning partnerskap W81XWH-13-1-0459 och ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey stöddes av en NIH T32 utbildning grant HL072752 genom den David Geffen School of Medicine vid UCLA. Anthony Jones stöds av UCLA tumör cellbiologi träningsprogrammet (USHHS Ruth L. Kirschstein institutionella National Research Service Award # T32 CA009056). Gihad Abdelhady stöds av en NIH/NCI mångfald tillägg R01CA208642.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
| Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
| Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
| Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |
References
- Shackelford, D. B., Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 9 (8), 563-575 (2009).
- Shaw, R. J., et al. The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell. 6 (1), 91-99 (2004).
- Shackelford, D. B., et al. mTOR and HIF-1alpha-mediated tumor metabolism in an LKB1 mouse model of Peutz-Jeghers syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11137-11142 (2009).
- Faubert, B., et al. Loss of the tumor suppressor LKB1 promotes metabolic reprogramming of cancer cells via HIF-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2554-2559 (2014).
- Hemminki, A. The molecular basis and clinical aspects of Peutz-Jeghers syndrome. Cellular and Molecular Life Sciences. 55, 735-750 (1999).
- Hemminki, A., et al. A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome. Nature. 391 (6663), 184-187 (1998).
- Sanchez-Cespedes, M. A role for LKB1 gene in human cancer beyond the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 26 (57), 7825-7832 (2007).
- Sanchez-Cespedes, M., et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Research. 62 (13), 3659-3662 (2002).
- Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455 (7216), 1069-1075 (2008).
- Ylikorkala, A., et al. Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice. Science. 293 (5533), 1323-1326 (2001).
- Bardeesy, N., et al. Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation. Nature. 419 (6903), 162-167 (2002).
- Miyoshi, H., et al. Gastrointestinal hamartomatous polyposis in Lkb1 heterozygous knockout mice. Cancer Research. 62 (8), 2261-2266 (2002).
- Jishage, K., et al. Role of Lkb1, the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome, in embryogenesis and polyposis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8903-8908 (2002).
- Shackelford, D. B. Unravelling the connection between metabolism and tumorigenesis through studies of the liver kinase B1 tumour suppressor. Journal of Carcinogenesis. 12, 16 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Ji, H., et al. LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis. Nature. 448 (7155), 807-810 (2007).
- Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
- Wislez, M., et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic K-ras. Cancer Research. 65 (8), 3226-3235 (2005).
- Liang, M. C., et al. TSC1 loss synergizes with KRAS activation in lung cancer development in the mouse and confers rapamycin sensitivity. Oncogene. 29 (11), 1588-1597 (2010).
- Hudes, G., et al. Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 356 (22), 2271-2281 (2007).
- Wander, S. A., Hennessy, B. T., Slingerland, J. M. Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1231-1241 (2011).
- Pourdehnad, M., et al. Myc and mTOR converge on a common node in protein synthesis control that confers synthetic lethality in Myc-driven cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11988-11993 (2013).
- Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485 (7396), 55-61 (2012).
- Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Shackelford, D. B., et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin. Cancer Cell. 23 (2), 143-158 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Targeted Inhibition of EGFR and Glutaminase Induces Metabolic Crisis in EGFR Mutant Lung Cancer. Cell Reports. 18 (3), 601-610 (2017).
- Preclinical PET Imaging Systems | GA PET/X-ray & G8 PET/CT. Perkin Elmer. , Available from: http://www.perkinelmer.com/preclinical-pet-imaging/index.html (2018).
- Goodwin, J., et al. The distinct metabolic phenotype of lung squamous cell carcinoma defines selective vulnerability to glycolytic inhibition. Nature Communications. 8, 15503 (2017).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Dandekar, M., Tseng, J. R., Gambhir, S. S. Reproducibility of 18F-FDG microPET studies in mouse tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 48 (4), 602-607 (2007).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging: current applications and future directions. Journal of Nuclear Medicine. 49 (1), 1-4 (2008).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
- Vander Heiden, M. G., DeBerardinis, R. J. Understanding the intersections between metabolism and cancer biology. Cell. 168 (4), 657-669 (2017).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Possemato, R., et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature. 476, 346-350 (2011).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (7360), 552-563 (2015).
- Hassanein, M., et al. Preclinical evaluation of 4-[(18)F]fluoroglutamine PET to assess ASCT2 expression in lung cancer. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 18-23 (2016).
- Qu, W., et al. Preparation and characterization of L-[5-11C]-glutamine for metabolic imaging of tumors. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 98-105 (2012).
- Venneti, S., et al. Glutamine-based PET imaging facilitates enhanced metabolic evaluation of gliomas in vivo. Science Translational Medicine. 7 (274), 217 (2015).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Keng, P. Y., et al. Micro-chemical synthesis of molecular probes on an electronic microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (3), 690-695 (2012).
- Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. EJNMMI Research. 3 (1), 52 (2013).
