Summary
I øjeblikket er immunfluorescent farvning på faste celler metoden til bestemmelse af protein udtryk niveauer, når morfologiske oplysninger er også nødvendige. Denne protokol præsenteres heri giver en alternativ metode til immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke.
Abstract
Immunfluorescent farvning er den foretrukne metode til bestemmelse af protein udtryk niveauer i cellekultur systemer når morfologiske oplysninger er også nødvendige. Protokollen af andre pletter på paraffin-embedded celle blokke, præsenteres heri, er et glimrende alternativ til immunfluorescent farvning på paraffin-integreret fast celler. I denne protokol, en paraffin cellen blok fra HeLa celler blev udarbejdet ved hjælp af metoden tromboplastintid-plasma og immuncytokemi blev udført til vurdering af to spredning markører, CKAP2 og Ki-67. Kerner og cytoplasmatisk morfologi af HeLa celler var velbevarede i celle-blok dias. På samme tid var de CKAP2 og Ki-67 farvning mønstre i immuncytokemi meget lig dem i immunhistokemisk farvning i paraffin kræft væv. Med modificerede cellekultur betingelser, herunder præ-inkubation af HeLa celler serumfrit betingelser kunne effekten evalueres samtidig bevare arkitektoniske oplysninger. Afslutningsvis er immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke et glimrende alternativ til immunfluorescent farvning.
Introduction
I de fleste laboratorier anvendes paraffin-embedded celle blokke ikke almindeligvis. Tværtimod ansættes fast kulturperler celler, ikke paraffin-embedded celler, i subcellulært lokalisering undersøgelser. De faste kulturperler celler, er fluorescens i stedet for kromogen blevet anvendt. Derfor er immunfluorescent farvning i øjeblikket metoden til bestemmelse af protein udtryk niveauer i forskning beskæftiger celle kulturer1. Dias forberedt til immunfluorescent farvning, dog kan overholdes kun under immunfluorescent mikroskopi, som kan vise billeder helt forskellige fra dem, der er anført under flyet mikroskopi2. Derudover bevarelse af dias til immunfluorescent farvning kræver beskyttelse mod lys og fluorescerende signaler bliver svagere med gentagen eksponering for billedbehandling på grund af tabet af fluorescerende signal3. Resultater fra immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke er meget lig dem fra Immunhistokemi på paraffin-embedded væv4, og de kan let oversættes til kliniske oplysninger. Immuncytokemi kan derfor være et udmærket alternativ. Imidlertid har celle-blok forberedelse ikke været populære i grundlæggende forskningslaboratorier. I denne protokol, derefter, er celle-blok forberedelse og andre farvning fastsat til fremme af anvendelsen af denne metode inden for celle kultur studier.
Celle-blok forberedelse og immuncytokemi er ikke entydige metoder, og de er allerede blevet anvendt fra klinisk diagnose til grundforskning4,5. Selv om forskellige celle-blok forberedelse metoder har været rapporteret4,er6 plasma tromboplastintid-metoden enkel, omkostningseffektiv og let kan tilpasses. Derfor, i den protokol, der præsenteres i dette papir, plasma tromboplastintid-metode4,5,6,7,8 der bruges til forberedelse af paraffin-embedded celle blokke.
I den foreliggende undersøgelse, blev de detaljerede procedurer for udarbejdelse af tromboplastintid-plasma celle blokke og metoden immuncytokemi beskæftiger to spredning markører demonstreret. En markør er cytoskeleton-forbundet protein 2 (CKAP2), som er for nylig blevet rapporteret som en mitotiske markør9,10,11; den anden er Ki-67, som er den mest kendte spredning markør12. Repræsentative ordningen er vist i figur 1.
Protocol
Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det institutionelle Review Board National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).
1. Prøvetilberedning (30 min)
- Kulturen af HeLa celler (CCL-2, ATCC), at bruge 10 mL komplet DMEM medium (10% føtal bovint serum, 1% pen-strep) i en 100 mm kultur parabol. For at forberede serum-hungrende HeLa celler, der inkuberes sammenflydende HeLa celler i DMEM uden føtal bovint serum i 48 timer, som beskrevet i et tidligere studie11.
- For at frigøre cellerne, vaske dem med 2 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og Tilføj 2 mL 0,25% EDTA trypsin pr. 100 mm kultur parabol. Derefter inkuberes i 2-3 min i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Der tilsættes 5 mL af komplet DMEM medium til kultur fadet at deaktivere trypsin, og overføre de fritliggende celler til en 15 mL tube. Derefter centrifugeres celler på 300 x g i 10 min. til at danne en pellet.
- Fjern supernatanten, og vaske pellet to gange med 2 mL koldt PBS ved centrifugering ved 300 x g i 10 min.
- Efter fjernelse af supernatanten, tilsættes 1 mL 95% ethanol til celle pellet og bland celle pellet med ethanol af vortexing. Holde de fast celler på is indtil cellen-blok forberedelse.
2. celle-blok forberedelse (1 h 30 min)
- Forberedelsen af frosset plasma delprøver, indsamle EDTA plasma fra raske donorer blodet centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min. indsamle supernatanten plasma og alikvot 200-400 µL hver i mikrofuge rør. Gemme alikvoter ved-80 ° C indtil brug. Når frosset plasma delprøver er klar, hente dem og tø plasma ved inkubation ved 37 ° C i 5 min.
- Centrifugeres de faste celler på 700 x g i 10 min., derefter supernatanten.
- Bland celle pellet med 2 dråber (ca. 200 µL) af plasma, 2 dråber af tromboplastintid og 2 dråber af 0,025 M calciumchlorid. Så bland dem af pipettering.
- Lad blandingen til at danne en celle blodprop ved stuetemperatur i 10 min, som vist i figur 2A. Derefter vask celle blodprop med PBS to gange ved at hælde og fjerne PBS med pipette. Repræsentative hvide blodlegemer blodprop er vist i figur 2B.
- Fugt et stykke filtrerpapir med formalin, og wrap celle blodprop med den pre fugtede filtrerpapir. Placer derefter, størknet blandingen med en pincette i et væv kassette som vist i figur 2 c.
- Sted væv kassette i et glaskrukke indeholdende 50 mL "buffered" formalin (10% formalin i PBS) natten over ved 4 ° C for formalin fiksering.
3. Vævscentre forarbejdning og Paraffin Embedding (natten)
- Indlæse væv kassette indeholdende formalin-fast celle blodprop i et væv processor natten som tidligere beskrevet11. Væv behandling er for vand fjernelse og konditionering af faste celler før paraffin indlejring. Forskning uden væv forarbejdning, udføre væv forædling, som vist i tabel 1.
- Tænd den opvarmede indlejring, og 60 minutter senere, check, der er smeltet paraffin i formen metal deri (figur 2D).
- Tage dannede celle blodprop fra væv kassette og placere den i den smeltet paraffin inden for metal skimmelsvamp.
- Sted den nye væv kassette uden låg i metal formen indeholder cellen størkne i midten af den smeltet paraffin, og hæld mere smeltet paraffin i væv kassetten og på den metal skimmelsvamp. Så, lad paraffin størkne i den kolde plade i 30-60 sekunder.
- Adskille væv kassette fra formen metal. Derefter, paraffin cellen blok er klar til immuncytokemi. Den integrerede celle blodprop i paraffin-embedded cellen blok er angivet med pil i figur 2E.
4. forberedelse af dias til immuncytokemi (1 h)
- Kontrollere området for celle blodprop i paraffin cellen blok, og skær cellen blok i skiver med tykkelser på 3-4 µm ved hjælp af en mikrotom. Sætte paraffinsnit på silan-belagt glas lysbilleder, som vist i figur 2F.
- Objektglassene sektion i et 37 ° C ovn i 30 min at gøre sektionerne overholde dias.
5. immuncytokemi celle blokke (6 h)
Bemærk: For andre farvning på celle-blok sektioner, forskellige kits kan bruges (Se Tabel af materialer). Alle disse kits har forskellige følsomheder og særlige forhold afhængigt af deres ændringer.
- Inkuber sektioner i 50 mL xylen i 4 min til de-paraffinize.
- Glassene inkuberes i 100% ethanol i 2 min. til dehydrering, og to gange i 95% ethanol, og 80% ethanol i 2 min. Fjern derefter ethanolen i rindende vand i 10 min.
- For antigen hentning, placere dias i en krukke indeholdende 40 mL Tris-EDTA hentning-buffer pH 9,0, og kog i et komfur i 30 min.
- Vaske dias under rindende vand, og der inkuberes dem i 95% ethanol i 10 min. ved 4 ° C. Derefter markere området celle-farvning på dias med Pap pen for nem identifikation.
- Vask dias i Tris-bufferet saltvand indeholdende 0,2% Tween 20 (TBS-T), og der inkuberes i hydrogenperoxid blok (Se Tabel af materialer) ved stuetemperatur for 15 min til at fjerne enhver rest peroxidase aktivitet. Derefter vask dias i TBS-T tre gange i 2 min.
- Forberede fortyndet antistof løsning ved at fortynde primære antistof i protein blok (Se Tabel af materialer). For eksempel, fortyndet CKAP2 primære antistof kan være 1: 100, og Ki-67 antistof 1: 500. Derefter glassene inkuberes i 100 µL fortyndede antistof-løsning 1 h.
- Efter vask i TBS-T fem gange i 2 min., glassene inkuberes i den primære antistof forstærker i kit i 15 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Efter vask i TBS-T fire gange i 2 min., tilsæt 2 dråber af HRP polymer (en sekundær antistof mærket med peberrodsperoxidase), og glassene inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Efter vask i TBS-T fem gange for 2 min, tilsættes 100 µL af diaminobenzidine (DAB) løsning (Se Tabel af materialer), og glassene inkuberes i 3 min.
- Efter vask i TBS-T to gange, tilføje 100 µL af hæmatoxylin løsning (blanding af 100 µL af hæmatoxylin og 600 µL destilleret vand), og glassene inkuberes i 1 minut.
- Efter vask dehydrere dias i TBS-T engang, ved at inkubere i 95% ethanol i 2 min., dypning i 95% ethanol engang og dypning i 100% ethanol to gange. Derefter glassene inkuberes i 40 mL xylen i en glaskrukke i 5 min.
- Når diasene er tør fra xylen, montere de respektive coverslips.
- Observere farvning mønstre ved hjælp af lysmikroskopi.
Representative Results
I et hæmatoxylin-og eosin-farvede dias fra paraffin-embedded cellen blok (figur 3AB) er de fleste af kerner, og cytoplasmaet af cellerne intakt, tyder på, at den morfologiske bevarelse er fremragende med den nuværende protokol ( Figur 3A). I andre farvning, blev positive CKAP2 farvning observeret i kondenseret kromatin, mitotiske spindel og cytoplasma (figur 4), som tidligere rapporteret10. Ki-67 farvning blev observeret i cellekerner, som forventede (figur 4). Kun de celler med CKAP2 farvning i kondenseret kromatin (Se pile i figur 4AB) var mitotiske celler. Mange CKAP2-positive celler blev vist i højt mitotiske HeLa celler, der var blevet udarbejdet efter en inkubation i komplet medium (figur 4A). I sammenligning var der få CKAP2-positive celler i serum-hungrende HeLa celler (figur 4B). De fleste af de stærkt mitotiske HeLa celler var Ki-67 positive (figur 4 c). Contrastingly, Ki-67-positive sats i serum-hungrende HeLa celler forblev så højt som ~ 50% (figur 4D). Disse resultater er ganske sammenlignelig med en tidligere rapport11, hvilket tyder på, at CKAP2 er en mere pålidelig spredning markør i kræftceller end er Ki-67.
I dårligt forberedte celle blokke, kerner adskilles fra cytoplasma, og der er også, resultantly, dårlig morfologiske bevarelse. Længere end natten inkubation af faste celler i køleskab kan forårsage sådanne dårlige resultater. Et andet vigtigt problem er, at cellerne ikke farves godt ved immuncytokemi, uanset den fremragende morfologi. Dette problem opstår oftere når celle blodprop er lille. Typisk, farvning intensiteten er uregelmæssig som vist i figur 3B; men når celle blodprop er større, der er meget mindre chance for uregelmæssig farvning. Derfor, i denne protokol, vi øget mængden af plasma tromboplastintid og calciumchlorid for at danne en stor celle blodprop.
Figur 1: celle-blok forberedelse ordningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Illustration af paraffin celle-blok forberedelse. (A) tromboplastintid-plasma celle blodprop i røret. (B) TP celle blodprop efter PBS vask. C celle blodprop på fugtede filtrerpapir. (D) væv-embedding station med smeltet voks. Metal skimmelsvamp (pil) holder smeltet voks til størkning. (E) paraffin-embedded celle blodprop (pil) indlejret i paraffin eller paraffin-embedded cellen blok. (F) tynd paraffin afsnit på den midterste del af en belagt slide. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: celle-blok forberedelse og bekræftelse af kvaliteten af hæmatoxylin og eosin og immunfarvning. (A) hæmatoxylin-og-eosin-farvede billede af HeLa celler i en paraffin-embedded celle-blok sektion. (B) uregelmæssig farvning af Ki-67 i immuncytokemi på en dårligt forberedt paraffin-embedded celle-blok sektion. Skala barer er a 100 og b 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: andre farvning på paraffin-embedded cellen blok for HeLa celler. (A) CKAP2 farvning meget mitotiske betingelser. (B) CKAP2 farvning serum-hungrende betingelser. C Ki-67 farvning meget mitotiske betingelser. D Ki-67 farvning serum-hungrende betingelser. 100 μm skala barer er vist. Pilespidserne angive CKAP2-positive celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Procedure | Trin | Løsning | Tid og temperatur |
| Dehydrering | 1 | 70% alkohol | 15 min/RT |
| 2 | 80% alkohol | 15 min/RT | |
| 3 | 95% alkohol | 15 min/RT | |
| 4 | 100% alkohol | 15 min/RT | |
| Clearing | 1 | Xylen | 60 min./4 ° C |
| 2 | Xylen | 10 min/RT | |
| 3 | Xylen | 10 min/RT | |
| 4 | Xylen | 10 min/RT | |
| * RT, stuetemperatur |
Tabel 1. Væv under proceduren.
Discussion
Immunfluorescent farvning på faste kulturperler celler er i øjeblikket metoden til bestemmelse af protein udtryk niveau i cellerne samtidig bevare morfologiske oplysninger1. Immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke kan dog være et udmærket alternativ. De detaljerede procedurer for udarbejdelse af paraffin-embedded celle blokke og immuncytokemi er blevet beskrevet i denne protokol, og vi håber, det kan lette anvendelsen af immuncytokemi i celle undersøgelser.
Immuncytokemi har flere fordele over immunfluorescent farvning. Immunfluorescent farvning for celler som regel kræver frisk kulturperler celler, men paraffinblokke celle kan opbevares ved stuetemperatur for flere år13. Derudover kan immuncytokemi på celle blokke udforske intracellulære udtryk mønstre ved at ansætte de samme antistof bruges i rutinemæssige Immunhistokemi på humane væv4. Derudover kan det undersøge ændringer i protein niveauer eller posttranslationelle ændringer enten af pre inkubere celler med forskellige stoffer eller under forskellige kultur betingelser11.
I modsætning til fordelene ved andre farvning, udarbejdelse af paraffin-embedded celle blokke tager tid og er dyre14. Også, de fleste forskningslaboratorier mangler erfaring i denne teknik, og tekniske fejl under sådanne omstændigheder er fælles. De mest almindelige fejl er dårlig bevarelse af celle morfologi og dårlig eller uregelmæssig andre farvning på cellen blok paraffinsnit. Disse og de fleste andre kan undgås ved at gøre celle blokke på de bedste betingelser, celle og bruger nok opløsning til at danne celle blodpropper.
Som en demonstration af denne protokol, celle blokke blev udarbejdet for HeLa celler, og andre pletter blev udført to spredning markører, CKAP2 og Ki-67, som tidligere rapporteret11. Immuncytokemi, cellerne blev manipuleret ved inkubering i medier med og uden føtal bovint serum, og effekten af serum sult kunne observeres. Disse tilberedte paraffin-embedded celle blokke kan være ansat for et stort antal af antistoffer, fordi mange dias kan fremstilles af en celle blok ved hjælp af kun en 4-5 µm tykt celle-blok sektion pr. slide. Derfor kan udtrykket mønstre svarende til to forskellige forhold evalueres med flere forskellige antistoffer. Immunfarvning mønstre for CKAP2 og Ki-67 i kræft væv er allerede blevet rapporteret9,10,11,12, og de andre farvning resultaterne kunne vurderes nemt, fordi de farvning mønstre var meget lig dem fra Immunhistokemi.
Afslutningsvis, kan andre farvning på paraffinblokke celle være et glimrende alternativ til immunfluorescent farvning; Desuden, det kan være nemt og pålideligt ansat i grundforskning til udtryk profilering i cellelinjer samtidig bevare morfologiske oplysninger.
Disclosures
Alle forfattere har erklæret ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til K.-M.H. fra National Cancer Center, Korea (1510121) og National Research Foundation, Korea (nr. NRF-2015R1A2A2A04007432).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
| Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
| Paraffin | Leica | 39601006 | |
| Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
| Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
| Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
| DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
| Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
| TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
| Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
| Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
| Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
| Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
| Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
| DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
| Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
| Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
| Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
| Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
| 15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
| 100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
| Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
| Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
| Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
| Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
| Microscope | Olympus | CX-21 | |
| Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
| Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
| Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |
References
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls. J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).
- Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions. Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).
- Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology. J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).
- Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology. Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).
- Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens. Cancer. 96, 204-209 (2002).
- Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material. Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).
- Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties. Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).
- Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis. Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).
- Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer. PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).
- Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).
- Beutner, E. H. Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method. Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).
