Summary
Här presenterar vi och kontrast två protokoll används för att decellularize växt vävnader: en diskmedel-baserade strategi och en tvättmedel-gratis strategi. Båda metoderna lämna bakom den extracellular matrisen av växt vävnader används, som sedan kan utnyttjas som ställningar för tissue engineering program.
Abstract
Autolog, syntetiska och animaliska grafterna för närvarande används som ställningar för vävnad ersättare har begränsningar på grund av låg tillgänglighet, dålig biokompatibilitet och kostnad. Växt vävnader har goda egenskaper som gör dem unikt lämpad för använda som ställningar, såsom höga yta, utmärkt vattentransport och lagring, sammankopplade porositet, konstaterad vaskulär nätverk och ett brett utbud av mekaniska egenskaper. Två framgångsrika metoder för växt decellularization för tissue engineering program beskrivs här. Den första metoden bygger på tvättmedel bad för att ta bort cellulära material, som liknar tidigare etablerade metoder användas för att rensa däggdjur vävnader. Andra är en tvättmedel-fri metod anpassad från ett protokoll som isolerar leaf vaskulatur och innebär användning av en uppvärmd blekmedel och salt bad att rensa blad och stjälkar. Båda metoder ge ställningar med jämförbara mekaniska egenskaper och låg cellulära metaboliska effekt, vilket möjliggör för användaren att välja det protokollet som bättre passar deras avsedda tillämpning.
Introduction
Vävnadsteknik dök upp på 1980-talet att skapa levande vävnad substitut, och potentiellt adress betydande organ och vävnad brist1. En strategi har använt ställningar för att stimulera och vägleda kroppen att regenerera saknas vävnader eller organ. Även om avancerad tillverkning metoder såsom 3D-utskrift har producerat ställningar med unika fysiska egenskaper, förblir förmågan att tillverka ställningar med ett varierat utbud av uppnåeliga fysiska och biologiska egenskaper en utmaning2 , 3. Dessutom på grund av en funktionell vaskulär nätverk, dessa tekniker har begränsats i regenererande 3-dimensionell vävnader. Användning av cell-lösa djur och mänskliga vävnader som ställningar har hjälpt kringgå detta problem4,5,6,7. Men höga kostnader, sats till sats variabilitet och begränsad tillgänglighet kan begränsa utbredd användning av cell-lösa djur ställningar8. Det finns också farhågor om potentiella sjukdomsspridning till patienter och immunologisk reaktion mot vissa cell-lösa däggdjur vävnader9.
Cellulosa, härrör från växt- och bakteriella källor, har använts i stor utsträckning att generera biomaterial för ett brett användningsområde inom regenerativ medicin. Några exempel är: Ben10,11, brosk12,13,14 och15för sårläkning. Ställningar som består av cellulosa har en fördel i att de är hållbara och motståndskraftiga mot att brytas ner av däggdjursceller. Detta är på grund av att däggdjursceller inte producerar enzymerna som är nödvändiga för att bryta ner cellulosa molekyler. I jämförelse, ställningar produceras med hjälp av makromolekyler från den extracellulära matrixen, såsom kollagen, bryts lätt ned16 och kanske inte passar till långsiktiga program. Kollagen ställningar kan stabiliseras av kemiska cross-linking. Det finns dock en avvägning på grund av den inneboende toxiciteten för de cross-linkers som påverkar biokompatibiliteten av ställningar17. Omvänt, cellulosa har potential att vara närvarande vid implanteringsstället för längre perioder eftersom det är okänsligt mot enzymatisk nedbrytning av däggdjursceller18,19,20. Detta kan ändras genom att trimma nedbrytningshastighet genom hydrolys förbehandling och samtidig leverans av ställningar med cellulases21. Biokompatibiliteten av cell-lösa vegetabiliska cellulosa ställningar i vivo har också påvisats i en studie på möss22.
Genom hundratals miljoner år av evolution, har växter förfinat sin struktur och sammansättning för att öka effektiviteten i vätsketransport och lagring. Anläggningen vaskulär fartyg minimera hydrauliska motstånd genom förgrening till mindre fartyg, liknar den hos däggdjur vaskulatur enligt Murrays lag23. Efter decellularization bibehålls växtens komplext nätverk av fartyg och sammankopplade porer. Med tanke på det stora antalet olika växtarter som är lättillgänglig har vegetabiliska ställningar potential att övervinna designbegränsningar som för närvarande påverkar ställningar i tissue engineering24,25. Exempelvis visat Modulevsky et al. att angiogenes och cell migration inträffade när cell-lösa apple vävnad var implanteras subkutant på baksidan av en mus22. Likaså visade Gershlak et al. att endotelceller kunde odlas inom vaskulatur cell-lösa blad24. I en separat experiment kunde Gershlak et al. också visa att hjärtmuskelcellerna kan odlas på ytan av blad och skulle kunna ingå avtal24.
Växter även komplexa organisationen från cellnivå till makroskopiska skalan, vilket är svårt att uppnå även med de mest avancerade tillverkningstekniker som utvecklat hittills. Den komplexa hierarkiska utformningen av växt vävnader gör dem starkare än summan av deras beståndsdelar26. Växter har en uppsjö av olika mekaniska egenskaper alltifrån styv och tuff komponenter såsom stjälkar, till mycket mer flexibel och smidig kära som lämnar27. Bladen varierar beroende på Art storleksmässigt, forma, bryta styrka, graden av vaskularisering, och kan bära olika grader av hydrophilicitet. Sammantaget tyder dessa växt-egenskaper på att cell-lösa växter kan tjäna som unika och mycket funktionell medicintekniska produkter, inklusive som Vävnadsrekonstruktion ställningar.
Detta protokoll fokuserar på två metoder att decellularize växt vävnader, såsom blad och stjälkar, för användning som ställningar i vävnadsteknik. Den första metoden är ett diskmedel-baserade teknik som använder en rad bad att ta bort DNA och cellulära materia, som har anpassats från en allmänt använd teknik decellularize däggdjur och plantera vävnader6,22,25 ,28,29,30. Den andra metoden är fritt från rengöringsmedel och är anpassade från en ”skeletonization”-protokollet används ofta för att ta bort de mjuka vävnaderna i blad31. Tidigare arbete visade att puttra bladen i en blekmedel och natriumbikarbonat lösning underlättat separation av kärlsystemet från omgivande mjukvävnad31. Denna teknik kan hänvisas tillbaka till experiment som utförts i den 17: e och 18: e århundraden, såsom Albertus Seba32 och Edward Parrish33arbete. Dessa experiment centrerad kring lämnar växtmaterial, som löv och frukt, nedsänkt i vatten under längre tid (veckor till månader) och att låta mjukare vävnader att förfalla bort naturligt. Här är metoden ”skeletonization” anpassad för att använda mildare villkor, såsom längre inkubationstider vid lägre temperaturer, att ta bort cellulära rester och undvika påtagligt störa mjuk vävnad struktur. För de experiment som beskrivs häri, tre växttyper användes: Ficus hispida, Pachira aquatica och en art av Garcinia. Resultaten av DNA kvantifiering, mekaniska tester och inverkan på cellulära metaboliska aktiviteten från båda metoderna beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. decellularization av växtvävnad använder metoden med diskmedel-baserade
-
Använd färska eller frysta F. hispida, leaf prover. Frysa oanvända färska prover i en frys-20 ° C och store för framtida användning (upp till ett år).
Obs: Använd stam eller blad vävnad av nästan varje önskad anläggning. Utökad lagring gånger kan skada vävnader.- Bestämma storleken och formen av prover bearbetas utifrån provets avsedd användning (dvs. prover strimlat lämpar sig väl för mekanisk provning program, under tiden 8 mm skiva prover är användbara i flera odlingsskålar applikationer ). Skär blad i 8 mm skivor med en vass, ren biopsi punch medan nedsänkt under rumstemperatur (20-25 ° C) avjoniserat H2O.
Obs: Detta protokoll kan användas på hela blad och stjälkar. Dock kommer mindre prover decellularize snabbare. - Inkubera proverna för 5-10 min vid rumstemperatur (20-25 ° C) avjoniserat H2O på en skaka plattan till låg hastighet inställningen att tvätta eller Tina dem. Använd tillräckligt avjoniserat H2O att se till att alla prover är ordentligt fuktade.
- Bestämma storleken och formen av prover bearbetas utifrån provets avsedd användning (dvs. prover strimlat lämpar sig väl för mekanisk provning program, under tiden 8 mm skiva prover är användbara i flera odlingsskålar applikationer ). Skär blad i 8 mm skivor med en vass, ren biopsi punch medan nedsänkt under rumstemperatur (20-25 ° C) avjoniserat H2O.
-
Bereda en lösning av 10% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) i avjoniserat H2O. plats proverna i en lämplig behållare (en glas eller plast skål är perfekt) och lägga till SDS lösning för att helt täcka proverna. Inkubera 5 dagar vid rumstemperatur (20-25 ° C) prover på en skaka plattan till en låg hastighet för att förhindra skador på proverna.
Obs: Inte överbefolka behållaren, eftersom detta kan bromsa decellularization processen och leda till ojämn behandling av SDS. Under detta steg bör prover förvärva en brun nyans.- Efter 5 dagar, ersätta SDS lösningen med avjoniserat H2O. Inkubera proverna för en ytterligare 10-15 min på skaka plattan att noggrant skölja av eventuell kvarstående SDS-lösning.
- Förbereda en 1% (v/v) icke-jonisk tensid i 10% (v/v) blekmedel lösning. Att göra en 500 mL lösning, blanda 5 mL av den icke-jonisk tensiden med 50 mL av blekmedel sedan tillsätt 445 mL avjoniserat H2O. Sänk prover i nygjord lösning.
Obs: Icke-joniskt ytaktivt ämne/blekmedel lösningen har inte en lång hållbarhet, därför, bör användas inom 48 timmar efter beredning. -
Ersätta de icke-joniska ytaktiva ämnet/blekmedel lösningen varje 24 h tills proverna rensas helt (se figur 1A för visuell jämförelse). Sedan Inkubera provet i avjoniserat vatten på en skaka plåt för 2 min för att skölja bort överflödig icke-joniskt ytaktivt ämne/blekmedel lösningen. Ange skaka plattan till en låg inställning för att förhindra skada proverna.
Obs: Den tid som krävs för att rensa de prover som används varierar beroende på typ och arter av anläggningen. Den kompletta missfärgning av proverna är vägledande i full decellularization (utföra DNA kvantifiering för att säkerställa noggrann clearing).- Lyophilize proverna för att lagra dem upp till ett år (flash frysning med flytande kväve är att föredra, frysning prover i-80 ° C är också acceptabelt) och förvara dem i rumstemperatur (20-25 ° C) i låg luftfuktighet.
- Rekonstituera prover i Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) använder nog att pälsen prover. Skölj prover 2 - 3 gånger i serumfritt media försiktigt med en mikropipett före användning (dvs. använda 150-300 µL per skölj, i en standard 24 väl platta).
Obs: Tris-HCl buffert och serum-fria medier (dvs DMEM, men någon grundläggande cellkultur media kan ersättas) är mer effektiva att sänka effekten att cellernas viabilitet av SDS behandlade prover än de som behandlades med avjoniserat H2O ensam.
2. beredning av prover med metoden tvättmedel-fri Decellularization
Obs: De första stegen i proceduren sammanfaller med steg 1,1-1.1.2 (se ovan).
- Förbereda en 5% (v/v) blekmedel (NaClO) och 3% (w/v) natriumbikarbonat (NaHCO3) lösning. Värm lösningen i ett dragskåp till 60-70 ° C för F. hispida leaf prover skuren i 8 mm skivor under omrörning på en värmeplatta.
Obs: Natriumbikarbonat kan ersättas med natriumkarbonat (Na2CO3) eller natriumhydroxid (NaOH). Önskad temperatur varierar kraftigt (från rumstemperatur till 90 ° C) och bör anpassas efter egenskaperna för de prover som används. - När lösningen når det önska temperaturområdet, dränka proverna och minska omrörning hastigheten för att undvika att skada dem. När proverna är synbart rensat (se figur 1B för visuell jämförelse), ta bort från badet noggrant. Inkubera prover en gång i avjoniserat H2O 1-2 min att ta bort överflödig blekmedel lösning.
Obs: Den tid som krävs för att klara proven kan variera kraftigt. Skuren persilja kan exempelvis rensas på 10-15 min, medan tjockare eller större prover såsom hela blad eller stjälkar kan ta timmar i hög temperatur bad att helt tömma. - Lyophilize proverna och förvara dem i rumstemperatur (20-25 ° C) i låg luftfuktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Båda metoderna gav ställningar som var lämpliga för cellodling och Vävnadsrekonstruktion applikationer. Figur 1 visar det allmänna arbetsflödet för decellularization processen med en intakt blad för diskmedel-baserade metod och skära prover (8 mm diameter) för metoden tvättmedel-fri. Lyckad decellularization av Ficus hispida vävnader efter båda metoderna gav tydlig och intakt prover (figur 1A och 1B). Det var möjligt att decellularize hela anläggningen vävnader (figur 1A); dock föreföll mindre prover klart snabbare och mer effektivt. Ett potentiella problem som observerats med metoden diskmedel-baserade inblandade heterogena decellularization till följd av för tidig borttagning från icke-jonisk tensid badet (figur 1 c). En nackdel med metoden tvättmedel-fri är att skador kan uppstå på grund av långvarig inkubation i uppvärmd badet (figur 1 d).
De mekaniska egenskaperna av cell-lösa ställningar med båda metoder undersöktes med enaxlig brottgräns testning som man gjort i andra studier24,34. Denna testning gav maximal Tangerande modulus (MTM) (figur 2A), påfrestning vid hjärtsvikt (SAF) (figur 2B) och brottgräns (UTS) (figur 2 c) för F. hispida och Pachira aquatica prover. P. aquatica prover tillagas med båda decellularization protokoll visas liknande mekaniska egenskaper över alla tre av de parametrar som mäts. F. hispida proverna visade en liknande trend i samtliga fall utom UTS testning. Särskilt hade prov beredd med diskmedel-baserade (SDS) protokollet högre genomsnittliga UTS resultat än de tillagade med metoden tvättmedel-fri (blekmedel). Dessa resultat visar att prover som samlats in från olika växtarter kan producera distinkta cell-lösa byggnadsställning boenden när beredd via de två decellularization-protokollen.
För att mäta DNA borttagning, prover rensades med någon av metoderna och deras genomiskt DNA isolerades med hjälp av en tidigare etablerat protokoll35. Båda decellularization metoder (diskmedel-baserade och rengöringsmedel-fri) minskade signifikant genomisk DNA innehållet av prover till 2,47 ng DNA/mg (n = 3, s = 0,18) och 2,71 ng DNA/mg av vävnad (n = 3, s = 1.60) respektive (figur 2D). Icke-cell-lösa prover hade 104.67 ng DNA/mg av vävnad (n = 3, s = 26.21) (figur 2D). Den betydande minskningen av DNA-innehåll efter decellularization anges en effektiv borttagning av växtcell roll.
Påverkan på cellernas viabilitet av decellularization metoder bedömdes genom att mäta den metaboliska aktiviteten av mänskliga dermal fibroblaster (hDF) odlade i 2 dagar i närvaro av cell-lösa P. aquatica eller Garcinia ställningar. hDFs hade högre metabolisk aktivitet när odlade i närvaro av ställningar cell-lösa via metoden tvättmedel-fri kontra de förberedda via diskmedel-baserade metoden (figur 3A). För att säkerställa noggrann borttagning av de reagens som används under decellularization, ytterligare en uppsättning experiment utfördes där spolades de beredda ställningar i stor utsträckning före cellodling. Två separata tvätt metoder testades på prover som tillagade den diskmedel-baserade strategin: en tvätt i Tris-HCl buffert (10 mM, pH 8,5) följt av en tvätt i Serum fria medier kontra 2 tvättar i avjoniserat H2O. Båda metoderna används sista tvätt steg med 1 x PBS. Påverkan på de däggdjursceller därefter utsätts för de cell-lösa växt ställningar mättes med samma metaboliska aktiviteten analys som ovan. Tris-HCl buffert (10 mM, pH 8,5) följt av Serum gratis Media bidragit till att minska påverkan på cellulära metaboliska aktivitet jämfört med avjoniserat H2O, att göra prover som behandlats med metoden diskmedel-baserade jämföras med prover från de tvättmedel-free metod (figur 3B).
Det var tidigare visat att däggdjursceller kunde växa på ställningar som tillagas med diskmedel-baserade strategi25; Därför var det nödvändigt att demonstrera detta på prover som utarbetats av metoden tidigare oprövade tvättmedel-fri. Mesenkymala stamceller (MSC) var seedad på cell-lösa F. hispida leaf prover (8 mm-skivor) på 20 000 celler per byggnadsställning och tillåtet för att Inkubera under 24 h. Dessa ställningar var functionalized före cellen introduktion med en RGD-dopamin konjugat att underlätta klibba. Figur 4 illustrerar bilderna från ett typiskt urval. En ljusa fältet bild samlades för att visa den övergripande strukturen av ett avsnitt av det prov som används (figur 4A). MSCs var målat med calcein och avbildas med fluorescens Mikroskop (figur 4B). Bilderna var sedan överlagras (figur 4 c) för att visa platsen för de växande cellerna på ytan av blad.
Figur 1 . Det allmänna arbetsflödet för decellularization av växt vävnader. Typiskt arbetsflöde för decellularization av växt vävnader (tvätt- och förberedande steg är universella); (A) övre sökvägen är för diskmedel-baserade metod (B) botten för metoden tvättmedel-fri. (C) en ofullständig/misslyckades decellularization av P. aquatica blad med diskmedel-baserade metoden för tidig borttagning från den icke-joniskt ytaktivt ämne/bleach bath (D) ett skadat decellularization av F. hispida blad på grund av långvarig inkubation i uppvärmd blekmedel lösning i metoden tvättmedel-fri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Jämförelse av mekaniska egenskaper och effektiviteten av decellularization mellan metoderna. Genomsnitt ± SD; statistisk analys utfördes med hjälp av två-sampel t-test och p värdena var statistiskt signifikant (mindre än eller lika med 0,05). Jämförelse av mekanisk provning resultat mellan prover av F. hispida och P. aquatica (blå staplar används för diskmedel-baserade strategi, röd för den tvättmedel-fri och grön för obehandlade prover) (F. hispida diskmedel-baserade n = 4, tvättmedel-gratis n = 2; P. aquatica tvättmedel-base n = 3, tvättmedel-gratis n = 4) (A) maximalt tangens Modulus (MTM) (B) påfrestning vid misslyckande (SAF) (C) och ultimata draghållfasthet (UTS). (D) ett dsDNA kvantifiering assay kördes i tre exemplar på tre prover från varje grupp: obehandlad (färska, n = 3), metoden tvättmedel-fri (blekmedel, n = 3) och diskmedel-baserade metoden (SDS, n = 3), p -värden är för decellularization metod gruppen jämfört med obehandlade urvalsgrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Metabolisk aktivitet assay resultat jämföra effekt mellan de två metoderna som decellularization. Genomsnitt ± SD; statistisk analys utfördes i två-sampel t-test och p -värden som anges där statistiskt signifikant (mindre än eller lika med 0,05). Cellulära metaboliska aktiviteten mättes i närvaro av vävnadsprover på både P. aquatica och en art av Garcinia (normaliserad till kontrollbrunnarna med inget prov lagt till) att visa en (A) jämförelse av metabola effekterna av två decellularization metoder (n = 3 för varje grupp) och (B) jämförelse av påverkan på metabolisk aktivitet med hjälp av två tvätt metoder i diskmedel-baserade protokoll: Tris-HCl buffert (10 mM, pH 8,5) kombinerat med Serum fria medier (n = 4) vs. avjoniserat H 2 O (n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Mesenkymala stamceller (MSC) växer på ytan av cell-lösa Ficus hispida blad, functionalized med en RGD-dopamin konjugat. MSCs var odlas på F. hispida blad, cell-lösa av metoden tvättmedel-fri och functionalized med en RGD-dopamin konjugat (500 µm skala barer har lagts till för referens) (A) ljusa fältet bild av ett avsnitt av cell-lösa blad (B ) Fluorescens bild av calcein målat MSCs växer på blad yta (C) sammanfogad ljusa fält och fluorescens bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri, beskrivs två metoder för att decellularize växt vävnader. Resultaten presenteras här, tillsammans med resultaten av tidigare studier25, tyder på att protokollen uträcka sannolikt gäller för ett brett spektrum av växtarter och kan utföras på både stjälkar och blad. Dessa förfaranden är enkel och kräver inte specialutrustning, så växten decellularization kan utföras i de flesta laboratorier. Det är anmärkningsvärt att ställningar måste vara functionalized efter decellularization, för att underlätta däggdjursceller vidhäftning. Olika funktionalisering tekniker för att aktivera däggdjursceller vidhäftning och tillväxt på växt vävnader har varit beskrivs någon annanstans25 och är inte ämnet av det nuvarande manuskriptet.
Det sista steget i båda decellularization protokoll presenteras här (figur 1) var kritisk till deras framgång. När utför endera metoden inte överbefolka badet som detta resulterar i en ojämn clearing. Dessa metoder kan tillämpas på hela blad och stjälkar; Detta ökar dock tidsperiod som krävs för att klara dem. Kontrollera att proverna är helt nedsänkt för att hålla clearing konsekvent under hela provet. Decellularization bör helst klara växt vävnader i den cellulära fråga samtidigt minimera strukturella skador. Det är troligt att metoden tvättmedel fritt kan ändras som behövs för att arbeta med önskad exemplar. Högre bad temperaturer kan resultera i snabbare clearing gånger men kan också resultera i mer skada till proverna om de är alltför ruvade. Lägre temperaturer kan kräva längre inkubationstider och vore lämpligt för skörare prover. Koncentrationen av blekmedel i lösningen kan också ändras för att accelerera eller bromsa processen decellularization. När du testar nya prover för användning med metoden tvättmedel-fri, det rekommenderas att börja med en bad temperatur av 50-60 ° C med täta kontroller av utvecklingen av decellularization (helst varje 15-20 minuter) tills de raderas på lämpligt sätt. Detta temperaturområde tolererades väl av de flesta av de växtarter som testades under optimering av tekniken. Efter avslutad, proverna kan inspekteras visuellt och manuellt för att säkerställa att de inte har alltför inkuberas och skadas ohjälpligt som skulle anges genom sönder eller sönderfall efter borttagning från badet. Prover som tillagas med detta synsätt Visa en minskat inverkan på celltillväxten (se figur 3A) än den diskmedel-baserade metoden med endast tvätt i avjoniserat H2O. Det rekommenderas dock att tvätta dessutom med Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) och serum-fria medier, särskilt i känsliga applikationer.
Diskmedel-baserade (SDS) metoden sannolikt gäller för de flesta växtarter och är särskilt användbart för att rensa hela blad och känsliga prover eftersom det krävs minimal fysisk agitation. Som nämnts ovan, är det sista steget avgörande för decellularization av prover. Prover med distinkta fysiska egenskaper kan rensas genom att justera inkubationstiden i icke-jonisk tensid bad. En betydande nackdel med denna process är att cell-lösa vävnader kan innehålla spår av de rengöringsmedel som används, och som därefter kan påverka cellulära metaboliska aktiviteten hos däggdjursceller. Därför rekommenderas noggrann tvätt steg före användning. Här konstaterades att proverna tvättas med Tris-HCl buffert (10 mM, pH 8,5) följt av serum-fria medier hade högre cellviabilitet än de tvättas med avjoniserat H2O före deras användning (figur 3B).
När du lagrar obehandlade prover för framtida användning i antingen metod, är det viktigt att övervaka dem för skador att säkerställa att de resulterande ställningar inte kommer att påverkas. Skador kan visas som missfärgning av den växt vävnader samt sprickbildning eller överdriven sprödhet när de hanteras. Det rekommenderas att övervaka proverna på veckobasis för att använda dem innan de inte längre användbar och måste kasseras. Uppkomsten av skador varierar mellan provtyper, med tjockare mer robust prover som varar längre.
I allmänhet hålla växter mycket löfte som en potentiell källa av biomaterial. Detta är stärkt av sin naturligt utvecklade intrikata strukturer och egenskaper som hjälper dem att växa i sina infödda miljöer. Framgångsrika utnyttjande av växt vävnader som tissue engineering ställningar föreslår ett potentiellt billiga alternativ till kostsamma, och ofta svåra att utforma, biomaterial. Växtvävnads ytans topografi, som till sin natur varierar från en art till en annan, kan också utnyttjas till direkta rumsligt orienterade cellulära tillväxt25. En tidigare studie har exempelvis visat att mänskliga celler svarar på topografiska ledtrådar på cell-lösa växter25, således dessa ställningar kan användas till kultur celler i mycket organiserade mönster25. En annan funktion som är önskvärt i vävnadsteknik är de novo perfusability. Växt vävnader har utvecklats under hundratals miljoner år för att vara extremt effektiva på vätsketransport och deras vaskulär nätverk kan vara effektivt perfunderade24. Detta boende kan potentiellt användas för att vägleda cellulära migration och angiogenes med slutmålet att skapa ny vävnad för kliniska tillämpningar. Detta stärks av resultaten från tidigare studier som visat att biomaterial med höga yta och sammankopplade porositet främjar cellproliferation och när implanteras i vivo, aktivera aktiv migrering av vara värdcellerna in i implantatet36,37,38,39. Den höga yta och den sammankopplade porositeten är också kännetecknande för växt vävnader40,41,42, alltså vegetabiliska ställningar har potential att integrera med omgivande vävnader invivo. Dessutom senaste studier fann att cell-lösa blad kan vara framgångsrikt perfusion med celler24 och att när mänskliga celler var seedad på cell-lösa växt vävnader, de överensstämde med deras topografiska cues25. När tas alla tillsammans, vegetabiliska ställningar besitter de nödvändiga egenskaperna tillämpas framgångsrikt mot vävnad tekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka John Wirth av Olbrichs trädgårdarna för nådigt levererar de prover som används i detta projekt. Detta arbete stöds delvis av den nationella hjärta, lunga och Blood Institute (R01HL115282 till G.R.G.) National Science Foundation (DGE1144804 till J.R.G och G.R.G.), och University of Wisconsin Institutionen för kirurgi och Alumni fond (H.D.L.). Detta arbete var också stöds delvis av Naturvårdsverket (STAR grant nr 83573701), National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 och UH3TR000506) och National Science Foundation (IGERT DGE1144804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
References
- Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
- Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
- Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
- Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
- Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
- Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
- Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B.
- Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
- Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
- Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
- Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
- Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
- Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
- Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
- Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
- Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
- Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
- Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
- Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
- Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
- Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
- Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R.
- Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
- Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Guyette, J., et al.
- Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
- Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
- Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
- Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
- Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
- Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
- Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
- Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
- Tyree, M.
- Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
- Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).
