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방법 논문

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

5.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

2019년 3월 27일

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

이 논문에서

요약

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

초록

인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 재생 의학 및 인간 발달 과정을 공부 하는 플랫폼에 대 한 유망한 셀 소스. 개발 프로세스를이 분화 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 를 포함 한 췌 장 세포를 생성 하는 주요 방법 중 하나입니다 감독 stepwise (PDX1+) 췌 장의 조상 세포. 기존의 프로토콜 통과 직후 작은 식민지와 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포 하는 경향이 수 PDX1 분화를 방해 수 있습니다 heterogeneities+ 세포. 여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포. 프로토콜의 4 단계 구성 하 고 시드 해리 단일 세포로 분화를 시작. SOX17의 유도+ 최종 endoderm 셀 두 개의 기본 창 자 튜브 마커, HNF1β 및 HNF4α, 및 최종 분화 식 PDX1에 선행 되었다+ 세포. 현재 프로토콜 쉬운 처리를 제공 합니다 개선 및 안정화 endodermal 계보 또는 PDX1 비효율적으로 차별화 하는 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 분화 효율 수 있습니다+ 세포.

서론

췌 장 외 분 비 및 내 분 비 세포, 주로 구성 하 고 그것의 역 기능 또는 오버 로드 하면 여러 가지 질병, 췌 장 염, 당뇨병, 췌장암 등. Pancreatopathy의 pathogeny, 명료 하 발달 과정 및 췌 장 세포의 기능을 분석할 필요가 있다. 또한, 강력한 품질 안정적인 셀 공급 세포/조직 보충 치료를 설정할 필요 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 이러한 목적에 대 한 유망한 셀 소스 그리고 췌 장 세포로 분화 프로토콜 집중적으로 공부1,2,3,되었습니다 4. 췌 장 β 세포의 생체 외에서 생성의 최근 발전 인간, 성인과 당뇨병 모델 마우스2,3에 이식 시 이러한 셀 표시 치료 효능에 β 세포의 생성을 모방. 또한, β 세포 건강의 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 및 타입-1 당뇨병 환자 기증자에서 생성 된 분석 스트레스5때 포함 하는 기능 차이가 나타났다. 또한, 질병 고기 환자 파생 Ipsc 또는 hPSCs 유전자 변이 환자6,7와 같은 사이트에 은닉 유도 된 췌 장 세포에 부분적으로 재현 되어 있다.

HPSCs에서 췌 장 세포를 생성, stepwise 감독된 차별화 개발 프로세스를이 사용 됩니다. 췌 지역 Y-상자 17 (SOX17)를 결정 하는 섹스를 표현 하 고 초기 배아의 endoderm 계층에서 파생 되 고 forkhead 상자 A2 (FOXA2)8. 마우스 연구를 바탕으로, endodermal 레이어 hepatocyte 핵 요인 1-베타 (Hnf1β)와 hepatocyte 핵 요인 4 알파 (Hnf4α)의 식에 의해 표시 된다 원시 창 자 관을 형성 한다. 기본 창 자 튜브 elongates 및 호흡 장치, 소화 관, 및 기관으로 개발 합니다. 신장, 후 후부 foregut 지역 된다 추정 췌 장 지역 1 (PDX1)8,,910transcriptional 인자 췌 장/십이지 homeobox 단백질의 식으로 표시. 등 쪽과 복 부 부분의 PDX1+ 직감 튜브 1 (NKX6.1)8,11췌 녹음 방송 요인 1 소 단위 알파 (PTF1A)와 NK6 homeobox의 공동 식에 의해 표시 된 양식 췌 장 새싹을 진하게. 이 식은 췌 장 organogenesis의 형태학 시작을 표시합니다. 췌 장 새싹의 구성 요소 췌 endoderm 세포 상피 구조12 의 분기 관 네트워크를 형성 하 고 결국 외 분 비 및 내 분 비 세포, 인슐린 분 비 β-세포 등으로 분화 하 고 글 루카 곤 분 비 α-셀입니다. 표현의 PDX1 전체 췌 장 개발을 통해 관찰 하 고 지역화 β와 δ 세포9,,1314를 보여줍니다 추정 췌 장 영역에서 먼저 검색 됩니다. 비록 있는 Pdx1+ Ptf1a 또는 Nkx6.1을 표현 하지 않는 셀 영역 위 동굴, 십이지 장, extrahepatic 담 즙 덕트 및 마우스9, PDX1 개발의 단계를 중간에 몇몇 장 세포로 분화+ 셀 인간의 초기 발달 단계에서 췌의 창시자 이라고 여겨진다.

여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포 췌 장의 계보의 세대에 대 한. 시드 여 프로토콜 초기화 차별화 단일 셀15,,1617해리 했다. 일반적으로, undifferentiated hPSCs 식민지 또는 셀 집계 정지 또는 접착으로 유지 됩니다. 그 결과, 대부분 프로토콜 뿌리고 직후 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포는 공간과 transcriptional heterogeneities18,19,20,,2122, 방해 수 있는 경향이 있는 첫 번째 차별화 단계로 최종 endoderm PDX1 비효율적인 차별화 뒤+ 세포. 현재 프로토콜 개선 및 차별화 효율성 안정화 쉽게 처리를 제공할 수 있습니다 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 endodermal 계보 및 PDX1 비효율적으로 차별화 하는+ 세포23, 24 , 25.

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프로토콜

HPSCs를 사용 하 여 실험 의학의 학과 대학원의 대학, 교토대학의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 자료의 준비

참고: 메 마른 환경에서 세포 배양에 대 한 모든 미디어와 시 약을 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도 (RT) 기본 문화 미디어 워밍업. 매체는 차별화는 6 h는 시 약의 실시간 정보에 내에서 사용 되는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

  1. 분화 (그림 1A)
    1. 단계 1A 매체: 전송 RPMI 1640 매체는 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 추가 혈 청 무료 보충, activin A, CHIR99021, 및 Y-27632 1 x 100 ng/mL, 3 μ M, 10 μ M의 농도를 각각.
    2. 단계 1B 매체: 전송 RPMI 1640 매체는 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 혈 청 무료 보충, activin A와 CHIR99021 1 x, 100 ng/mL, ≤1 μ M의 농도를 각각 추가 합니다.
      참고: CHIR99021의 농도 단계 1A 매체에 비해 낮은 해야 합니다. 추가, 필요 하지 않습니다 하지만 휴대폰 번호 증가.
    3. 2 단계 매체: 전송 향상 메모리 (iMEM)는 피 펫을 사용 하 여 튜브에 매체. 혈 청 무료 보충와 추가 keratinocyte 성장 인자 (KGF) 0.5 x 50 ng/mL의 농도를 각각.
    4. 3 단계 매체: 전송 iMEM 매체를 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 혈 청 무료 보충, KGF, 머리, 3-Keto-N-aminoethyl-N'추가-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) 및 피 펫에 의해 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 산 (TTNPB) 0.5의 농도 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μ M, 10 nM, 각각.
  2. Cytometry (FCM)
    1. Permeabilization/워시 버퍼 x 1: 전송 물 관으로는 피 펫. 1 x의 농도에 피 펫에 의해 Permeabilization/워시 버퍼를 추가 합니다.
    2. FCM 솔루션을 차단: 전송 Permeabilization/워시 버퍼 x 1 튜브로는 피 펫에 의해. 2% (vol/vol)의 농도에 피 펫에 의해 당나귀 혈 청을 추가 합니다.
  3. Immunostaining
    1. 솔루션을 차단: 전송 Dulbecco Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS)는 피 펫에 의해 관으로. 추가 당나귀 세럼과 트리톤 X 피 펫에 의해 농도 5% (vol/vol) 및 0.4% (vol/vol), 각각.

2. hPSC 뒤 Foregut 셀/췌 장 창시자를 차별화 (PDX1+ 세포)

참고: 무 균 기술을 사용 하 여 모든 절차를 수행 합니다. hPSCs에 따라 제조 업체의 지침17,26hPSC 유지 보수 매체와 hPSCs에 대 한 합성 표면 재료 코팅 6 잘 플레이트에 유지 됩니다. 세포에 도달 하는 때 50-80 %confluency (단계 0) 차별화에 대 한 그들을 사용 합니다.

  1. 지하실 막 매트릭스 코팅 접시를 준비 합니다.
    1. 전송 6 mL 튜브로 RPMI 1640 (4 °C)의 4 °C 얼음에 냉각. 지하실 멤브레인 매트릭스 (4 °C) 냉각 1 mL 피 펫 팁의 2 밀리 그램을 추가 하 고 부드러운 pipetting 0.33 mg/mL 지하실 멤브레인 행렬을 잘 혼합.
    2. 피 펫에 의해 6-잘 세포 배양 배지의 각 음을 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 2 개 mL를 전송. 37 °C는 인큐베이터에서 60-90 분에 접시를 놓습니다. 그 후, (3 h) 이내 사용까지 RT 판 유지.
  2. hPSCs 씨 고 최종 endoderm (단계 1A)을 차별화를 시작.
    1. 사용된 매체 발음 고 피 펫 세척 hPSCs 6-잘 접시에 배양 하 여 잘 당 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (RT)의 2 개 mL를 추가 합니다.
    2. Aspirate 0.5 m EDTA m 고 피 펫에 의해 잘 당 0.5 m m EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 °C 5 분 동안 접시를 품 어.
    3. 0.5 m EDTA를 발음 하 고 10 μ M으로 보충 하는 RT에 hPSC 유지 보수 매체의 1 mL을 추가 당 피 펫에 의해 잘 Y-27632. 부드럽게 플라스틱 하지만 빨리 버릴 이멀전의 셀 단일 세포로 분리 하는 접시에 셀을 연결. Pipetting 동안 세포 현 탁 액을 거품 하지 않습니다.
    4. 10 μ M으로 보충 하는 RT에 hPSC 유지 보수 매체의 4 mL를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 Y-27632. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션.
    5. Trypan 푸른 얼룩 제외 절차를 사용 하는 셀에에서 셀 번호를 계산 합니다.
      1. 세포 현 탁 액 및 튜브에서 Trypan 파랑의 15 μ의 믹스 15 μ.
      2. Trypan 블루 슬라이드 중복에서 계산 셀에 10 μ 피 펫에 의해 희석 셀 서 스 펜 션의 10 μ를 전송 합니다.
      3. 셀 번호는 자동 셀 카운터를 세 고 세포 현 탁 액에서 세포 밀도 계산. 생존은 일반적으로 > 98%.
    6. 약 수 1-1.5 x 106 셀 6 잘 플레이트 (1-1.5 x 105 셀/cm2)의 당에서 50 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액.
    7. 200 x g 에 RT 5 분에 50 mL 튜브 원심
    8. 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 잘 당 단계 1A 매체 (RT)의 1 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 세포 현 탁 액을 플라스틱을 단계 1A 매체 (잘 당 총, 2 mL)의 또 다른 1 mL를 추가 합니다.
    9. 세포 배양 배지 1000 μ 피 펫에 의해 단계 2.1.2에서에서 준비의 우물에 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스 발음 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
    10. 플라스틱 단계 2.2.8에서에서 세포 현 탁 액을 다시 부드럽게. 혼합, 직후 6 잘 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (2 mL)을 전송 합니다. 커버 빛에서 접시를 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 접시. 10-15 분에 대 한 실시간에 깨끗 한 벤치에 접시를 놓습니다.
      참고: 시드 후 접시를 이동 하지 마십시오.
    11. 부드럽게 37 °C, 5% CO2 배양 기 (습도 분위기)를 24 h에 대 한 문화에 접시를 놓습니다.
      참고: 시드 후 접시를 흔들 하지 마십시오.
  3. 결정적인 endoderm (단계 1B)으로 분화를 유도.
    1. 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 우물에 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
      참고: 단층에서 모든 죽은 세포를 제거 하려면 각 열망 앞 접시를 흔들어 부드럽게.
    2. 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 단계 1B 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 부드럽게 37 °C 배양 기 (습도 5% CO2분위기) 및 48 h에 대 한 문화에 접시를 놓습니다.
    3. 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
      참고: 각 열망 전에 부드러운 떨고는 단층에서 죽은 세포를 제거 합니다.
    4. 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 단계 1B 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 부드럽게 24 h에 대 한 문화와 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기) 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  4. 기본 창 관 (2 단계)으로 분화를 유도.
    1. 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다.
      참고: 각 열망 전에 부드러운 떨고는 단층에서 죽은 세포를 제거 합니다.
    2. 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 2 단계 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 4 일 동안 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기)과 문화에 접시를 놓습니다.
  5. PDX1으로 분화를 유도+ 세포 (3 단계).
    1. 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
    2. 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음 하 고 잘 당 3 단계 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 3 일 동안 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기)과 문화에 접시를 놓습니다.
  6. 췌 장 내 분 비 세포로 분화를 유도.
    1. 앞에서 설명한 프로토콜3,,1626NKX6.1+ 세포 유도 (단계 4, 8 일에 대 한) 내 분 비 세포 유도 (단계 5, 12 일에 대 한) 다음을 수행 합니다. 특성화 고 immunostaining 및 양적 실시간 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석에 의해 내 분 비 세포 분화를 확인.
      참고: 도요다 외16 와 기무라 외.26 실험 하는 자세한 절차를 참조 하십시오. QRT-PCR 분석에 사용 되는 뇌관 순서 표 1 을 참조 하십시오.

3. Cytometry (FCM)

  1. 사용된 매체 발음 고 피 펫에 의해 잘 0.5 m EDTA m의 2 개 mL를 추가 합니다. 포부와 0.5 m EDTA의 추가 한 번 반복 합니다.
    참고: 각 열망 전에 단층 세포에서 모든 죽은 세포를 제거 하는 부드럽게 접시를 흔들어.
  2. 해리는 셀 (약 3-6 × 106 잘 당) 0.25%의 2 개 mL를 추가를 잘 당 0.5 m m EDTA를 포함 하는 트립 신. 37 °C 5-10 분 동안 접시를 품 어.
  3. 신속 하 게를 단일 셀으로 이멀전의 세포 분열 하지만 부드럽게 플라스틱. Pipetting 동안 세포 현 탁 액을 거품 하지 않습니다.
  4. 기본 매체 (RPMI 1640 또는 iMEM, RT)의 8-10 mL을 추가 포함 하는 혈 청 무료 보충 및 10 μ M x 0.5 Y-27632 당 고 세포 현 탁 액을 혼합. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
  5. 300 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심
  6. 상쾌한 발음 하 고 0.5 m EDTA (RT)의 2 개 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션.
  7. 300 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심
  8. 상쾌한 발음 하 고 후드 아래 106 세포 당 고정 및 permeabilization 버퍼의 100 μ 셀 resuspend. 부드럽게 플라스틱 후드 아래 세포 현 탁 액. 30 분 동안 RT에서 튜브를 유지.
  9. 400 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심
  10. 후드 아래 상쾌한 발음 하 고 106 셀 당 500 μ FCM 차단 솔루션 셀 resuspend. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션. 30 분 동안 RT에서 튜브를 유지.
  11. 관 (약 1 × 105 셀)에 세포 현 탁 액의 50 μ를 전송 합니다. 원심에서 400 x g RT에 대 한 5 분 제거 튜브는 상쾌한 고 희석된 주 항 체의 100 μ 셀 resuspend ( 재료의 표참조) FCM에 솔루션 및 4 °C에서 품 어 > 16 h.
  12. 5 분은 상쾌한 제거 하 고 파 마/워시 버퍼 x 1의 180 μ 셀 resuspend RT에서 400 x g 에서 튜브를 원심.
  13. 원심에서 400 x g RT에 대 한 5 분 제거 튜브는 상쾌한 고 희석된 이차 항 체의 100 μ 셀 resuspend ( 재료의 표참조) FCM 솔루션을 차단에. 60 분에 대 한 실시간 또는 4 °C에 대 한 셀을 품 어 > 16 h 빛 으로부터 보호.
  14. 5 분은 상쾌한 제거 하 고 파 마/워시 버퍼 x 1의 180 μ 셀 resuspend RT에서 400 x g 에서 튜브를 원심.
  15. 원심 관 5 분 제거에 대 한 RT에서 400 x g 에 상쾌한 고 DPBS에 2% 나 귀 혈 청의 180 μ 셀 resuspend.
  16. 분석까지 빛에서 셀 스 트레이너 (35 µ m 나일론 메쉬)와 4 °C와 보호에서 계속 하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 전송 하 여 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
  17. 교류 cytometer27에 의해 긍정적으로 얼룩진된 셀의 비율을 분석 합니다.

4입니다. Immunostaining

  1. 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
    참고: 부드럽게 흔들어 각 열망 전에 단층 세포에서 모든 죽은 세포를 제거 하는 접시.
  2. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 (4 °C) 당 피 펫 후드 아래에 의해 잘. 4 °C 20 분 동안 접시를 유지.
  3. 피 펫 후드 아래는 PFA 제거 합니다. 피 펫 후드 아래 여 RT에서 잘 DPBS 2 mL을 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
  4. 잘 당 차단 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 RT에서 30 분 동안 접시를 유지.
  5. 사용 되는 솔루션을 발음 하 고 기본 항 체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 잘 당 솔루션을 차단에. 60 분에 대 한 실시간 또는 4 °C를 품 어 > 16 h.
  6. 사용 되는 솔루션을 발음, 0.4%를 포함 하는 DPBS의 2ml 추가 Triton X-100 10 분 반복 포부, 솔루션 화 한 번의 추가 대 한 RT에서 품 어와.
  7. 사용 되는 솔루션을 발음 하 고 이차 항 체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 잘 당 솔루션을 차단에. 빛 으로부터 보호를 가진 60 분 RT에서 품 어.
  8. 사용 되는 솔루션을 발음, 0.4%를 포함 하는 DPBS의 2ml 추가 Triton X-100 (RT)와 빛 으로부터 보호를 가진 5 분 RT에서 품 어. 포부, 솔루션 및 외피의 추가 두 번 반복 합니다.
  9. 형광 현미경28에서 분화 효율 검사 현미경을 가져가 라.

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결과

전파 hiPSCs (585A129,30) 집 광 하 고 차별화에 적합 (그림 1B) 동종 단층을 형성 한다. Undifferentiated hiPSCs (단계 0) 해리 그리고 다시 낮은 세포 밀도 (1-1.5 x 105 셀/cm2)에서 단일 셀으로 시드. 1 시간 이내 셀 접시에 연결 하 고 돌출 표시를 시작 합니다. 하루에 1, 셀 확산 하 고 잘 배포 표면적의 80-90%를 커버 하는. 단계 1B, 동안 미디어 때문에 죽은 세포 흐린 표시. 죽은 세포의 제거 때문에 죽은 세포 가능성이 방해 생존과 셀 아래 거짓말의 고효율 차별화에 대 한 중요 하다. 일 3-4에 셀 조약돌 모양으로 설명 될 수 있는 동종 단층 시트를 형성 한다. 이 시점에서, 대부분의 세포 표현 지역 Y-상자 2 (SOX2), 미 분화 세포에 대 한 마커를 결정...

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토론

PDX1 세대+ 세포의 여러 단계; 구성 따라서, 그것은 적절 한 시점에 세포를 치료 하는 중요 한입니다. 단계, 중 최종 endoderm의 유도 효율 크게 최종 유도 효율에 영향을, 가능성이 다른 오염 혈통 (즉, mesoderm, ectoderm)는 세포 증식 및 분 비 수 있습니다에서 간섭에 의해 그 요인 특정 차별화를 중단. 경우 SOX17의 비율+ 세포는 하루에 4 (단계 1B), 수 PDX1 효율적인 유도 80% 보다 낮은+ 세포 손상 될 가능성이 높습니다.

HPSCs의 미 분화 상태 식민지 또는 압축된 셀의 집계로 유지 됩니다. 그러나, 식민지 또는 집계에서 분화를 시작 하는 방법에서에서 고통을 수 있습니다이, 다른 세포 접착 및 식민지, 밀도 등 센터와 주변22에에 그리고 세포에서 다른 단계에 있기 때문에 세포 주기25. ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 일본 사회에서 대는 승진의 과학 (JSP) Scientific Research (C) (JSP KAKENHI 그랜트 Number15K09385와 18 K 08510)를 통해 고작, 및 특정에 대 한 자금 JSP 연구 휄 로우 (JSP KAKENHI 부여 번호에 의해 부분적으로 지원 17J07622)를 ko로 "ips 세포 연구, 재생 의료의 실현을 위한 연구 센터 네트워크 코어 센터" ak로, 그리고 의료 연구 및 개발 (아메드)의 연구를 통해 일본 기관에 부여 저자는 원고를 읽고 박사 피터 Karagiannis 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine토론토 연구 화학 물질K171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acidSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific339652
Anti-CDX2 항체 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, × 1/1000 희석
B-27 보충제 (50 ×)Thermo Fisher Scientific17504-044무혈청 보충제
BD FACSAria II 세포 분류기BD Biosciences유세포 분석
용 Biomedical freezerSANYOMDF-U538-30 ° C
TC10/TC20 세포 계수기용 세포 계수 슬라이드, 이중 챔버BIO-RAD1450011계수 슬라이드 유리
세포 배양 멀티웰 플레이트, 6웰, PS, 투명Greiner bio-one657165분화 배양/6웰 플레이트용
원심분리기TOMYAX-310세포 배양용
원심분리기TOMYMX-305RT-qPCR용
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRV클린 벤치
Corning CellBIND 6웰 플레이트Corning3335hPSC/6웰 플레이트의 피더 프리 배양용
Corning Matrigel 기저막 매트릭스 성장 인자 감소Corning354230기저막 매트릭스
Corning Synthemax II-SC 기판Corning3535hPSCs/합성 표면 재료의 피더 프리 배양용
저온 유지 장치Leica LeicaCM1510 S응집체의 면역 염색용.
Cytofix/Cytoperm KitBecton Dickinson554714Perm/Wash 버퍼는  투과성화/세척 버퍼. Cytofix/Cytoperm buffer는 fixation 및 perceabilization buffer입니다.
Dako penDakoS2002응집체
dNTP 믹스 (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088RT-qPCR
당나귀 항-염소 IgG (H+L) 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA110552차 항체, × 1/500 희석
당나귀 항-마우스 IgG (H+L) 고고도 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA100362차 항체, × 1/500 희석
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA100402차 항체, × 1/500 희석
Donkey SerumMerck MilliporeS30Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or MgNacalai tesque14249-95DPBS
필수 8 매체Thermo Fisher ScientificA1517001hPSCs/hPSC 유지 매체의 피더 없는 배양을 위한
매체 Falcon 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 스냅 캡Corning3522355 mL 원형 바닥 폴리스티렌 튜브와 셀 여과기
필터 팁, 1,000 µ LWatoson124-1000S피펫과 함께 사용
필터 팁, 20 &마이크로; LWatoson124-P20S피펫과 함께 사용
Filter Tip, 200 µ LWatoson124-P200S피펫과 함께 사용
광 현미경KeyenceBZ-X700
Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터Thermo Fisher Scientific370A인큐베이터
HNF-1β 항체 (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α 항체 (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570핵 염색용, × 1/200 희석
Human Pancreas Total RNAAmbionAM7954RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 항체R& D SystemsAF2419Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 희석
Human SOX17 항체R& D SystemsAF1924Anti-SOX17, × 1/200 희석
Improved MEM Zinc Option mediumThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
인큐베이션 챔버Cosmo Bio10DO응집체의 면역 염색용
라텍스 검사 장갑Adachi
MAS 코팅 슬라이드 유리Matsunami Glass83-1881용 응집체의 면역 염색
MicroAmp Fast 96-well Reaction PlateApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907RT-qPCR
현미경OlympusCKX41N-31PHP세포 배양용
MicrotubeWatoson131-515CS
Monoclonal Anti-α-FetoproteinSIGMAA8452Anti-AFP, × 1/200 희석
Nanodrop 8000Thermo Fisher ScientificRT-qPCR
Oligo dTFASMAC맞춤 제작 올리고 염기서열의 RT-qPCR에 대해 "TTTTTTTTTTTTTTTTTT"입니다.
파라 포름 알데히드, 분말Nacalai tesque26126-54PFA, 정착제, DPBS
제약 냉장고SANYOMPR-5144 ° C 수납
PIPETMAN P GILSON피펫
재조합 인간 KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
재조합 인간 NogginPeproTech120-10CNOGGIN
재조합 인간 / 마우스 / 쥐 Activin AR & D 시스템338-AC액티브빈 A
ReverTra 에이스(100 U/μ L)TOYOBOTRT-101RT-qPCR
RNase-free DNase Set (50)QIAGEN79254RT-qPCR
RNeasy 미니 키트QIAGEN74104RT-qPCR
RPMI 1640 L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
실시간용 밀봉 필름TakaraNJ500RT-qPCR
혈청학적 피펫 10 mLCostar/Corning4488세포 배양용
혈청학 피펫 25 mLCostar/Corning4489세포 배양용
청학적 피펫 5 mLCostar/Corning4487세포 배양용
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb세포 신호전달 3579SAnti-SOX2, × 1/200 희석
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher 과학적인RT-qPCR
SucroseNacalai tesque30406-25응집체의 면역 염색을 위한
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820BRT-qPCR
TC20 자동 세포 카운터BIO-RAD1450101J1자동 세포 카운터
Tissue-Tek OCT 화합물 4583 Sakura Finetechnical4583응집체의 면역 염색용
Tissue-Tek Cryomold 금형/어댑터Sakura Finetechnical4566응집체의 면역 염색용
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Ultracold freezerSANYOMDF-U33V-80 ° C 저장
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575-038
RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
의 면역 염색을 위해 형에 희석 용 혈 0.5 mM EDTA Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 준비하기 위해 DPBS로 희석

참고문헌

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