Name: 효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 hPSC에서 PDX1+ 췌장 전구세포를 생성하는 단일세포 부착 배양법. 균일한 세포 집단을 확보하여 재생의학 및 당뇨병 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 일본 사회에서 대는 승진의 과학 (JSP) Scientific Research (C) (JSP KAKENHI 그랜트 Number15K09385와 18 K 08510)를 통해 고작, 및 특정에 대 한 자금 JSP 연구 휄 로우 (JSP KAKENHI 부여 번호에 의해 부분적으로 지원 17J07622)를 ko로 "ips 세포 연구, 재생 의료의 실현을 위한 연구 센터 네트워크 코어 센터" ak로, 그리고 의료 연구 및 개발 (아메드)의 연구를 통해 일본 기관에 부여 저자는 원고를 읽고 박사 피터 Karagiannis 감사 합니다.

HPSCs를 사용 하 여 실험 의학의 학과 대학원의 대학, 교토대학의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 자료의 준비
참고: 메 마른 환경에서 세포 배양에 대 한 모든 미디어와 시 약을 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도 (RT) 기본 문화 미디어 워밍업. 매체는 차별화는 6 h는 시 약의 실시간 정보에 내에서 사용 되는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
<ol><li>
분화 (그림 1A)
	<ol>
<li>단계 1A 매체: 전송 RPMI 1640 매체는 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 추가 혈 청 무료 보충, activin A, CHIR99021, 및 Y-27632 1 x 100 ng/mL, 3 μ M, 10 μ M의 농도를 각각.</li>
		<li>단계 1B 매체: 전송 RPMI 1640 매체는 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 혈 청 무료 보충, activin A와 CHIR99021 1 x, 100 ng/mL, ≤1 μ M의 농도를 각각 추가 합니다. 참고: CHIR99021의 농도 단계 1A 매체에 비해 낮은 해야 합니다. 추가, 필요 하지 않습니다 하지만 휴대폰 번호 증가.</li>
		<li>2 단계 매체: 전송 향상 메모리 (iMEM)는 피 펫을 사용 하 여 튜브에 매체. 혈 청 무료 보충와 추가 keratinocyte 성장 인자 (KGF) 0.5 x 50 ng/mL의 농도를 각각.</li>
		<li>3 단계 매체: 전송 iMEM 매체를 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 혈 청 무료 보충, KGF, 머리, 3-Keto-N-aminoethyl-N'추가-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) 및 피 펫에 의해 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 산 (TTNPB) 0.5의 농도 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μ M, 10 nM, 각각.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry (FCM)
	<ol>
<li>Permeabilization/워시 버퍼 x 1: 전송 물 관으로는 피 펫. 1 x의 농도에 피 펫에 의해 Permeabilization/워시 버퍼를 추가 합니다.</li>
		<li>FCM 솔루션을 차단: 전송 Permeabilization/워시 버퍼 x 1 튜브로는 피 펫에 의해. 2% (vol/vol)의 농도에 피 펫에 의해 당나귀 혈 청을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>솔루션을 차단: 전송 Dulbecco Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS)는 피 펫에 의해 관으로. 추가 당나귀 세럼과 트리톤 X 피 펫에 의해 농도 5% (vol/vol) 및 0.4% (vol/vol), 각각.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC 뒤 Foregut 셀/췌 장 창시자를 차별화 (PDX1+ 세포)
참고: 무 균 기술을 사용 하 여 모든 절차를 수행 합니다. hPSCs에 따라 제조 업체의 지침17,26hPSC 유지 보수 매체와 hPSCs에 대 한 합성 표면 재료 코팅 6 잘 플레이트에 유지 됩니다. 세포에 도달 하는 때 50-80 %confluency (단계 0) 차별화에 대 한 그들을 사용 합니다.
<ol><li>
지하실 막 매트릭스 코팅 접시를 준비 합니다.
	<ol>
<li>전송 6 mL 튜브로 RPMI 1640 (4 °C)의 4 °C 얼음에 냉각. 지하실 멤브레인 매트릭스 (4 °C) 냉각 1 mL 피 펫 팁의 2 밀리 그램을 추가 하 고 부드러운 pipetting 0.33 mg/mL 지하실 멤브레인 행렬을 잘 혼합.</li>
		<li>피 펫에 의해 6-잘 세포 배양 배지의 각 음을 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 2 개 mL를 전송. 37 °C는 인큐베이터에서 60-90 분에 접시를 놓습니다. 그 후, (3 h) 이내 사용까지 RT 판 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
hPSCs 씨 고 최종 endoderm (단계 1A)을 차별화를 시작.
	<ol>
<li>사용된 매체 발음 고 피 펫 세척 hPSCs 6-잘 접시에 배양 하 여 잘 당 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (RT)의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Aspirate 0.5 m EDTA m 고 피 펫에 의해 잘 당 0.5 m m EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 °C 5 분 동안 접시를 품 어.</li>
		<li>0.5 m EDTA를 발음 하 고 10 μ M으로 보충 하는 RT에 hPSC 유지 보수 매체의 1 mL을 추가 당 피 펫에 의해 잘 Y-27632. 부드럽게 플라스틱 하지만 빨리 버릴 이멀전의 셀 단일 세포로 분리 하는 접시에 셀을 연결. Pipetting 동안 세포 현 탁 액을 거품 하지 않습니다.</li>
		<li>10 μ M으로 보충 하는 RT에 hPSC 유지 보수 매체의 4 mL를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 Y-27632. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션.</li>
		<li>Trypan 푸른 얼룩 제외 절차를 사용 하는 셀에에서 셀 번호를 계산 합니다.<ol>
<li>세포 현 탁 액 및 튜브에서 Trypan 파랑의 15 μ의 믹스 15 μ.</li>
			<li>Trypan 블루 슬라이드 중복에서 계산 셀에 10 μ 피 펫에 의해 희석 셀 서 스 펜 션의 10 μ를 전송 합니다.</li>
			<li>셀 번호는 자동 셀 카운터를 세 고 세포 현 탁 액에서 세포 밀도 계산. 생존은 일반적으로 > 98%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>약 수 1-1.5 x 106 셀 6 잘 플레이트 (1-1.5 x 105 셀/cm2)의 당에서 50 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액.</li>
		<li>200 x g 에 RT 5 분에 50 mL 튜브 원심</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 잘 당 단계 1A 매체 (RT)의 1 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 세포 현 탁 액을 플라스틱을 단계 1A 매체 (잘 당 총, 2 mL)의 또 다른 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>세포 배양 배지 1000 μ 피 펫에 의해 단계 2.1.2에서에서 준비의 우물에 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스 발음 즉시 다음 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>플라스틱 단계 2.2.8에서에서 세포 현 탁 액을 다시 부드럽게. 혼합, 직후 6 잘 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (2 mL)을 전송 합니다. 커버 빛에서 접시를 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 접시. 10-15 분에 대 한 실시간에 깨끗 한 벤치에 접시를 놓습니다. 참고: 시드 후 접시를 이동 하지 마십시오.</li>
		<li>부드럽게 37 °C, 5% CO2 배양 기 (습도 분위기)를 24 h에 대 한 문화에 접시를 놓습니다. 참고: 시드 후 접시를 흔들 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
결정적인 endoderm (단계 1B)으로 분화를 유도.
	<ol>
<li>사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 우물에 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다. 참고: 단층에서 모든 죽은 세포를 제거 하려면 각 열망 앞 접시를 흔들어 부드럽게.</li>
		<li>피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 단계 1B 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 부드럽게 37 °C 배양 기 (습도 5% CO2분위기) 및 48 h에 대 한 문화에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다. 참고: 각 열망 전에 부드러운 떨고는 단층에서 죽은 세포를 제거 합니다.</li>
		<li>피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 단계 1B 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 부드럽게 24 h에 대 한 문화와 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기) 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기본 창 관 (2 단계)으로 분화를 유도.
	<ol>
<li>사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 참고: 각 열망 전에 부드러운 떨고는 단층에서 죽은 세포를 제거 합니다.</li>
		<li>피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 2 단계 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 4 일 동안 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기)과 문화에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PDX1으로 분화를 유도+ 세포 (3 단계).
	<ol>
<li>사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.</li>
		<li>피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음 하 고 잘 당 3 단계 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 3 일 동안 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기)과 문화에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
췌 장 내 분 비 세포로 분화를 유도.
	<ol>
<li>앞에서 설명한 프로토콜3,,1626NKX6.1+ 세포 유도 (단계 4, 8 일에 대 한) 내 분 비 세포 유도 (단계 5, 12 일에 대 한) 다음을 수행 합니다. 특성화 고 immunostaining 및 양적 실시간 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석에 의해 내 분 비 세포 분화를 확인. 참고: 도요다 외16 와 기무라 외.26 실험 하는 자세한 절차를 참조 하십시오. QRT-PCR 분석에 사용 되는 뇌관 순서 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cytometry (FCM)
<ol><li>사용된 매체 발음 고 피 펫에 의해 잘 0.5 m EDTA m의 2 개 mL를 추가 합니다. 포부와 0.5 m EDTA의 추가 한 번 반복 합니다. 참고: 각 열망 전에 단층 세포에서 모든 죽은 세포를 제거 하는 부드럽게 접시를 흔들어.</li>
	<li>해리는 셀 (약 3-6 × 106 잘 당) 0.25%의 2 개 mL를 추가를 잘 당 0.5 m m EDTA를 포함 하는 트립 신. 37 °C 5-10 분 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>신속 하 게를 단일 셀으로 이멀전의 세포 분열 하지만 부드럽게 플라스틱. Pipetting 동안 세포 현 탁 액을 거품 하지 않습니다.</li>
	<li>기본 매체 (RPMI 1640 또는 iMEM, RT)의 8-10 mL을 추가 포함 하는 혈 청 무료 보충 및 10 μ M x 0.5 Y-27632 당 고 세포 현 탁 액을 혼합. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.</li>
	<li>300 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 0.5 m EDTA (RT)의 2 개 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션.</li>
	<li>300 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 후드 아래 106 세포 당 고정 및 permeabilization 버퍼의 100 μ 셀 resuspend. 부드럽게 플라스틱 후드 아래 세포 현 탁 액. 30 분 동안 RT에서 튜브를 유지.</li>
	<li>400 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심</li>
	<li>후드 아래 상쾌한 발음 하 고 106 셀 당 500 μ FCM 차단 솔루션 셀 resuspend. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션. 30 분 동안 RT에서 튜브를 유지.</li>
	<li>관 (약 1 × 105 셀)에 세포 현 탁 액의 50 μ를 전송 합니다. 원심에서 400 x g RT에 대 한 5 분 제거 튜브는 상쾌한 고 희석된 주 항 체의 100 μ 셀 resuspend ( 재료의 표참조) FCM에 솔루션 및 4 °C에서 품 어 > 16 h.</li>
	<li>5 분은 상쾌한 제거 하 고 파 마/워시 버퍼 x 1의 180 μ 셀 resuspend RT에서 400 x g 에서 튜브를 원심.</li>
	<li>원심에서 400 x g RT에 대 한 5 분 제거 튜브는 상쾌한 고 희석된 이차 항 체의 100 μ 셀 resuspend ( 재료의 표참조) FCM 솔루션을 차단에. 60 분에 대 한 실시간 또는 4 °C에 대 한 셀을 품 어 > 16 h 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>5 분은 상쾌한 제거 하 고 파 마/워시 버퍼 x 1의 180 μ 셀 resuspend RT에서 400 x g 에서 튜브를 원심.</li>
	<li>원심 관 5 분 제거에 대 한 RT에서 400 x g 에 상쾌한 고 DPBS에 2% 나 귀 혈 청의 180 μ 셀 resuspend.</li>
	<li>분석까지 빛에서 셀 스 트레이너 (35 µ m 나일론 메쉬)와 4 °C와 보호에서 계속 하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 전송 하 여 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.</li>
	<li>교류 cytometer27에 의해 긍정적으로 얼룩진된 셀의 비율을 분석 합니다.</li>
</ol>4입니다. Immunostaining
<ol><li>사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다. 참고: 부드럽게 흔들어 각 열망 전에 단층 세포에서 모든 죽은 세포를 제거 하는 접시.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 (4 °C) 당 피 펫 후드 아래에 의해 잘. 4 °C 20 분 동안 접시를 유지.</li>
	<li>피 펫 후드 아래는 PFA 제거 합니다. 피 펫 후드 아래 여 RT에서 잘 DPBS 2 mL을 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.</li>
	<li>잘 당 차단 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 RT에서 30 분 동안 접시를 유지.</li>
	<li>사용 되는 솔루션을 발음 하 고 기본 항 체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 잘 당 솔루션을 차단에. 60 분에 대 한 실시간 또는 4 °C를 품 어 > 16 h.</li>
	<li>사용 되는 솔루션을 발음, 0.4%를 포함 하는 DPBS의 2ml 추가 Triton X-100 10 분 반복 포부, 솔루션 화 한 번의 추가 대 한 RT에서 품 어와.</li>
	<li>사용 되는 솔루션을 발음 하 고 이차 항 체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 잘 당 솔루션을 차단에. 빛 으로부터 보호를 가진 60 분 RT에서 품 어.</li>
	<li>사용 되는 솔루션을 발음, 0.4%를 포함 하는 DPBS의 2ml 추가 Triton X-100 (RT)와 빛 으로부터 보호를 가진 5 분 RT에서 품 어. 포부, 솔루션 및 외피의 추가 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>형광 현미경28에서 분화 효율 검사 현미경을 가져가 라.</li>
</ol>

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<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

PDX1 세대+ 세포의 여러 단계; 구성 따라서, 그것은 적절 한 시점에 세포를 치료 하는 중요 한입니다. 단계, 중 최종 endoderm의 유도 효율 크게 최종 유도 효율에 영향을, 가능성이 다른 오염 혈통 (즉, mesoderm, ectoderm)는 세포 증식 및 분 비 수 있습니다에서 간섭에 의해 그 요인 특정 차별화를 중단. 경우 SOX17의 비율+ 세포는 하루에 4 (단계 1B), 수 PDX1 효율적인 유도 80% 보다 낮은+ 세포 손상 될 가능성이 높습니다.
HPSCs의 미 분화 상태 식민지 또는 압축된 셀의 집계로 유지 됩니다. 그러나, 식민지 또는 집계에서 분화를 시작 하는 방법에서에서 고통을 수 있습니다이, 다른 세포 접착 및 식민지, 밀도 등 센터와 주변22에에 그리고 세포에서 다른 단계에 있기 때문에 세포 주기25. ...

췌 장 외 분 비 및 내 분 비 세포, 주로 구성 하 고 그것의 역 기능 또는 오버 로드 하면 여러 가지 질병, 췌 장 염, 당뇨병, 췌장암 등. Pancreatopathy의 pathogeny, 명료 하 발달 과정 및 췌 장 세포의 기능을 분석할 필요가 있다. 또한, 강력한 품질 안정적인 셀 공급 세포/조직 보충 치료를 설정할 필요 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 이러한 목적에 대 한 유망한 셀 소스 그리고 췌 장 세포로 분화 프로토콜 집중적으로 공부1,2,3,되었습니다 4. 췌 장 β 세포의 생체 외에서 생성의 최근 발전 인간, 성인과 당뇨병 모델 마우스2,3에 이식 시 이러한 셀 표시 치료 효능에 β 세포의 생성을 모방. 또한, β 세포 건강의 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 및 타입-1 당뇨병 환자 기증자에서 생성 된 분석 스트레스5때 포함 하는 기능 차이가 나타났다. 또한, 질병 고기 환자 파생 Ipsc 또는 hPSCs 유전자 변이 환자6,7와 같은 사이트에 은닉 유도 된 췌 장 세포에 부분적으로 재현 되어 있다.
HPSCs에서 췌 장 세포를 생성, stepwise 감독된 차별화 개발 프로세스를이 사용 됩니다. 췌 지역 Y-상자 17 (SOX17)를 결정 하는 섹스를 표현 하 고 초기 배아의 endoderm 계층에서 파생 되 고 forkhead 상자 A2 (FOXA2)8. 마우스 연구를 바탕으로, endodermal 레이어 hepatocyte 핵 요인 1-베타 (Hnf1β)와 hepatocyte 핵 요인 4 알파 (Hnf4α)의 식에 의해 표시 된다 원시 창 자 관을 형성 한다. 기본 창 자 튜브 elongates 및 호흡 장치, 소화 관, 및 기관으로 개발 합니다. 신장, 후 후부 foregut 지역 된다 추정 췌 장 지역 1 (PDX1)8,,910transcriptional 인자 췌 장/십이지 homeobox 단백질의 식으로 표시. 등 쪽과 복 부 부분의 PDX1+ 직감 튜브 1 (NKX6.1)8,11췌 녹음 방송 요인 1 소 단위 알파 (PTF1A)와 NK6 homeobox의 공동 식에 의해 표시 된 양식 췌 장 새싹을 진하게. 이 식은 췌 장 organogenesis의 형태학 시작을 표시합니다. 췌 장 새싹의 구성 요소 췌 endoderm 세포 상피 구조12 의 분기 관 네트워크를 형성 하 고 결국 외 분 비 및 내 분 비 세포, 인슐린 분 비 β-세포 등으로 분화 하 고 글 루카 곤 분 비 α-셀입니다. 표현의 PDX1 전체 췌 장 개발을 통해 관찰 하 고 지역화 β와 δ 세포9,,1314를 보여줍니다 추정 췌 장 영역에서 먼저 검색 됩니다. 비록 있는 Pdx1+ Ptf1a 또는 Nkx6.1을 표현 하지 않는 셀 영역 위 동굴, 십이지 장, extrahepatic 담 즙 덕트 및 마우스9, PDX1 개발의 단계를 중간에 몇몇 장 세포로 분화+ 셀 인간의 초기 발달 단계에서 췌의 창시자 이라고 여겨진다.
여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포 췌 장의 계보의 세대에 대 한. 시드 여 프로토콜 초기화 차별화 단일 셀15,,1617해리 했다. 일반적으로, undifferentiated hPSCs 식민지 또는 셀 집계 정지 또는 접착으로 유지 됩니다. 그 결과, 대부분 프로토콜 뿌리고 직후 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포는 공간과 transcriptional heterogeneities18,19,20,,2122, 방해 수 있는 경향이 있는 첫 번째 차별화 단계로 최종 endoderm PDX1 비효율적인 차별화 뒤+ 세포. 현재 프로토콜 개선 및 차별화 효율성 안정화 쉽게 처리를 제공할 수 있습니다 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 endodermal 계보 및 PDX1 비효율적으로 차별화 하는+ 세포23, 24 , 25.

<table><tbody><tr><td>3-Keto-N-aminoethyl-N&prime;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td><td>토론토 연구 화학 물질</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CDX2 항체 [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>Anti-CDX2, &times; 1/1000 희석</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50 &times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>무혈청 보충제</td></tr><tr><td>BD FACSAria II 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>용 Biomedical freezer</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>-30 &deg; C</td></tr><tr><td>TC10/TC20 세포 계수기용 세포 계수 슬라이드, 이중 챔버</td><td>BIO-RAD</td><td>1450011</td><td>계수 슬라이드 유리</td></tr><tr><td>세포 배양 멀티웰 플레이트, 6웰, PS, 투명</td><td>Greiner bio-one</td><td>657165</td><td>분화 배양/6웰 플레이트용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>TOMY</td><td>AX-310</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>RT-qPCR용</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>CLEAN BENCH</td><td>SHOWA KAGAKU&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>클린 벤치</td></tr><tr><td>Corning CellBIND 6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>hPSC/6웰 플레이트의 피더 프리 배양용</td></tr><tr><td>Corning Matrigel 기저막 매트릭스 성장 인자 감소</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC 기판</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>hPSCs/합성 표면 재료의 피더 프리 배양용</td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica Leica</td><td>CM1510 S</td><td>응집체의 면역 염색용.</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>Perm/Wash 버퍼는&nbsp; 투과성화/세척 버퍼. Cytofix/Cytoperm buffer는 fixation 및 perceabilization buffer입니다.</td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>응집체</td></tr><tr><td>dNTP 믹스 (10 mM)</td>의 면역 염색을 위해<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>당나귀 항-염소 IgG (H+L) 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>2차 항체, &times; 1/500 희석</td></tr><tr><td>당나귀 항-마우스 IgG (H+L) 고고도 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>2차 항체, &times; 1/500 희석</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>2차 항체, &times; 1/500 희석</td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Donkey serum</td></tr><tr><td>D-PBS(-) without Ca or Mg</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>필수 8 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>hPSCs/hPSC 유지 매체의 피더 없는 배양을 위한</td></tr><tr><td>매체 Falcon 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 스냅 캡</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 튜브와 셀 여과기</td></tr><tr><td>필터 팁, 1,000 &micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>피펫과 함께 사용</td></tr><tr><td>필터 팁, 20 &마이크로; L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>피펫과 함께 사용</td></tr><tr><td>Filter Tip, 200 &micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>피펫과 함께 사용</td></tr> 형<tr><td>광 현미경</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td>인큐베이터</td></tr><tr><td>HNF-1&beta; 항체 (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha; 항체 (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>핵 염색용, &times; 1/200 희석</td></tr><tr><td>Human Pancreas Total RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Human PDX-1/IPF1 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, goat IgG, &times; 1/200 희석</td></tr><tr><td>Human SOX17 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Anti-SOX17, &times; 1/200 희석</td></tr><tr><td>Improved MEM Zinc Option medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>인큐베이션 챔버</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>응집체의 면역 염색용</td></tr><tr><td>라텍스 검사 장갑</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS 코팅 슬라이드 유리</td><td>Matsunami Glass</td><td>83-1881</td><td>용 응집체의 면역 염색</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>Microtube</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&alpha;-Fetoprotein</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>Anti-AFP, &times; 1/200 희석</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>맞춤 제작 올리고&nbsp;</td><td>염기서열의 RT-qPCR에 대해 "TTTTTTTTTTTTTTTTTT"입니다.</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드, 분말</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA, 정착제, DPBS</td></tr><tr><td>제약 냉장고</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td>에 희석 <td>4 &deg; C 수납</td></tr><tr><td>PIPETMAN P&nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td>피펫</td></tr><tr><td>재조합 인간 KGF/FGF-7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>재조합 인간 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>재조합 인간 / 마우스 / 쥐 Activin A</td><td>R & D 시스템</td><td>338-AC</td><td>액티브빈 A</td></tr><tr><td>ReverTra 에이스(100 U/&mu; L)</td><td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNase-free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td>용 <td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 L-Gln</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>실시간용 밀봉 필름</td><td>Takara</td><td>NJ500</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>세포 배양용</td></tr> 혈<tr><td>청학적 피펫 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>세포 신호</td><td>전달 3579S</td><td>Anti-SOX2, &times; 1/200 희석</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher 과학적인</td><td></td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td>응집체의 면역 염색을 위한</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 카운터</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>자동 세포 카운터</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 화합물 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>응집체의 면역 염색용</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold 금형/어댑터</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>응집체의 면역 염색용</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultracold freezer</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>-80 &deg; C 저장</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td> 0.5 mM EDTA Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>251-00514</td><td></td></tr> 준비하기 위해 DPBS로 희석</tbody></table>

효율적인 세대의 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 뒤 foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hpscs에서

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 재생 의학 및 인간 발달 과정을 공부 하는 플랫폼에 대 한 유망한 셀 소스. 개발 프로세스를이 분화 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 를 포함 한 췌 장 세포를 생성 하는 주요 방법 중 하나입니다 감독 stepwise (PDX1+) 췌 장의 조상 세포. 기존의 프로토콜 통과 직후 작은 식민지와 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포 하는 경향이 수 PDX1 분화를 방해 수 있습니다 heterogeneities+ 세포. 여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포. 프로토콜의 4 단계 구성 하 고 시드 해리 단일 세포로 분화를 시작. SOX17의 유도+ 최종 endoderm 셀 두 개의 기본 창 자 튜브 마커, HNF1β 및 HNF4α, 및 최종 분화 식 PDX1에 선행 되었다+ 세포. 현재 프로토콜 쉬운 처리를 제공 합니다 개선 및 안정화 endodermal 계보 또는 PDX1 비효율적으로 차별화 하는 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 분화 효율 수 있습니다+ 세포.

전파 hiPSCs (585A129,30) 집 광 하 고 차별화에 적합 (그림 1B) 동종 단층을 형성 한다. Undifferentiated hiPSCs (단계 0) 해리 그리고 다시 낮은 세포 밀도 (1-1.5 x 105 셀/cm2)에서 단일 셀으로 시드. 1 시간 이내 셀 접시에 연결 하 고 돌출 표시를 시작 합니다. 하루에 1, 셀 확산 하 고 잘 배포 표면적의 80-90%를 커버 하는. 단계 1B, 동안 미디어 때문에 죽은 세포 흐린 표시. 죽은 세포의 제거 때문에 죽은 세포 가능성이 방해 생존과 셀 아래 거짓말의 고효율 차별화에 대 한 중요 하다. 일 3-4에 셀 조약돌 모양으로 설명 될 수 있는 동종 단층 시트를 형성 한다. 이 시점에서, 대부분의 세포 표현 지역 Y-상자 2 (SOX2), 미 분화 세포에 대 한 마커를 결정...

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

이 기술의 주요 장점은 자극 전에 세포가 균등하게 분산된 다음 탠덤 세포 접착에서 균등하게 자극된다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생 인 기무라 아즈마(Azuma Kimura)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 RPMI 1640의 6 밀리리터를 얼음에서 섭씨 4도까지 냉각된 튜브로 옮긴다.냉각된 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스 2밀리그램을 추가합니다. 밀리리터당 0.33 밀리그램의 농도를 가진 지하 막 매트릭스로 만들기 위해 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞으세요. 다음으로, 파이펫을 사용하여 희석된 지하 멤브레인 매트릭스의 2밀리리터를 6웰 세포 배양 판의 각 웰로 옮킨다.60~90분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 이 후, 사용할 준비가 될 때까지 최대 3 시간 동안 실온에서 접시를 유지합니다. 첫째, 사용된 매체를 흡습하고 파이펫을 사용하여 각 웰에 0.5 밀리미터 EDTA의 2밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트에서 배양된 hPCS를 세척한다.그런 다음 우물에서 EDTA를 흡입하고 각각 의 2 밀리리터를 각각 의 0.5 밀리롤라 EDTA에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 이 후, 각 우물에서 EDTA를 흡인.실온에서 hPSC 유지 보수 매체 1밀리리터를 추가하여 각 웰에 10 개의 마이크로 몰러 Y27632로 보충하십시오. 파이펫은 부드럽고 빠르게 플레이트에 부착 된 세포를 날려 단일 세포로 응집 된 세포를 해리합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 셀 서스펜션을 전달하여 4밀리리터의 hPSC 유지 보수 매체를 함유하고 있으며, 10마이크로몰러 Y27632로 보충하고 파이펫팅으로 혼합한다.다음으로, 튜브에 15 마이크로리터의 셀 서스펜션을 15 마이크로리터와 혼합합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 희석된 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 셀 카운팅 슬라이드로 중복으로 전송합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산하고 셀 서스펜션의 세포 밀도를 계산합니다.셀 현탁액을 50 밀리리터 튜브에 할당하여 각 웰에 대해 1~100만 개의 세포밀도로 배분한다. 원심 분리는 200 배 G와 실온에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 그 후, 파이펫을 사용하여 수퍼내를 흡인하고 1A 단계 배지의 1밀리리터를 사용하여 세포를 다시 일시 중단한다.셀 서스펜션을 부드럽게 피펫한 다음 1A 단계 중간크기의 1밀리리터를 더 잘

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을...

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

배우세요 hPSC에서 PDX1+ 췌장 전구세포를 생성하는 단일세포 부착 배양법. 균일한 세포 집단을 확보하여 재생의학 및 당뇨병 연구에 활용할 수 있습니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1⁺ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

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