Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Здоровый мозг гипофизарной срезы для электрофизиологических исследований клеток гипофиза у костистых рыб

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

В статье описывается оптимизированный протокол для приготовления жизнеспособных ткани мозга гипофизарной ломтиками, используя костистых рыб оризии (Oryzias latipes), следуют электрофизиологических записи гипофиза клеток с использованием метода патча зажим с перфорированные патч конфигурации.

Abstract

Электрофизиологические исследования гипофиза клеток были проведены в многочисленных видов позвоночных, но очень немногие костистых рыб. Среди них явное большинство выполнены на диссоциированных первичной клетки. Чтобы улучшить наше понимание как костистых клеток гипофиза, ведут себя в более биологически соответствующие среде, этот протокол показано, как подготовить жизнеспособных мозга гипофизарной фрагментов с помощью мелких пресноводных рыб оризии (Oryzias latipes). Делая срезы мозга гипофиза, pH и осмотического давления всех решений были скорректированы для значения, найденные в жидкостях организма пресноводных рыб, живущих в 25-28 ° C. После подготовки срез протокол демонстрирует проводить электрофизиологических записей с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим. Патч зажим техника является мощным инструментом с беспрецедентной временное разрешение и чувствительность, позволяя исследования электрических свойств от нетронутыми все клетки до одного ионных каналов. Перфорированные патч является уникальным в том, что он держит внутриклеточной среды, нетронутыми предотвращая будучи разбавленным раствором электрода пипеткой патч регуляторных элементов в цитозоль. В противоположность этому при выполнении традиционных поклеточного записи, было отмечено, что оризии гипофиза клетки быстро теряют способность огонь потенциалы действия. Среди различных имеющихся методов перфорации этот протокол демонстрирует достижения перфорация пропатчен мембраны, используя фунгицидом амфотерицин B.

Introduction

Гипофиза является ключевым эндокринного органа в позвоночных расположен ниже гипоталамуса и кзади зрительных нервов. Она производит и выделяет гормоны, шесть-восемь из типов конкретных клеток. Гормоны гипофиза являются промежуточным между мозга и периферических органов и управлять широкий спектр основных физиологических процессов, включая рост, размножение и регуляции гомеостаза. Подобно нейронов, эндокринных клеток гипофиза электрически возбудимых с возможностью спонтанно огонь потенциалы действия 1. Роль этих действий потенциалов является зависимой ячейки. В нескольких типах клеток млекопитающих гипофиза потенциалы действия может поднять внутриклеточных Ca2 + достаточно для стабильного выпуска гормона 2. Кроме того гипофиза получает как стимулирующее, так и тормозящий информацию от головного мозга, которое затрагивает мембранного потенциала клеток 3,4,5,6. Как правило стимулирующее ввода увеличивает возбудимость и часто включает в себя выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов а также увеличилась, выпустив частоты 7. Понимание как ячейка использует канал ионного состава и приспосабливается к этим входных сигналов от мозга является ключом к пониманию синтез гормонов и выпуска.

Патч зажим техника была разработана в конце 70-х годов Сакман и Неер 8,9,10 и дальнейшего улучшения Хэмилл 11и позволяет детальные исследования электрофизиологических свойств клеток вплоть до одного ионных каналов. Кроме того этот метод может использоваться для изучения тока и напряжения. Сегодня патч зажима является золотым стандартом для измерения электрофизиологических свойств ячейки. Четыре основных конфигураций герметичное уплотнение патч зажим техники были развитые 11; клетки придает, изнутри наружу, снаружи out и поклеточного патч. Три первых конфигурации обычно используются для одной ионного канала расследований. Четвертое, после придает ячейки конфигурации отверстие в клеточной мембраны производится с использованием югу атмосферного давления. Эта конфигурация также позволяет исследования ионного канала состава клеточных 12. Однако одним ограничением этой методики является, что цитоплазматических молекулы разводят патч пипеткой решение 13 (рис. 1А), влияя таким образом на электрических и физиологические реакции исследованных клеток. Действительно некоторые из этих молекул может играть важную роль в трансдукции сигнала или в регуляции различных ионных каналов. Чтобы избежать этого, Линдау и Фернандес 14 разработал метод где поры формирование соединения добавляется к патч пипеткой. После конфигурации придает ячейки соединение будет включать в плазматической мембраны под патч и медленно перфорировать мембраны, создание электрического контакта с цитозоле (рис. 1Б). Можно использовать несколько различных противогрибковые препараты, такие как нистатин 15 и амфотерицин B 16, или поверхностно-активных веществ, как сапонины бета эсцин 17,18 . Эти соединения создают поры достаточно большой, чтобы позволить моновалентной катиона и Cl– диффузии между цитозоле и патч пипеткой при сохранении цитозольной уровни макромолекул и больше ионов как Ca2 + 15, 16.

Проблема использования перфорированной патч является потенциально высокой серии сопротивление. Последовательное сопротивление (Rs) или доступ сопротивление является комбинированных сопротивления над патч пипеткой по отношению к земле. Во время записи патч зажим, Rs будет параллельно с мембраной сопротивления (Rm). M R и Rs в параллельной работы как Делитель напряжения. С высокой Rs, напряжение упадет Rs давая ошибки в записи. При больших токах Записанная ошибка станет больше. Кроме того делителя напряжения является частота зависит от создания НЧ-фильтр, таким образом затрагивающих временное разрешение. По сути перфорированные патч может не всегда позволяют записи крупных и быстрых течений как напряжение закрытого Na+ токи (более подробные показания см ссылку 19). Кроме того Rs может варьироваться во время записи патч зажим, снова ведет к изменениям в текущей записи. Таким образом ложных срабатываний может возникнуть в ситуациях, когда Rs изменения во время применения препарата.

Электрофизиологии на кусочки ткани был впервые представлен Андерсен лаборатории по изучению электрофизиологических характеристик нейронов в мозге 20. Техника проложили путь для подробного исследования одной клетки, а также связи и ячейки схемы ячеек в среде более нетронутыми. Подобный метод для изготовления гипофиза ломтики был представлен в 1998 году Guérineau et al. 21. Однако, он не был до 2005 года, что подготовка мозга гипофизарной срез был успешно используется для исследования патч зажим в костистых 22. В этом исследовании авторы также сообщили об использовании перфорированных патч зажим записей. Однако на сегодняшний день, большинство электрофизиологических исследований гипофиза клетки были проведены в млекопитающих и только горстка других позвоночных, включая костистых рыб 1,2,22,23 . В teleosts почти все исследования были проведены на первичной диссоциированных клетки 24,25,26,27,28,29,30 .

В настоящем документе мы наметим оптимизированный протокол для приготовления здорового мозга гипофизарной фрагментов из рыбы оризии модели. Этот подход представляет собой ряд преимуществ, по сравнению с первичной диссоциированных клеточных культур. Во-первых клетки, записываются в среде относительно сохранились, по сравнению с отделить условий культуры клеток. Во-вторых ломтик препараты позволяют нам учиться косвенных путей, посредничестве ячеек связи 22, что невозможно в условиях культуре диссоциированных клеток. Кроме того мы показали, как проводить электрофизиологических записей на ломтики полученные тканей, с использованием метода перфорированные поклеточного патч зажим с амфотерицин в качестве агента порами формирования.

Оризии является небольшой пресноводных рыб, родом из Азии, главным образом найдены в Японии. Физиологии, эмбриологии и генетики оризии были широко изучены для более чем 100 лет 31, и это часто используемые исследовательской модели во многих лабораториях. Особое значение для этого документа является организация различных морфологических гипоталамус гипофиз комплекса в костистых рыб: в то время как в млекопитающих и птиц нейронов гипоталамуса освободить их нейро гормоны, регулирующие гипофиза эндокринные клетки в систему портала средний возвышение существует прямой нервной проекции нейронов гипоталамуса на эндокринные клетки гипофиза в 32костистых рыб. Таким образом тщательно проведенных нарезки гипофиза мозга имеет особое значение в рыбе, что позволяет нам исследовать электрофизиологических характеристик гипофиза клетки в хорошо сохранившейся сети гипофиза мозга и в частности как гипофиза клетки контролировать их возбудимости и тем самым Ca2 + гомеостаза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные обработка была выполнена согласно рекомендации по уходу и благополучия животных исследования в Норвежском университете наук о жизни и под надзором уполномоченного следователей.

1. Подготовка документов и решений

Примечание: Все решения должны быть стерильными. Пристальное внимание должно уделяться pH и осмотического давления (osmol/кг воды) всех решений, которые должны быть тщательно адаптированы к внеклеточных среды изученных видов. pH и осмотического давления должна быть скорректирована с точного электронного оборудования как pH метр и замерзания осмометре соответственно.

  1. Сделать 500 мл раствора внеклеточных без Ca2 + (Ca2 + бесплатно EC): 150 мм NaCl, 5 мм KCl, 1.3 мм2MgCl глюкозы 4 мм, 10 мм Hepes.
    1. Распустить 4.38 г NaCl, 186.37 мг KCl, 61.89 мг MgCl2, 360.32 мг глюкозы и 1,19 г HEPES в 450 мл сверхчистого (0,055 США / см при 25 ° C, сопротивление 18.2 МОМ) H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 7.75 с NaOH.
    3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к 290-300 мОсм с маннитол. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром.
  2. Сделать 500 мл раствора внеклеточных (EC): 150 мм NaCl, 1.3 мм MgCl2, 5 мм KCl, 2 мм2CaCl, глюкозы 4 мм, 10 мм Hepes.
    1. Растворите 4.38 г NaCl, 186.37 мг хлористого калия, 147.01 мг CaCl2, 61.89 мг MgCl2, 360.32 мг глюкозы и 1,19 г HEPES в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 7.75 с NaOH.
    3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к 290-300 мОсм с маннитол. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром.
  3. Сделать 500 мл раствора внеклеточных с 0.1% бычьего сывороточного альбумина (EC с BSA): 150 мм NaCl, 1.3 мм MgCl2, 5 мм KCl, 2 мм2CaCl, глюкозы 4 мм, 10 мм Hepes.
    1. Растворите 4.38 г NaCl, 186.37 мг хлористого калия, 147.01 мг CaCl2, 61.89 мг MgCl2, 360.32 мг глюкозы и 1,19 г HEPES в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 7.75 с NaOH.
    3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к 290-300 мОсм с маннитол. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром. Добавьте 50 мг BSA.
  4. Сделать 250 мл раствора внутриклеточных (IC): 110 мм Кох, 20 мм KCl, 10 мм Hepes, сахароза 20 мм.
    1. Растворите 1,54 g Кох, 327.75 мг хлористого калия, 595.75 мг HEPES и 1.712 г сахарозы в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
    2. Отрегулируйте pH 7.2 (N-Морфолино) этан сульфонольно кислотой (MES).
    3. Передача решения в объемный флакон 250 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 250 мл.
    4. Mix решение задолго до измерение осмотического давления. Приспособиться к мОсм (ниже, чем ЕС 10 мОсм) 280-290 с сахарозой. Фильтр стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения и 0,2 мкм фильтром.
  5. Сделать 100 мл раствора 2% низких плавления агарозы в Ca2 + и BSA бесплатно EC (2 g низких плавления агарозы в 100 мл Ca2 + бесплатно EC). Растворить с помощью микроволновой и место растопленным агарозы в водяной бане при 40 ° C. Дайте ему остыть, пока достигает 40 ° C перед использованием на ткани.
    Примечание: ЕС, Ca2 + бесплатные EC могут храниться при температуре 4 ° C на несколько недель, если стерильные и IC решений при-20 ° C, за несколько месяцев. Агарозы могут храниться на неделю на 4 ° C и может быть использовано 3 – 5 раз кратко микроволновой печи. Чрезмерного повторного приведет к испарения и переоборудование агарозы и концентрации соли и качества.
  6. Сделайте агар мост:
    1. Нагрейте 7,5 мм длиной боросиликатного стекла капилляров с внешним диаметром 2 мм (диаметр) и внутренний диаметр (и.д.) 1,16 мм, с помощью горелки Бунзена в фокальной точки около 1/3 от одного конца до тех пор, пока стекло начинает сгибаться. Извлеките стекло от пламени и позволяют стекла, чтобы согнуть с углом около 120 градусов (рисA).
    2. Растопите 2% агар в нормальных ЕС без глюкозы с помощью микроволновой, и хотя агарозы жидкой заливки, готовые стеклянный капилляр, используя капиллярности сил, поставив один из концов стекла в жидкость и ждать несколько минут. Хранить мостов до использования на 4 ° C в ЕС без глюкозы.
  7. Подготовьте боросиликатного стекла с накаливания патч пипетки с помощью подходящего пипеткой съемник. Обратитесь к руководству съемник пипетку для получения желаемого электрода сопротивления.
    Примечание: Конический пипеткой должно быть как можно более коротким. Короткие пипеткой конические достигается с помощью тягового шаги 4 – 6. Электрод сопротивление должно быть между 2 и 6 MΩ в зависимости от размера ячейки.
  8. Чтобы избежать движения ткани во время экспериментов патч зажим пальто поверхности записи камеры с 0,1% polyethylenimine (PEI) в буфере Борат.
    1. Подготовка 500 мл Борат буфера (25 мм):
      1. Растворяют 4.768 g Na2B4O710 H2O в 450 мл сверхчистого H2O в стеклянный стакан с помощью магнитной мешалкой.
      2. Отрегулируйте пэ-аш до 8,4 с HCl.
      3. Передача решения в объемный флакон 500 мл. Заполните объемный колбу с сверхчистого H2O до 500 мл и 0,2 мкм фильтром стерилизовать решения с помощью вакуумной системы водоснабжения.
    2. Подготовьте раствор 1% Пей (1 мл 50% PEI буфер Борат 49 мл 25 мм) и 0.1% разбавления PEI путем разбавления 10 мкл Стоковый раствор 1% в 100 мкл буфера Борат для конечного использования.
    3. Добавить 2 мл 0,1% пей на стекло ломтик держателя и пусть покрытие инкубировать в течение 1 минуты. Затем кратко Мойте стекло дважды с 5 мл сверхчистого H2O и пусть воздух сухой до использования.
  9. Подготовьте амфотерицин B решения.
    1. Сделать Стоковый раствор 60 мг/мл 3 мг порошка амфотерицин в 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), растворяют в 1 мл, защищенном от света. Вихрь на максимальной скорости, для 30 s и sonicate за 15 мин до однородности. Хранить аликвоты в 3-5 трубок при-20 ° C и использовать один Алиготе в день.
      Примечание: Если амфотерицин B Стоковый раствор не ясно и желтый цвет, но Млечный (еще желтый) после 15 – 20 мин sonication сделать новый Стоковый раствор.
    2. Сделать IC решение с амфотерицином B, дозирования 2 мл IC в стакан чистой стекла с более чем 10 мл. 8 мкл Стоковый раствор амфотерицин в пипеткой раствор и смешивать, закупорить. Оберните стакан с алюминиевой фольгой и место на льду до использования и продлевать его каждые 3 ч.

2. Вскрытие и нарезки с Vibratome

  1. Подготовка рассечение инструменты перед рассечения, включая один острый и один сильный щипцы с ножницами. Чистые инструменты (держатель ткани, кисть, щипцы) с этанолом и убедитесь, что они используются только для целей рассечение и никогда при контакте с фиксированной тканей. Держите их в отдельном окне, чтобы избежать загрязнения.
  2. Усыпить рыбы в холодной воде льда за 1 мин.
  3. Следовать за последующие шаги, чтобы быстро анализировать оризии мозга и гипофиза с острыми щипцами (использовать не более 3 минут).
    1. Удерживая рыбу с сильным щипцами тяжелой два зрительных нервов позади глаз с ножницами или острые щипцы.
    2. Откройте спинной части черепа от задней к передней стороне, ломая кости черепа шаг за шагом с сильным щипцами.
    3. Отделите череп на одной стороне с сильным щипцами.
    4. Тяжелые спинного мозга с ножницами или острые щипцы.
    5. Осторожно захватить спинного мозга с щипцами, флип мозг от задней к передней и поместите его в блюдо с ледяной Ca2 + бесплатные ЕС.
  4. Заполните формы металла3 1,5 – 2 см с жидким агарозы и поместите его на льду.
  5. Непосредственно перед агарозы твердеет (на примерно 25 – 30 ° C), аккуратно захватить спинного мозга с щипцами, сухой щипцы с куском тонкой бумаги и положить ткани в агарозы. Быстро перемешайте агарозы для разбавления следы EC оставили вокруг ткани и ориентироваться ткани и пусть плесень на льду на несколько секунд, пока не затвердеет агарозы.
    Примечание: Важно для этот шаг, чтобы быть быстрым. Агарозы твердеет быстро как формы металла охлаждают льдом.
  6. Трим квадратный блок агарозы, содержащих ткани с лезвием скальпеля и приклейте его на vibratome держатель образца с помощью хирургии (нетоксичная) клея.
  7. Заполните кювета vibratome получения (мозг гипофиза) держатель образца с ледяной Ca2 + бесплатные EC.
  8. Поместите держатель образца в vibratome и вырезать агарозы блок сделать парасагиттальных разделы 150 мкм, с использованием высокой частоты и низкой скорости для разрезания. Собирать отдельные разделы и поместите их в камеру записи патч зажим с 3 мл ледяной Ca2 + бесплатные EC.
  9. Поместите сетку арфы (рис. 2B) в разделе ткани.
    Примечание: Арфа будет вместе с покрытием стабилизации ткани и не допустить его перемещение во время записи патч зажим.
  10. После арфы на месте, измените Ca2 + бесплатные EC среднего нормальной EC с Ca2 + и BSA. Пусть остальные ткани за 10 мин.

3. перфорированные патч зажим и электрофизиологические записей

  1. Перед началом эксперимента, хлорид серебра проволочные электроды, следующие шаги: во-первых, используйте тонкой шкуркой (p180) для очистки электродов серебряной проволокой. Во-вторых промойте с 2 мл, этанол 70%. В-третьих окуните провода в 2 мл, 2 – 5% хлора на 10 мин. Наконец промыть с 2 мл, сверхчистый H2O.
  2. Место записи камеры с срез мозга гипофиза в микроскопа и найдите целевой области (гипофиза) с помощью 10 X цели и проверки ячейки, используя 40 X цель.
    Примечание: Если подготовка является успешным, очень немногие круглые клетки должны быть видны. Эти круглые клетки, обычно поврежденные клетки, которые отсоединение от ткани.
  3. Место электрода заземления через мост 2% агар в ЕС ванну.
  4. Найдите здоровых клеток, используя 40 X цель.
    Примечание: Здоровых клеток должны быть прочно прикрепляются к кусочек ткани и не округляется до и отсоединяется от фрагмента.
  5. Установите усилитель в напряжения зажим (VC; Режим точки 1 рис. 4A ). Откройте печать теста окно и нажмите ванны конфигурации (Рисунок 4B точки 1 и 2. Используйте импульс 5-mV для мониторинга пипеткой сопротивления (Рисунок 4B . пункт 3).
  6. Засыпки кончиком пипетки патч противогрибковые бесплатные решения IC перед добавлением раствора IC с амфотерицином B, с помощью шприца микро наполнитель (см. рис. 3).
  7. Добавьте немного положительное давление воздуха в пипетку патч, используя шприц 1 мл.
    Примечание: Это делает небольшой поток жидкости из пипетки патч, избежать загрязнения кончика.
  8. Однажды в бане, оценить сопротивление пипеткой патч и убедитесь, что частицы не прикреплены к кончиком пипетки (рис. 4 c).
    Примечание: Небольшой кусок ленты прикрепляется на монитор отображения формы записи видео поле зрения. Это делает позиционирования патч пипеткой по отношению к ячейке легче, когда цель не упором на ячейку.
  9. Руководство патч пипетку до ячейки с помощью микроманипуляторов.
    Примечание: Убедитесь, что пипетку чистой ищет мелких частиц, которые могут прикреплены к кончику дозатор. Внезапные изменения в сопротивление может также быть результатом частиц, застрял в наконечник пипетки.
  10. Скорректировать пипетки, когда несколько микрон выше ячейки так, чтобы наконечник пипетки будет касаться 1/3 от середины клетки, клетки, как показано на рисунке 5. При прикосновении к ячейке, выпустить давление и применять нежные всасывания сделать печать.
    Примечание: Время от пипетки патч входит баня для успешной печати должны храниться как можно более коротким. Не более 1-1,5 мин во избежание амфотерицин B, достигнув кончика пипетки и утечки в ванну.
  11. Немедленно переключитесь в окно патч в программное обеспечение патч зажим (рис. 4 D точка 1) и имеют потенциал проведения между-50 и -60 МВ (точка 2на рисунке 4 d ). Ноль вне быстро емкость составляют стеклянной пипетки (точка 3Рисунок 4 d ).
  12. Перейдите в окно ячейка в патч зажим программного обеспечения (Рисунок 4E точки 1 и 2) и начать мониторинг доступа сопротивления, РА, отображается в окне. Обнулить мембраны емкость в усилитель программного обеспечения (Рисунок 4E точка 3) после достаточного доступа.
    Примечание: Достаточного доступа может занять 10-30 мин (Рисунок 4E пункт 2). Хороший доступ для текущей записи зажим должен быть ниже 20 М.
  13. Перейти к текущей зажим, IC, в окне программного обеспечения усилитель (Рисунок 4F пункт 1). Отрегулируйте быстро емкостных токов в окне зажим усилителя программного обеспечения (Рисунок 4F точки 2 и 3) и то же значение, как и 3.12. Проверьте мембранный потенциал (Рисунок 4F пункт 1).
    Примечание: Важно отметить, что если мембранного потенциала мелких (типичный выше -35 mV) ячейка может быть поврежден. Отменить запись и найти новую ячейку.
  14. После нахождения здоровых клеток (прочно прикреплены к ткани с мембранного потенциала ниже -40 МВ), начать экспериментальный записи как подробно указано в производителя протокол 33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол свидетельствует протокол шаг за шагом о том, как добиться надежной электрофизиологических записей из гипофиза (gonadotrope) клеток, используя оризии трансгенные линии [тг (lhb- hrGfpII)], где целевые клетки (Lh производители гонадотропины) помечены Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП).

Первоначально электрофизиологические исследования проводились с использованием поклеточного конфигурации. Однако спонтанное потенциалы действия не наблюдалось ни в одном из исследуемых клеток. В подмножество ячеек может запускаться потенциалы действия, с помощью малых текущего инъекции (5-9 ПА) от отдыхая потенциал между-50 и -60 МВ (рис. 6). Эти потенциалы действия были быстро изношенном, и после примерно 4 – 6 мин вызвали потенциалы действия были больше не возможно. Особенно быстро изношенном наблюдается может быть объяснено небольшой размер. В общем гипофиза клетки меньше, чем 30нейронов. К примеру средняя емкость мембраны gonadotrope клетки колеблется между 4 и 10 пикофарад 3,30,35. Похож на эти выводы оризии gonadotrope клетки был средний мембраны емкость (среднее ± д) 3,4 ± 0,9 pF (n = 67).

Переход на перфорированной патч конфигурации, с помощью амфотерицин B, спонтанное потенциалы действия наблюдались в около 50% зарегистрированных клеток (Рисунок 7A, n = 63 клетки от 21 животных). Кроме того потенциалы действия может запускаться в 95% этих клеток с не наблюдаемый изношенном даже после длительной записи (до 1 ч). Для достижения надежного и высокое качество записи, важно, необходимо сначала заполнить наконечник с бесплатно противогрибковые решения IC. Если небольшое количество противогрибковые препараты побег наконечник пипетки прежде чем gigaseal, это может повредить целевую ячейку как также окружающие клетки.

Для того чтобы проверить если клетки в перфорированных патч конфигурации способны реагировать на их основные освобождения гормон, мы применили 1 мкм Gnrh1 слоеного выбрасывается на клетки-мишени. Эксперименты были проведены в текущей зажим позволяет нам отслеживать изменения напряжения. Эти эксперименты показали двухфазный ответ (рис. 7Б). Первая фаза-гиперполяризации где выхода Ca2 + от внутренних магазинов активировать Ca2 + активирован K+ каналы причинения гиперполяризацию. Первый этап сопровождается деполяризации и увеличение потенциала действий частоты от 1-2 Гц до примерно 3 Гц. В некоторых из записей на втором этапе был псевдо плато потенциалов где 2 или 3 небольшие пики были замечены перед реполяризации.

Figure 1
Рисунок 1 : Разница между поклеточного (A) и перфорированные патч (B) конфигурации патч зажим техники. В целом ячейки конфигурации (A) после gigaseal на месте, отверстие делается в мембране, применяя небольшое отрицательное давление в пипетку патч. В этой конфигурации важные внутриклеточные молекул, таких как сигнальных молекул могут быть ослаблены в раствор пипеткой патч, влияя таким образом на электрических и физиологических реакций клетки. Это явление еще более важное значение в небольших клетках, таких как клетки гипофиза. Напротив в перфорированных патч конфигурации (B), после gigaseal, электрического контакта между цитозоле и патч пипетки состоит из противогрибковые препараты или ПАВ. Противогрибковые или ПАВ загружается в пипетку патч до исправления и будут включены в плазматической мембраны под патч, тем самым медленно перфорацию мембраны, позволяя только малые молекулы как моновалентной ионов пройти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Фото Мост агар (A) и (B) арфы используется в протоколе. Шкала в мм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Заполнение патч пипетки. (A) противогрибковые бесплатно IC раствор (голубая жидкость) является заполнен ротой капиллярных сил вследствие накала внутри пипеткой. (B) после заполнения наконечник пипетки с противогрибковыми бесплатно IC, задняя часть пипетки заполняется раствором IC, содержащая амфотерицин B (желтая жидкость) с помощью иглы шприца (микро наполнитель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4A
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4B
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4C
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4D
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4E
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4F
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Программное обеспечение скриншоты. (A) показаны усилитель окна программного обеспечения. 1. Основные моменты (красный кружок) области режим, который позволяет переключаться между мембраной (VC), текущий зажим без каких-либо текущих инъекций (I = 0) и текущий зажим с возможностью для текущего инъекции (IC). 2 Основные моменты (красный кружок) области для корректировки быстро емкостной ток в мембраной, а также поклеточного емкостным текущей корректировки. (B) показывает программное обеспечение патч зажим с окном тест мембраны открытым. 1. Основные моменты (красный кружок) на кнопку Тест мембраны. 2. Основные моменты (красный кружок) различных импульсных конфигураций, баня, патч и клеток. 3. подчеркивает (красный кружок) пульс конфигурации амплитудой и частотой. (C-F) показывает комбинированных вдова патч зажим (слева) и усилитель (справа) программного обеспечения. (C) подчеркивает (красный кружок) сопротивление, когда пипеткой в ванне и надлежащего заземления с помощью агар мост (в режиме ванна). (D) 1. Основные моменты (красный кружок), переключение в режим патч, после gigaseal. 2. Основные характеристики (красный кружок) пульс конфигурации (10 mV пульс) и проведение потенциал с учетом -60 МВ. 3. подчеркивает (красный кружок) окна для исправления или обнуления быстро емкостных токов после гига печать. (E) 1. Основные моменты (красный кружок) клеток режим, используемый для контроля доступа сопротивления. 2 Основные моменты (красный кружок) Параметры ячейки, мембраны емкости (см), печать качества (Rm), доступ к сопротивления (РА), постоянная времени (Тау) и проведение тока (удерживать). 3. подчеркивает (красный кружок) кнопка для исправления мембраны емкостных токов. (F) 1. Основные моменты (красный кружок) режим IC для мониторинга мембранного потенциала. 2. Основные моменты (красный кружок) на кнопку, чтобы перейти к текущей корректировки зажим (I-образный зажим). 3. подчеркивает (красный кружок) на окно для исправления быстро емкостных токов.

Figure 5
Рисунок 5 : Микрофотография от записи на ячейке гипофиза, используя конфигурацию перфорированные патч патч зажим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Текущие записи зажим с GFP-меченых Lh производство мобильных следующие текущего инъекции, с использованием обычной конфигурации поклеточного. Клетки были сохранены между-50 и -60 МВ. Типичный потенциалы действия может запускаться в подмножество ячеек с помощью 5-10 Па текущего инъекции сразу же после обретения доступа к ячейке (черный след). После 1-3 мин амплитуды потенциал действия начали уменьшаться, типичный признак очистки (голубой трассировки). После 4-6 мин амплитуды потенциал действия почти полностью исчезли (пурпурный трассировки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Текущий зажим, запись с GFP-меченых Lh производства ячейки с помощью перфорированных патч конфигурации, после стимуляции с Gnrh1 гонадолиберин. (A) текущей записи зажим демонстрации спонтанное потенциалы действия от Lh производства gonadotrope клетки. (B) двухфазные ответ где Gnrh1 стимуляции для 10 s сначала индуцированной гиперполяризации клеточной мембраны следуют деполяризации и увеличилась, выпустив частоты (от 1-2 Гц 3 Гц) действий потенциалов в ячейке, которая ранее уволен Спонтанное потенциалы действия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Электрофизиологические записей с использованием метода патча зажим на срезах головного мозга гипофизарной требуют тщательной оптимизации. Хорошо оптимизированный протоколы для проведения расследований клеток специально в teleosts ограничены, с большинством публикаций с помощью протоколов, основанных на системах млекопитающих. В этой связи важно быть осознает тот факт, что несколько физиологических параметров как pH и осмотического давления не только видов зависимой, но также очень много зависит ли рассматриваемое организм живет на суше или в воде. Для рыб это также необходимо принимать во внимание, если они живут в условиях морской или пресной воды. К примеру парциальное давление CO2 намного ниже, в рыбе, по сравнению с уровнями, начиная от 1,7-3,4 мм рт.ст ЦУП2 рыб и млекопитающих 3640 – 46 мм рт.ст ЦУП2 млекопитающих. Исходя из этого, мы изменить рН до 7,75 37,,3839,40 во всех решениях, используемых в текущем протоколе. Мы также используем HEPES буфера, как было показано, обладают отличным буферизации мощностей в регионе рН 7,4-7,8 41. Для осмотического давления мы используем 290-300 мОсм, которая является то, что была измерена в внеклеточных среды оризии 42. Температуры, используемые в ходе электрофизиологического записи был выбран согласно окружающей среды рыбы. Действительно оризии живет в водах с в широком диапазоне температур (от 4 до 40 ° C), то время как в нашей лаборатории, которую они выращиваются в контролируемой среде, 26-28 ° c. Исходя из этого, мы выполнили наши записи при комнатной температуре (около 25 ° C), отличается от того, что используется для тканей млекопитающих (37 ° C) или для холодной воды видов рыб, таких как треска (12 ° C) 18.

Чтобы иметь возможность обновления клеток гипофиза, имеет решающее значение для создания здоровых тканей срезы. Крайне важно использовать чистые инструменты (держатель ткани, кисть, щипцы, и т.д.), которые являются только при соприкосновении с живой ткани (бесплатно фиксативов). Быстрый рассечение мозга и гипофиза и поддержания тканей при низкой температуре (4 ° C) во время рассечения и нарезки являются другие ключевые факторы, которые обеспечивают жизнеспособные секций. Особое внимание должно также уделяться температуры агарозы после встраивания ткани. Слишком тепло агарозы могут повредить ткани пока холодно агарозы не оставит вас время ориентироваться на ткани для надлежащего разрезания. Кроме того, нарезка должно быть сделано с решением ЕС без Ca2 + чтобы избежать поврежденных клеток после разрезания вступить в апоптоз. Баблинг не является необходимым, но кусочки ткани должны быть собраны сразу же после разрезания. Оставьте срез около 15 мин после разрезания позволить клетки немного отдохнуть до исправления.

Костистых рыб являются отличные модели расследовать электрофизиологических свойств клеток гипофиза. Действительно вопреки млекопитающих и птиц, рыбы не имеют средний возвышение, означает, что нейронов гипоталамуса, контролируя гипофиза непосредственно спроецировать их аксоны на их целевых ячеек 32. Таким образом, в кусочек гипофиза мозга, гипофиза клетки поддерживаются в среде более неповрежденными, по сравнению с первичной гипофиза клеточных культур где клетки являются отделить использование химических и механических обработок. Интересно, что с помощью кусочка мозга гипофизарной оризии, мы могли наблюдать, что потенциал действия, выпустив частоты в клетках Lh, после активации Gnrh1, возросло (рис. 5). Эти замечания являются, по согласованию с чем уже сообщалось в изучения культуры клеток гипофиза с нашей собственной лаборатории 29 , указывающее, что использование первичных гипофиза клеточных культур по-прежнему актуальны для характеристики свойства мембраны клеток гипофиза. Однако срезы мозга гипофизарной позволяют нам учиться также косвенные последствия различных соединений, а также взаимодействия между клетками, как он поддерживает структурные соединения, которые теряются в первичной гипофиза клеточных культур. Кроме того, подготовка ломтик быстрее подготовить по сравнению с культуре диссоциированных главной ячейки, и электрофизиологических записей может проводиться в следующих 30 мин после вскрытия. Это означает, что, вопреки культуры главной ячейки, циркадные ритмы могут решаться значимым образом с помощью свежеприготовленные ломтиками.

Из-за небольшого размера клеток гипофиза в рыбе (емкость мембраны вокруг 3-10 ПФ) и наши собственные наблюдения, показаны, что gonadotrope клетки теряют способность огонь потенциалы действия (рис. 3) и таким образом теряют способность реагировать на освобождение гормонов, при записи в целом ячейки конфигурации, мы решили использовать и представить перфорированные патч технику здесь. Действительно было показано, что поклеточного конфигурации может привести к распространению важных цитоплазматических молекул, изменяя таким образом электрофизиологических ячейки свойства 13. Использование вместо перфорированных патч конфигураций с амфотерицином B для перфорации клеточной мембраны в патч пипетку, делая только маленькие отверстия, позволяя только малые ионы проходят через 15,,1643, 44, мы могли бы избежать этого разрежения и запись электрической активности клеток в течение длительного времени.

Один важный момент в технике перфорированные патч является первым обратно заполните пипетку с IC решение без противогрибковые препараты во избежание выпускать противогрибковые препараты в среду и повредить все клетки секции при приближении с пипеткой патч. Действительно из-за положительное давление патч пипеткой при подходе к ткани, некоторые жидкость протекает через пипетку патч до патча. Этот поток помогает держать кончик чистой до тех пор, пока вы достигли целевой ячейки, но если противогрибковые выпускается в среде до патча, он может перфорировать все мембран всех клеток, резко меняется проницаемых характеристики мембран клеток и таким образом их электрические свойства.

Представлена процедура оптимизированы и успешно используется для изучения электрической активности клеток оризии gonadotrope. Кроме того протокол может использоваться для изучения всех типов (эндокринных) клеток в гипофиз оризии и других видов костистых рыб. Имейте в виду, только что осмотического давления и pH всех решений должна быть скорректирована до уровня жидкости организма видов в вопросе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Мы благодарим г-жа Тан G LourdesCarreon за ее помощь, поддержание объекте оризии и Энтони Пельтье для иллюстративных цифр. Эта работа финансировалась путем NMBU и исследовательский совет Норвегии, номера грантов 244461 (аквакультуры программы) и 248828 (Цифровая жизнь Норвегии программа).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

Нейробиологии выпуск 138 мозг гипофиза ткани ломтик электрофизиологии рыба патч зажим эндокринные клетки
Здоровый мозг гипофизарной срезы для электрофизиологических исследований клеток гипофиза у костистых рыб
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter