Summary
여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.
Abstract
RNA 중 합 효소 II 전사 글로벌 결함 transcriptomic 연구 분석 정상 RNA에 의해 간과 수 있습니다. 실제로, mRNA 합성의 글로벌 감소 정상 정상 수준 복원 mRNA 저하에서 동시 감소에 의해 보상을 보여줘 왔다. 따라서, mRNA 감퇴에서 독립적으로 mRNA 합성의 게놈 넓은 정량화 RNA 중 합 효소 II transcriptional 활동의 가장 직접적인 반영 이다. 여기, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)에서 초기 RNAs의 대사 라벨 비 perturbing를 사용 하는 방법을 다루겠습니다. 특히, 셀 thiouracil-uracil 아날로그, 4와 6 분에 대 한 교양 및 레이블이 새로 베낀된 RNAs는 정화 모든 개별 mRNA의 합성 레이트를 결정 하기 위해 계량. 또한, 사용 하 여 표시 된 Schizosaccharomyces pombe 셀 내부 표준 허용 다른 S. cerevisiae 에 mRNA 합성 비교 긴장. 이 프로토콜을 사용 하는 동적 운동 모델 데이터를 피팅, 대응 mRNA 감퇴 속도 확인할 수 있습니다.
Introduction
세포는 유전자 식 프로그램의 동적 변경 통해 내 인 성 및 외 인 신호에 응답. 최근 몇 년 동안, 게놈 넓은 방법론의 엄청난 개발 다른 조건 transcriptome 변화의 정확 하 고 포괄적인 설명 수 있습니다. 대부분 transcriptomic 연구, microarray 교 잡 또는 높은 처리량 시퀀싱 총 정상 RNA 분수에서 RNA 수준을 측정 하는 데 사용 됩니다. 특정 섭 동 아래 transcriptional 변경 가능한 결과, 특정 유전자 표현 변경 또는 업 또는 downregulated 되 고 유전자의 큰 스펙트럼의 넓은 범위를 표시할 수 있습니다. 유전자 발현은 미세 조정된 균형의 결과 이다-또는 정상-RNA polymerases에 의해 RNA 합성 및 RNA 수준에 영향을 미치는 다른 프로세스 사이. Rna 중 합 효소 II 전사, mRNA 처리와 세포질 수출, 번역, 저하 고 복잡 하 게 연결 됩니다 (개시, 신장, 그리고 종료), 그것의 세 가지 단계를 포함 하 여.
여러 최근 연구 mRNAs 합성 및 부패는 결합된 메커니즘을 설명 하 고 총 정상 RNA를 측정 하는 때 돌연변이 또는 자극 아래 transcriptional 효과 간과 될 수 보였다. 첫째, 항상 정상 수준의 mRNA의 분석을 통해 transcriptional 변화의 감지는 mRNAs 반감기에 따라 달라 집니다. 섭 동을 도입 되 면 긴 반감기를 가진 mRNAs의 정상 수준 것입니다 훨씬 덜 영향을 보다 짧은 반감기를 가진 mRNAs의. 따라서, 단기 성적에 찬성 하 여 RNA 합성에 변경의 검출 바이어스 강하게 동안 최소로 mRNA 종 분석 전사 율에서 동적인 변화를 공개를 실패할 수 있습니다. 둘째, 여러 개의 보고서, 모두 효 모와 포유류에서 전사에 글로벌 변화 수 있습니다 간과 mRNA의 정상 수준을 분석할 때 나타났습니다. 이것은 mRNA 합성 및 mRNA 버퍼링 결과 저하를 연결 하는 메커니즘으로 인해입니다. 이 mRNA 합성 저하, 새로 베 껴 진된 mRNA의 분석을 통해에서 상태로 계량 하 새로운 프로토콜의 개발을 자극. 최근 몇 년 동안, 여러 가지 대안 되었습니다 제시, 글로벌 실행 시퀀싱 (GRO-seq)1및 네이티브 신장 시퀀싱 (NET-seq)2,3를 포함 하 여. 여기, 우리는 포유류 세포4,,56 에서 처음 개발 하 고 다음 효 모7,,89,10에 적용 하는 프로토콜을 제시 11, thiolated nucleoside 또는 기본 아날로그로 RNA 기반 4-thiouridine (4sU) 또는 4-thiouracil (4tU), 각각.
이 메서드는 특별히 새로 베 껴 진된 RNA는 RNA의 세포에서 정화 펄스 장애 요소가 없으면 세포 항상성에서 4sU로 표시 됩니다. 따라서, 일단 셀 4sU에 노출은, 분자는 빠르게 uptaken, 4sU 3 인산 염에 phosphorylated 및 RNAs 변하게 되 고에 통합. 일단 수정 펄스-분류, 추출 총 세포질 RNA (RNA의 정상 수준에 해당), 수 이며, 그 후, 4sU 라는 RNA 분수 thiol 특히 biotin 사이 이황화 결합의 형성으로 이어지는 고 새로 베 껴 진된 RNA4,5. 그러나, 4sU는 인간의 equilibrative nucleoside 운송업 자 (hENT1), 신진 또는 분열 효 모에의 즉시 사용을 방지 같은 nucleoside 전송기를 표현 하는 세포에 의해 uptaken를 하실 수 있습니다. 하나는 S. pombe 또는 S. cerevisiae에서 hENT1을 표현할 수 있는, 하는 동안 쉽게 접근 달성 될 수 있다 효 모 세포 nucleoside 전송10, 의 식의 필요 없이 4tU 최대 걸릴 수 있습니다 이후 수정 된 기본 4tU를 사용 하 여 11 , 12 , 13. 4tU의 대사 효소 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT)의 활동을 필요로 하는 사실. 효 모만 아니라 포유류를 포함 한 여러 유기 체에서 UPRT uridine monophosphate uracil 재활용 pyrimidine 회수 경로 대 한 필수적입니다.
동시에 분석 하는 다른 견본 사이의 정규화 transcriptomic 연구에 중요 한 바이어스를 도입 수 있습니다. 실제로, 많은 일탈 요인 돌연변이 및 야생-타입 긴장의 transcriptome의 비교 분석을 영향을 미칠 수: 세포 세포의 용 해 효율 추출 및 RNA, 및 분산 microarray 분석에 대 한 스캐너 교정에서의 복구에 차이 다른 사람의 사이에서. 위에서 설명 했 듯이, RNA 중 합 효소 II 전사에 글로벌 효과 예상 되는 등 유사 특히 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 정확 하 게 다른 견본 사이의 mRNA 합성 레이트를 비교 하는 우아한 의미 내부 표준으로 먼 관련된 분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 를 사용 하 여 설계 되었다. 고정 된 수의 표시 S. pombe 셀 S. cerevisiae 샘플, 야생-타입 또는 돌연변이 세포, 세포 세포의 용 해 및 RNA 추출10이전에 추가 됩니다. 그 후, S. pombe 와 S. cerevisiae 에서 정상 상태와 새로 합성 RNAs 실시간 정량 또는 통해 microarray 칩 또는 높 처리량 연속10의 사용에 의해 정량은. 이러한 데이터를 결합 하 여 운동 모델링, mRNA 합성 및 싹 트는 효 모에는 감퇴의 절대 속도 측정할 수 있습니다.
이 원고 틀에서 새로 베 껴 진된 RNA 분석 신진에 RNA 중 합 효소 II 전사에서 coactivator 단지 사가 TFIID14,15, 효 모에 대 한 글로벌 역할을 허용 하는 방법을 살펴보겠습니다. 16. 중요 한 것은, 과거의 연구 S. cerevisiae 에서 정상 mRNA 레벨을 계량 및 제안 사가 사가 돌연변이 의해 강하게 영향을 하지만 상대적으로 TFIID를 저항 하는 효 모 유전자의 제한 된 집합에 주된 기능을 담당 변이17,,1819. 놀랍게도, 사가 효소 활동 전체 베낀된 게놈 RNA 중 합 효소 II 전사에이 공동 활성이 제에 대 한 광범위 한 역할을 제안에 따라 행동을 표시 했다. 가장 표현된 유전자에서 감소 RNA 중 합 효소 II 모집 사가 또는 이러한 coactivators 대부분 유전자에서 함께 일 하는 것을 건의 하는 TFIID의 비활성화에 관찰 되었다. 따라서, 새로 베 껴 진된 mRNA의 정량화 사가 TFIID RNA 중 합 효소 II14,,1516에 의해 거의 모든 유전자의 전사에 대 한 요구는 밝혔다. 보상 메커니즘의 구현 mRNA 저하에서 동시 글로벌 감소에 의해 버퍼링 되는 mRNA 합성의 글로벌 감소에 대처 하기 위해 셀에 대 한 방법으로 나온다. 사가 녹음 방송 요인 TFIIH21,22에 RNA 중 합 효소 II 전사, RNA Pol II subunits10등 글로벌 효과, 중재자 coactivator 복잡 한20, 일반 요인의 목록에 추가 , 그리고 간접적으로, mRNA 저하 기계9,,1023의 요소. 이러한 보상 이벤트 사가 돌연변이, 정상 mRNA 수준의 mRNA 합성14글로벌 하 고 심각한 감소에도 불구 하 고 겸손 하 고 제한 된 변화에 대 한 회계에서 보편적으로 관찰 되었다. 비슷한 분석 또한 히스톤 H2B ubiquitination의 완전 한 손실을 BRE1 삭제 스트레인에서 수행 했다. 흥미롭게도, 많은 온화한 그러나 일관 된 글로벌에 대 한 효력이 RNA 중 합 효소 II 전사는 감지 하 고 다양 한 mRNA에 변화를 계량 수 있습니다. 효에서 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 나타내는 Bre1의 부재에서 검출 될 수 있습니다. 합성 비율입니다.
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Protocol
1. 세포 배양 Rapamycin의 그리고 소모 사가 소 단위
- 각 S. cerevisiae 스트레인 및 복제에 대 한 야생-타입을 포함 하 여 또는 컨트롤 긴장 접종 YPD 매체 (2% 펩, 1% 효 모 추출 물, 및 2% 포도 당)의 5 mL에 신선한 접시에서 단일 식민지.
- 일정 한 동요 (150 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 S. cerevisiae 세포 성장.
- 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) OD600 YPD 매체의 약 0.1에서 100 mL의 문화를 희석 하 고 OD600 0.8 주위까지 성장 하자.
- 동시에 접종 예 매체의 50 mL에 신선한 접시에서 S. pombe 셀의 단일 식민지 (0.5% 효 모 추출 물; 250 mg/L 아데닌, 히스티딘, uracil, 신, 그리고 리; 3% 포도 당) 일정 한 동요 (150와 32 ° C에 하룻밤 세포 성장 rpm을)입니다.
- S. pombe 하룻밤 문화의 OD600 측정 예 매체의 약 0.1에 500 mL의 OD600 문화를 희석 하 고 OD600 는 약까지 성장 하자 0.8.
- 각 S. cerevisiae 앵커 멀리 스트레인 및 복제에 대 한 야생-타입을 포함 하 여 또는 컨트롤 긴장 접종 YPD 매체 (2% 펩, 1% 효 모 추출 물, 및 2% 포도 당)의 5 mL에 신선한 접시에서 단일 식민지.
- 일정 한 동요 (150 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 세포 성장.
- 다음날 아침, OD600, OD600 YPD 매체의 약 0.1에서 100 mL의 문화를 희석 측정과 OD600≈ 0.8까지 성장 하자.
- 1 mg/mL (1 µ g/mL의 농도 최종 rapamycin)의 재고 솔루션에서 문화에 rapamycin의 100 µ L을 추가 하 고 셀 조건부 핵 (에서 고갈 될 관심의 단백질에 필요한 시간에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에 품 어 보자 일반적으로, 30 분은 적절 한). 컨트롤에 대 한 비슷한 효 모 문화를 사용 하지만 rapamycin을 추가 하는 대신 해당 볼륨의 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 추가.
2. 4tU로 서는 스파이크 (계산) S. pombe 와 라벨
-
2 M 4-thiouracil의 새로운 솔루션을 준비 합니다. 일단 준비, 실내 온도에 그리고 멀리 빛 그것을 유지.
- 정확 하 게 그리고 각 S. cerevisiae 문화에 대 한 4-thiouracil의 64.1 mg 무게 dimethylformamide (DMF)의 250 µ L 또는 DMSO의 250 µ L에서 그것을 분해.
- 스파이크에 사용 수 S. pombe 문화 320.5 mg 4-thiouracil의 무게와 DMSO의 1250 µ L에 녹.
- 5mm의 최종 농도 대 한 S. cerevisiae 와 S. pombe 문화 4-thiouracil 솔루션을 추가 하 고 각각 그들을 30 ° C와 32 ° C에서 일정 한 동요와 함께 6 분 동안 품 어.
- 6 분 후 셀 계산에 대 한 각 문화의 작은 약 수를 제거 합니다. 자동 셀 카운터 또는 Neubauer 챔버를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리 (2500 x g)을 통해 세포를 수집
- 상쾌한, 세척 (2500 x g, 4 ° C, 5 분) 얼음 1 x PBS와 원심 분리기 다시 셀.
- S. cerevisiae 와 S. pombe 샘플의 각 셀의 총 수를 계산 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 5 mL에 셀 resuspend와 S. cerevisiae S. pombe 셀 3:1 비율로 섞어.
- Centrifuge 셀 (2500 x g, 4 ° C, 5 분), PBS를 제거, 플래시 동결 세포 액체 N2, 고 추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장할.
3. RNA 추출 및 DNase 치료
- 약 20-30 분 동안 얼음에 셀 동
- RNA 추출 효 모 RNA 추출 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 몇 가지 각 색으로 진행.
- 각 샘플 당 키트와 함께 제공 된 나사 모자 1.5 mL 튜브에 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아 구슬의 750 µ L를 붓는 다. 각 관 당 최대 109 세포에서 RNA 추출 될 수 있다 효율적으로 명심에서 하십시오. 따라서, 각 샘플에 필요한 관 수 준비. 예를 들어 100 mL (OD600≈ 0.8)의 S. cerevisiae 문화 2 x 109 3 x 109 셀, 2.7 x 10의 총을 렌더링할 수 있습니다 (후 3 분 S. pombe의 스파이크에 총에서 4 x 109 셀에9 셀). 이 경우에, 각 샘플/조건/돌연변이/복제 당 3-4 반응 튜브까지 필요한 것입니다.
- 각 1 x 109 셀 당 키트와 함께 제공 된 세포의 용 해 버퍼의 480 µ L, 10 %sds, 48 µ L 및 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1, v/v/v)의 480 µ L를 추가 합니다.
- 와 동 믹서를 사용 하 여 셀을 혼합 하 고 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아 구슬 포함 된 튜브에 그들을 전송.
- 와 동 믹서 어댑터에 튜브를 수용, 최대 속도로 소용돌이 돌아서 10 분 (한 방에 4 ° c) 효 모 세포를 lyse 이길. 또는, 자동 구슬 때리는 세포 세포의 용 해를 수행 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 16000 x g 에서 튜브 원심 고 신중 하 게 신선한 15 mL 송 골 매 관에 위 단계 (단계 RNA를 포함)를 수집 합니다. 일반적으로, 각 관 당 복구 볼륨 주위는 500-600 µ L.
- 부분적으로 순화 된 RNA를 포함 하는 15 mL 튜브 키트 및 혼합 철저 하 게 제공 하는 바인딩 버퍼를 추가 합니다. RNA 솔루션의 각 100 µ L 당 350 µ L 바인딩 버퍼의 추가 (즉, 수성 단계 솔루션 볼륨은 600 µ L, 바인딩 버퍼의 2.1 mL 때 추가 되어야 합니다).
- 이전 혼합물을 100% 에탄올을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. RNA 솔루션의 각 100 µ L 당 추가 100% 에탄올의 235 µ L (즉때 수성 단계 솔루션 볼륨은 600 µ L, 에탄올의 1.41 mL 추가).
- 최대 700 µ L 필터 카트리지를 단계 3.9에서에서 혼합물의 컬렉션 튜브에서 조립 키트와 함께 제공 하는 둘 다 적용 됩니다.
- 16000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기. 원심 분리 기간 필터를 통과 하는 전체 볼륨에 대 한 충분 하지 않은, 경우는 원심 분리를 반복 하 여 30 s.
- 흐름을 통해 삭제 하 고 동일한 컬렉션 튜브를 다시 사용. 필터 및 분리기 16000 x g 에서 다시 1 분 동안에 RNA 바인딩 버퍼 에탄올 솔루션의 또 다른 700 µ L를 추가 합니다.
- 통해 흐름 무시 하 고 RNA 솔루션 끝날 때까지 3.11, 3.12 단계를 반복 합니다.
- 2 필터 세척 세척 솔루션 1의 700 µ L x. 1 분 동안 16000 x g 에서 원심 통해 세척 솔루션을 수집 하 고 수집 튜브를 항상 유지.
- 2 필터 세척 세척 솔루션 2 500 µ L x. 1 분 동안 16000 x g 에서 원심 통해 세척 솔루션을 수집 하 고 수집 튜브를 항상 유지.
- 16000 x g 필터를 완전히 건조를 1 분 동안에 다시 한 번 튜브 원심
- 최종 수집 관 (RNA 적절 한 관)을 필터 카트리지를 전송 및 RNA DEPC 처리, RNase H2O (100 ° C에 미리 데워)의 50 µ L을 elute.
- 16000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기.
- 데워 DEPC 처리, RNase 무료 H2o. 확인 모든 볼륨 필터;를 통해 통과 했다 50 µ L와 다시 (동일한 관)에 RNA elute 긴 기간에 대 한 원심 하 분리기, 원심
- 하나의 단일 샘플에 대 한 여러 개의 튜브를 사용 하는 경우 하나의 튜브에서 그들을 풀.
- 계량 하 고 적절 한 장비를 사용 하 여 샘플의 순도 확인 합니다.
참고: 4tU만 새로 합성된 RNA 내에서 통합 됩니다, 하는 동안 DNA와 사소한 오염의 기회가입니다. 그 이유로, 그것은 항상 DNase와 샘플을 치료 하는 것이 좋습니다 난. 그에 대 한 제조업체의 권장 사항에 따라 RNA 추출 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 시 약을 사용 합니다.
4. thiol 특정 Biotinylation 새로 합성된 RNA의
- 2 mg/mL를 프로토콜의 섹션 3으로 얻은 RNA의 농도 조정 합니다. Aliquot 200 µ g 총 RNA의 60 ° C에서 10 분 동안가 열 하 고 즉시 2 분 동안 얼음에 그것을 진정.
-
RNA 약 수를 다음과 같은 순서로 아래에 언급 된 시 약 추가: 600 µ L DEPC 처리, RNase H2O, 100 µ L의 biotinylation 버퍼 (100 mM Tris HCl [pH 7.5] 및 10 mM EDTA, DEPC 처리, RNase 무료 H2O), 그리고 200 µ L의 biotin-HPDP 1 mg/mL biotin-HPDP DMF 나 DMSO의 주식에서.
- 경우에 따라 biotin HPDP 솔루션 침전 하는, 가능성이 물에 그것의 낮은 용 해도 인해 경향이 있다. 이 상황에서 반응 볼륨의 40%까지 DMSO/DMF의 볼륨 증가 (RNA 샘플 추가 DEPC 처리 H2O, biotinylation 버퍼의 100 µ L 및 biotin-HPDP의 400 µ L의 400 µ L에서 0.5 mg/mL 재고).
- 실 온에서 샘플을 품 어와 부드러운 동요와 함께 3 h에 대 한 빛에서 보호.
- 부 화, 후 관에 클로 프롬의 대략 동일한 볼륨을 추가 하 고 적극적으로 혼합.
- 4 ° c.에서 5 분 13000 x g 에서 샘플을 회전 이 단계는 biotinylate RNA 하지 않았다 과잉 biotin의 제거 수 있습니다. 또는, (무거운) 위상 동기 튜브를 사용 하 여이 단계를 수행 합니다. 그, 13000 x g에서 1 분에 대 한 위상 동기 튜브 아래로 회전, RNA 혼합물과 같은 양의 클로 프롬, 그들을 적극적으로, 혼합 및 4 ° c.에서 5 분 13000 x g 에서 원심 추가
- 신중 하 게 새로운 2 mL 튜브에 위 단계를 전송 합니다.
- 5 M NaCl의 볼륨의 1/10을 추가 하 고 샘플을 혼합.
- 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨을 추가 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 적어도 30 분, 4 ° c.에 13000 x g 에서 회전
- 신중 하 게 제거는 상쾌한 고 차가운 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.
- 4 ° c.에서 10 분 13000 x g 에서 회전
- 신중 하 게 상쾌한, 빠른 회전, 튜브를 제거 하 고 나머지 에탄올 솔루션을 제거. RNA 펠 릿 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
- DEPC 처리, RNase H2o.의 100 µ L에서 RNA를 일시 중단
5. 정화 Streptavidin 입히는 자석 비즈를 사용 하 여 총 및 레이블이 RNA에서 새로 합성된 분수의
- 65 ° C에서 10 분 동안 biotinylated RNA를 열 고 5 분 동안 얼음에 샘플을 진정 합니다.
- (200 µ L의 최종 볼륨)에서 biotinylated RNA streptavidin 입히는 자석 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. 특히, 더 일관 되 고 신뢰할 수 있는 것이 듯된 다른 연구소와 대화 후, 재료의 테이블에에서 표시 하는 비즈를 사용 하는 것이 좋습니다.
- 실 온에서 90 분에 대 한 약간의 동요와 함께 샘플을 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 열을 배치 합니다.
- 실 온 세척 버퍼의 900 µ L 추가 (100 mM Tris HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1 %DEPC 처리에 트윈 20, RNase 무료 H2O) 열 (미리 실행 하 고 equilibrate).
- 구슬/RNA 혼합물 (200 µ L) 열에 적용 됩니다.
- 1.5 mL 튜브에서 흐름 통해 수집을 다시 동일한 자석 열에 적용 됩니다. 필요한 경우 레이블 없는 RNA 분수 나타냅니다 통해이 흐름 유지.
- 5 열 세척 세척 버퍼의 볼륨을 증가 함께 x (600, 700, 800, 900, 및 1000 µ L).
- 0.1 M DTT의 200 µ L로 새로 합성된 RNA elute
- 0.1 M DTT의 동일한 볼륨을 두 번째 차입, 3 분 후, 수행 합니다.
- RNA를 eluting 후 3 M NaOAc (pH 5.2), 얼음 100% 에탄올의 3 볼륨 및 20 mg/mL glycogen (RNA-학년)의 2 µ L의 0.1 볼륨을 추가 하 고 RNA 촉진 하룻밤,-20 ° c.에 게
- 원심 (13000 x g 4 ° C에서 10 분) 하 여 RNA를 복구 하 고 DEPC 처리, RNase H20 15 µ L에서 resuspend. 표시 된 총 RNA의 비율이 약 2%-4% (보통 더 낮은 끝으로), 새로 합성된 RNA의 약 2.0 µ g 렌더링 될 예정 이다. 이 뿐만 아니라 microarray/시퀀싱 분석에 대 한 몇 가지 정량 실험을 할 정도입니다.
6. 실시간 정량 다른 분수의 유효성 검사
- 제조업체의 지침 (자료 테이블)에 따라 총 RNA의 2 µ g 또는 임의의 hexamers와 선택, 역전사를 사용 하 여 레이블이 지정 된 RNA의 10 µ L에서 cDNA를 음성 합성.
- 실시간 정량 Pcr 표준 프로토콜 (테이블의 재료)를 사용 하 여 여는 cDNA를 증폭.
참고: 모든 샘플 실행 되어야 합니다 3 중에서 최소 두 개의 생물 복제에서. S. pombe tubulin의 표현에 대 한 모든 원시 값을 수정 합니다.
7. Microarray 교 잡
- 제조업체의 지침에 따라 선호 microarray 칩에 RNA 샘플을 교배 (이 특정 프로토콜에 대 한 재료의 표를참조 하십시오). 간단히, 준비 biotinylated 150에서 cRNA 대상 제조업체의 지침에 따라 최고의 RNA 증폭 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 RNA의 ng. 16 h 45 ° C와 60 rpm microarray 칩에 대 한 조각난된 cRNAs의 4 mg 교배
- 세척 하 고 얼룩, 표시 된 역 및 스캐너 (테이블의 재료)를 사용 하 여 칩을 스캔. 명령 콘솔 (AGCC, 버전 4.1.2)를 사용 하 여 스캔 한 이미지에서 원시 데이터 (CEL 강도 파일)를 추출 합니다.
- 더 식 콘솔 소프트웨어 버전 1.4.1 프로브 설정 기본 설정 및 정규화 방법으로 확장 하는 글로벌 매스 5.0 통계 기반 알고리즘을 사용 하 여 신호 강도 계산 하는 CEL 파일 처리 합니다.
참고: 각 칩의 트림된 의미 대상 강도 임의로 100으로 설정 됩니다. 적어도 2 개의 독립적인 생물 복제를 사용 하 여 모든 실험을 수행 합니다. S. pombe 신호를 원시 데이터를 표준화 하 고 총과 새로 합성 RNA 수준에서 배 변화 계산.
8. 데이터 분석 기존 R 파이프라인을 사용 하 여
- 합성을 계산 하 고 부패 속도 파이프라인 및 공개, R/Bioconductor 패키지를 사용 하 여 앞에서 설명한8,10.
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Representative Results
여러 측면을 통제 될 필요가 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 수행할 때: 시간과 효율 라벨, 스파이크에 비례하여, 추출 프로토콜 및 biotinylation 효능 (포함 한 신호 대 잡음 비율) 중에서 다른 사람. 이러한 조건이 광범위 하 고 조직적으로 표시 되었습니다 다른 사람에 의해7,,1011. 여기 우리는 주로 해석 일단 샘플 처리, 실시간 정량, microarray, 또는 연속 하 여 수행할 수 있는 즉각적인 분석에 초점. 다른 돌연변이 체 긴장의 분석 사가 돌연변이 S. cerevisiae 의 경우 mRNA 합성 뿐만 아니라 극적인 글로벌 감소를 감지 하는 방법의 힘을 보여 긴장, 아니라 RNA 중 합 효소 II 활동 시의 매우 가벼운 감소 히스톤 H2B monoubiquitination 억제
사가 효소 활동의 우리의 분석 제안 광범위 한 채용 chromatin15, 하지의 사가 돌연변이 체 긴장 정상 mRNA 수준 분석에 의해 밝혀졌다. RNA 중 합 효소 II 모집 사가 비활성화 시 장애인으로, 우리는 mRNA 합성 레이트에 세계적으로 영향을 받을 것 이다 여부를 분석 하기로 했다. 따라서, 야생-타입 또는 돌연변이 S. cerevisiae 긴장 새로 베낀된 RNAs를 6 분 동안 4tU에 노출 됐다. 스파이크에 레이블이 지정 된 셀으로 (S. pombe) 3: 1의 비율로 혼합, 후 총 RNA 추출 되었다, 그리고 새로 합성된 RNA biotinylated 그리고 여기, 그림 1에 표시 된 chronogram에서 제공 하는 프로토콜에 따라 정화. 레이블이 지정 된 RNAs는 순화 된 제품의 금액 모든 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 충분 한 될 것 이라고 보장 하는 RNA의 200 µ g의 총에서 정화 했다. 초기이 고 체계적인 단계 게놈 넓은 분석 하기 전에, 새로 합성된 RNA 정화 실시간 정량 Pcr에 의해 확인 되었다. 유전자 표현, 규제 경로, 그리고 다른 RNA polymerases에 대 한 의존의 수준을 포함 하는 다른 매개 변수에 따라 선정 됐다.
확인 하려면이 프로토콜 특히 레이블이 RNA 정화, 우리 분수 또는 4tU 없이 경작 했다 야생-타입 셀에서 정화에 성적 수준을 측정할. 분석 된 RNAs의 무시할 수 배경 수준 4tU에 노출 되지 셀에서 발견 된 (그림 2A). 새로 베 껴 진된 RNA 정화 더는 intron 포함 ACT1 사전-mRNA (데이터 표시 되지 않음)의 관찰 된 풍부에 의해 검증 되었다. 샘플의 품질의 유효성 검사 후 mRNA 합성 SPT20, 사가 복잡 한 어셈블리를 방해 하는 알려져 있는의 삭제에 따라 영향을 받을 것입니다 여부를 테스트 했습니다. 다른 사람에 의해 보고, mRNA 정량화 spt20Δ 스트레인에서 총 (정상 상태) RNA에 수행 공개 테스트 유전자 (그림 2B)에 대 한 대부분 그대로 또는 약간 감소 레벨. 유사한 결과 긴장 BRE1 (그림 2B)에 대 한 삭제에 대 한 획득 했다. 대조적으로, spt20Δ 스트레인에서 새로 베 껴 진된 RNA의 분석 3 mRNA 합성의 극적인 감소를 공개-모든 게 오부 테스트 유전자 (그림 2C). Bre1의 손실을 공부 유전자 (그림 2C)에 대 한 새로 합성된 mRNA 수준에서 더 신중 하지만 여전히 볼 수 감소에 지도 했다. 좋은 계약에서 역할 사가 Bre1의 RNA 중 합 효소 II 전사에, Spt20 또는 Bre1의 손실 미치지 않았다 식 RDN25 또는 snR6 유전자의 복사할 RNA 중 합 효소에 의해 어 RNA 중 합 효소 3 세, 각각 ( 그림 2C).
그러나, 긴장, SPT7 또는 SPT20복잡 한 사가의 구조상 소 단위에 대 한 삭제 표시 관찰된 transcriptional 변경에 대 한 계정을 수 있습니다 심각한 느린 성장 고기. 배제 원치 않는 보조 효과, 우리는 조건에 따라 핵에서 Spt7 소모,14,24변종 앵커 멀리 S. cerevisiae를 사용 하 여. 4tU와 펄스 라벨 이전 rapamycin 치료의 60 분에 따라 (그림 1 을 참조 하십시오 도식 표현), 새로 베 껴 진된 mRNA 수준 삭제 스트레인 (그림 2D 및 2E에서 관찰 된 것과 비슷한 정도로 감소 되었다 ). 이 분석, 따라서, 우리의 전 결과 확인 하 고이 유도할 수 있는 소모 시스템에 대 한 프로토콜을 확인. 어디 셀 한 시간에 걸친 0에서 240 분에 대 한 rapamycin에 노출 됐다, 시간-과정 분석에서 감소 식 약물에 노출의 15 분 후 즉시 입증 했다. 더 흥미롭게도, 정상 mRNA 수준 처음 감소 하는 경향이 있지만 60 분, 그 보상 메커니즘 이루어지는 반면에 (그림 2E) 표시 후 정상 수준으로 돌아.
전부, 라벨 및 새로 합성된 RNA의 정량화 사가 복잡 한에 대 한 새로운 규제 역할을 공개를 허용. 설명된 프로토콜 또한 RNA 중 합 효소 II 활동에 적당 한 효과 계시 할 수 있었다 고 했다 조건부에 성공적으로 적용 된 고갈 효 모 종자.
순화 새로 합성된 RNA에 대 한 다운스트림 응용 프로그램 중 하나는 성적 microarray 교 잡 또는 시퀀싱 (4tU-seq) 게놈 넓은 정량화. 높은 처리량 시퀀싱은 더 양적, 민감한 정보, microarray 교 잡 글로벌 mRNA 수준의 변경 여부를 확인 하려면 매우 유용할 수 있습니다. 이 상황에서는 정규화 중추적인, 우리 샘플을 분석 하는 목적으로 우리가 생물 스파이크에 추가. 특히, 우리는 S. cerevisiae 세포 S. pombe 셀 두 이전에 노출 되 고 4tU 3: 1의 비율에 혼합. 정화, 레이블이 지정 된 RNAs 높은 처리량 시퀀싱을 받게 되 면 모든 표준 라이브러리 준비 프로토콜 사용할 수 있습니다, 가장 자주 ribosomal RNA 고갈에 따라. 다른 샘플에서 4tU-seq 데이터 정규화 수행 된 추가 하 여도 다른 종 (즉, 혼합 S. cerevisiae와 S. pombe 셀으로 위)22 또는 생체 외에서-에서 RNA를 표시 복사할 수, thiolated 스파이크에 RNA12,25,,2627. 상용 microarray 칩 전체 transcriptome 신진 및 분열 효 모, 1 개의 단 하나 실험에서 두 유기 체에서 mRNA의 정량화를 허용에 대 한 프로브를 포함 합니다. Microarray 내 총과 새로 합성 RNA (야생-타입, spt20Δ, 및 bre1Δ) 위에 표시 된 대로 실시간 정량 Pcr에 의해 검증 수행 했다. 또한, 우리는 ubiquitinable 잔류물 (K123R)의 점 돌연변이 통해 히스톤 H2B의 monoubiquitination를 지원 하지 않는 긴장 포함. S. pombe 셀의 정확한 동일한 비율 다른 샘플 및 복제에 사용 되었다, 때문에 그것은 선형 배열 의해 가능 농도 그래서 총 레이블이 S. pombe 프로브는 동일한 중간 강도. 이 정규화, 또는 리 스케일링, 패트릭 크레이 머의 연구소에 의해 개발 된 Bioconductor 패키지를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 모든 분석된 샘플, 총에 사용 및 표시 분수와 야생 형 및 돌연변이 체 긴장8. 간단히,이 파이프라인의 입력 모든 예제 및 분수는 프로브와 MAS5 (RMA) 그들의 강도 포함 하는 Excel 파일입니다. 탐지의 범위 밖에 있는 프로브를 제외한 후 신호 강도 rescaled, S. pombe 프로브의 강도 값을 고려. 마지막으로 매핑할 수 있습니다 프로브 신진 및 분열 효 모 게놈, 스파이크에 대 한 정규화 된 식 값을 포함 하는 행렬으로 끝나는. 이러한 값은 추가 될 수 있습니다 (다음 섹션 참조)를 처리 하거나 그대로 사용. 다음 예제에서 우리는 배 돌연변이 야생-타입 스트레인 사이 모든 사본을의 변경 결정.
분석 두 정상 상태에 대 한 수행 또는 새로 합성 RNA의 수준 및 그들의 통계적 의미에 대 한 플롯 (p-값) (그림 3). 다른 연구 결과, 총 RNA 수준 분석 했다, 단지 몇 가지 유전자 변경, 그들의 식과 일치 하 여 업 또는 downregulated (그림 3A-3 C). 그러나, 새로 베 껴 진된 RNA의 분석은 현저 하 게 다른 결론에 지도 했다. 4000 명 이상의 유전자의 새로 베 껴 진된 mRNA 수준 이상 감소 크게 했다 SPT20, 제안 신진 효 모 (그림 3D에에서 RNA 중 합 효소 II 전사에 사가의 글로벌 긍정적인 영향의 삭제에 따라 두 가지 ). 또한, bre1Δ와 K123R 돌연변이 결과 더 신중 했다: 대부분 유전자 감소, 그들의 표현을 나타나지만 실제로 더이 크게 영향을 받는 유전자 (≈ 300-500)의 수와 downregulation의 정도 (그림 3E 및 3F) 제한 됩니다.
로 이전 언급 한, 정상 또는 총 수준 mRNA의 합성 및 감퇴(그림 4)사이 단단한 균형에 의해 지시는. 두 가지 시나리오를 사진 수 있다 RNA 중 합 효소 II 전사 이면 세계적으로 장애인: (i)는 어느 총 mRNA 수준 감소 감소 합성 하지만 지속적인 부패에 대 한 응답으로, 세계적으로 또는 (ii) mRNA 저하 같은 정도로 감소 결과 주로 정상 mRNA 수준 변경. 두 번째 시나리오 사가 또는 TFIID 중단9,10,,1416,22의 맥락에서 포함 한 여러 가지 조건에 대 한 보고 되었습니다. 동적 transcriptome 비교 분석 (cDTA)를 호출 하는 프로시저와 4tU 라벨에 동적 운동 모델링 mRNA 합성을 결정 하 고 모든 사본8,10에 대 한 감소율을 유추할 수 있습니다. 다시 한번, 우리는 이전에 언급 한 긴장 (야생-타입, spt20Δ, bre1Δ, 및 K123R)에 대 한 수집 된 데이터의 이용을 했다. SPT20의 삭제 시 예상 대로 합성 및 저하 속도 야생-타입 긴장에 비교 될 때 mRNA에서 동시 감소를 관찰 합니다. 이 돌연변이 스트레인 보상은 거의 최적의 평균 3.8-fold의 합성 감소 및 평균 4.1-fold (그림 4B), 확실 한지 알아보는 왜 제한 transcriptional 변경 될 수의 감소 총 mRNA 수준(그림 3)에서 검색. 두 개의 다른 돌연변이 체 긴장 (bre1Δ와 K123R)에서 mRNA 합성 및 붕괴에 수 반하는 변화 또한 관찰 되었다, 하지만 훨씬 작은 규모에 변화 했다 그리고 더 분산 (그림 4C 와 4d).
그림 1 : 4tU를 사용 하 여 RNA의 대사 라벨의 도식 대표. 갓된 4tU 문화 매체에 추가 하 고 셀 6 분 Labeled S. cerevisiae 에 대 한 분류는 및 S. pombe 셀 3: 1의 비율로 혼합 되어 총 RNA 추출. 그 후, 새로 합성 RNA biotinylated 이며 streptavidin 입히는 자석 비즈를 사용 하 여 순화 될 수 있다. 마지막으로, 총 (정상 상태) RNA 그리고 표시 새로 합성 RNA에서에서 사용할 수 있습니다 다양 한 다운스트림 응용 프로그램, 포함 한 실시간 정량 및 microarray 교 잡 또는 시퀀싱. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 분석 transcriptional 변화 둘 다 안정-상태 및 새로 묘사 복사할 RNA 실시간 정량 Pcr에 의해 결정 됩니다. 5 다른 유전자의 (A) RNA 수준 노출 하거나 야생-타입 셀에서 또는 4tU 정화 레이블이 RNA 분수에서 계량 했다. 다음 두 개의 패널 (B) 총 고 (C) 새로 합성 야생-타입 (WT), spt20Δ, 및 bre1Δ 효 모 세포에 대 한 실시간 정량 Pcr에 의해 RNA 정량화. Spt7 앵커 멀리 긴장, 치료 또는 60 분, rapamycin 치료 했다 4tU, 표시 및 (D) 총 또는 (E) 새로 복사할 RNA 실시간 정량으로 계량 했다. (F)이이 패널 정상 상태 고 새로 변화 시간 과정 분석 Spt7 핵 고갈에 따라 mRNA 합성 보여줍니다. 모든 샘플에 대 한 5 개의 RNA 중 합 효소 II 유전자의 mRNA 수준 실시간 정량 Pcr에 의해 정량 했다. Rna 중 합 효소 나 고 RNA 중 합 효소 유전자 III (RDN25 와 snR6, 각각) 제어로 사용 되었다. 식 값 아군에 S. pombe 를 표준화 했다 (± SD 3 개의 독립적인 실험의 의미) 신호 및 제어 샘플에 1로 설정. 패널 D F 밥티스타 외 에서 수정 된 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 전체 또는 레이블이 RNA 분수를 사용 하 여 mRNA 레벨의 게놈 넓은 분석. 이러한 패널 보기 화산 플롯 (A C) 정상 mRNA 수준에서 보여주는 배 변화 또는 (D-F) 새로 합성 그들의 의미에 상대적인 mRNA 수준 (p-값). 배 변화 (FC) (A 와 D) spt20Δ에 S. pombe 신호에 정규화 후 각 유전자의 식 값의 비율의 log2로 계산 되었다 (B 및 E) bre1Δ, 또는 ( C 와 F) K123R 야생-타입 S. cerevisiae에 대 식 값 동일한 유전자의 변형. 5,385 유전자의 총 분석 했다, 그리고 두 가지 임계값 변경 (블루 도트:를 두 가지 이상 감소, 노란 점: 이중 증가 보다 더)와 0.05 p-값으로 간주 됐다. 패널 A 와 D 밥티스타 외 에서 수정 된 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 병렬 mRNA 합성에 변화 및 mRNA 감퇴 결과 mRNA 버퍼링에. (A)이이 패널 표시 도식 RNA 합성 섭 동 결과 정상 RNA 수준에. (B-D) 이러한 패널 mRNA 합성 및 총과 새로 합성 RNA의 분석에서 감소율의 계산을 표시합니다. 합성 및 부패 속도 각 S. cerevisiae 사본 (B) spt20Δ, (C) bre1Δ, 및 (D) K123R에 대 한 결정 했다. 변화 (돌연변이 야생-타입 사이 비율의 log2로 계산) 합성 레이트에 감소율에 변화에 대 한 구성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
전사에 대 한 변경 내용을 분석 하는 게놈 넓은 도구는 여전히, 개선 하는 동안 정상 수준의 RNA의 정량화를 통해 transcriptome의 유일한 분석 수 있습니다 정확 하 게 반영 하지 변경 RNA 중 합 효소 II 활동에. 실제로, mRNA 수준 RNA 합성에 의해 뿐만 아니라 그들의 성숙과 저하에 의해 통제 된다. 측정 하려면 mRNA 합성 mRNA 저하에서 연결, 고유 프로토콜 효 모와 포유류에 초기 전사의 분석에 대 한 최근 몇 년 동안 개발 되었습니다.
초기 전사의 정량화에 대 한 가장 널리 사용 되는 프로토콜 중 하나 촉진제-seq1입니다. 촉진제-seq의 주요 장점은 높은 해상도 낮은 배경에서 transcriptionally 약혼 하 고 활성 중 합 효소를 공개로 그것의 수 용량, 그것은 그것의 매력을 감소 하는 두 가지 포인트: (i) 그것은 기술적으로 도전 하며는 핵과, (ii) 핵 조작의 절연 시스템28일부 섭을 소개 합니다. 또 다른 대안은 이다 그물-seq, 매우 안정적인 삼항 복잡 한 초기 RNA, 템플릿 DNA, RNA 중 합 효소 II 사이 형성의 immunoprecipitation에 따라 얻은 기록의 3' 끝의 시퀀싱에 의존. 이 이렇게 기본적인 쌍 해상도에서 초기 RNAs의 특성을 허용 하 고 수정된 RNA 중 합 효소 II의 immunoprecipitation 통해 mRNA 처리 이벤트를 둘러볼 수 있습니다 (떠들고 5 인 산화, 예를 들어)2,3 , 29. 그럼에도 불구 하 고, 그것은에서 우리는 3을 강조 몇 가지 장애물을 선물 한다. 첫째, RNA 중 합 효소 II를 대상으로 하는 항 체는 일반적으로 매우 구체적인, 하는 동안 그것은 항 체 효율에 따라 다릅니다. 둘째, RNA 수 있습니다 인큐베이션 기간 동안, 저하 경향이 따라서 이전 위치로 다시 우리를 선도 (덜 효율적인 항 체는 RNA 더 저하에 취약 떠나는 시간 이상 보육 필요할 수 있습니다)29. 세 번째, 그리고 특히에 포유류, MNase 소화와 크기 선택 고유한 시퀀스 정렬29,30제외 수 있습니다.
여기 우리는 S. cerevisiae 사용 가능한 다른 방법에 비해 여러 장점이 있는에 4tU를 사용 하 여 새로 합성된 RNA의 대사 라벨에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 전사 섭에 매우 민감한 때문에, 세포는 가장 생리 적 조건에 유지 되어야 한다. 예를 들어, GRO-seq transcriptionally 약혼된 RNA 중 합 효소 II sarkosyl에 셀/핵의 노출을 통해의 체포를 의미합니다. 그러나, sarkosyl 처리 몇몇 세포질 과정11의 금지로 설명 하고있다. 이 경우에, 4tU 또는 4sU 설명 된 농도에서 대사 라벨 비 perturbing 이며 눈에 띄게 영향을 주지 않습니다 세포 항상성 노출의 짧은 기간 동안 특히. 전사 억제를 사용 하 여 mRNA 반감기를 측정 하는 다른 방법, 달리 cDTA 또는 4tU-seq 및 동적 모델링과 교란된 셀에 모든 단일 mRNA의 저하 속도를 결정 합니다. 따라서, 하나의 단일 메서드는 합성 및 특정 세포 유형에 전체 transcriptome의 감소율에 동시에 해결할 수 있습니다. 이후 cDTA 또는 4tU-seq 신뢰성이 정규화 방법의 활용, 즉 스파이크에서의 사용을 통해 서로 다른 데이터 집합 함께 분석 고 직접 비교. 마지막으로, 대사 라벨 및 새로 합성된 RNA의 정량화 구현할 수 있는 쉽게 어떤 분자 생물학 실험실에서 어떤 특정 장비를 필요로 하지 않는 기술입니다. 이 가능성이 오히려 큰 RNA 생산와 저하 뿐만 아니라 높은 진핵생물 효 모, 더 체계적으로 사용 하는 경향이이 기술 보급을 설명 합니다.
RNA 다른 nucleoside 아날로그, 즉 5-bromouridine (BrU)31,32 또는 5-ethynyluridine (EU)33,34를 사용 하 여 살아있는 세포에 표시 될 수 있습니다. BrU 펄스 표시 된 RNA의 분리 실험 사이 다른 효율성을 있을 수 있는 안티-BrdU 항 체 정화에 의존 합니다. EU 분류 RNA thiol 수정, 감소 시키는 대리인으로 반전 될 수 있다 달리 되돌릴 활용을 선도 하는 클릭 화학을 사용 하 여 biotin에 covalently 활용 될 수 있습니다. BrU와 EU 라벨 게놈 넓은 RNA 감퇴 속도31,32 결정 하거나 평가 초기 RNA 합성34,35포유류 세포에서 사용 되어 왔습니다. 그러나, BrU 또는 EU 라벨 하지 S. cerevisiae에서 설명 하고있다. 실제로, nucleoside 아날로그의 nucleoside 전송의 식이 필요 나타나고, 따라서, 이러한 방법 4tU로 보다 신진 효 모에는 유연성이 있습니다.
4tU 라벨의 기간 적응 시킬 수 있다 고 질문 마다 다릅니다. S. cerevisiae, 6 분의 짧은 라벨 펄스에서에서 합성 되도록 mRNA를 평가할 때 새로 베 껴 진된 mRNA 수준 RNA 저하에 의해 최소로 영향을 받습니다. 지연 시간 전에 수정 된 뉴클레오티드 초기 RNA에 포함 될 수 있습니다 미만 1 분 고려,이 분 라벨 기간 보증 새로 합성된 RNA의 합리적인 금액을 순화 될 수 있다. 이러한 프로토콜을 정의한 밀러 외. 11, 사용 되 고 다른 S. cerevisiae 에 돌연변이 mRNA 합성에 RNA 세계 변화를 나타내기 위해 부패9,,1022,,2627, 36. 더 이상 라벨 기간 (3 h) 대사 펄스 체이스 S. cerevisiae12. 에서 모든 mRNAs의 감소율을 결정 하기 위해 4tU와 라벨에 사용 되었다 마지막으로, 매우 짧은 (1.5 분)에서 4tU 라벨 사용 되었습니다 신진 및 분열 효 모13,,2537RNA 처리 속도 검사 하.
그럼에도 불구 하 고,이 메서드는 전체 프로토콜의 끝에 복구 하는 레이블이 RNA의 상대적으로 낮은 수익률 등 몇 가지 제한이 있습니다. 효 모에는 시작 물자에 제한이 없습니다 metazoan 세포를 분석할 때이 문제가 될 수 있는 하는 동안에, 특히이 프로토콜은 되 고 사용 에 비보. 프로토콜의 제한 단계 중 하나는 레이블이 RNA 수영장, 그 효율은 완전 한에서 멀리 이다, 수정 레이블된 RNA5에서 1에 3 4sU 잔류물을 추정 되었다 biotinylation. 그것은 최근 methanethiosulfonate (MTS)를 사용 하 여 보여주었다-biotin, 비오 틴-HPDP, 대신 복구 된 RNA38의 수익률을 증가 시킵니다. 그러나,이 연구 그룹에서 게시 되지 않은 결과 및 결과 Rutkowski 및 Dölken에서, MTS-비오 틴은 완전히 thiol 관련, 특히 문제가 때 낮은 양의 레이블이 RNA 레이블이 RNA의 정화를 선도 하 순화39. 4tU/4sU를 사용 하 여 신진 대사 라벨의 또 다른 한계에는 RNA 중 합 효소 elongates 고유의 속도입니다. RNA 중 합 효소 II의 평균 속도 약 3.5 kb/분40,,4142것으로 추정 했다. 따라서, 6 분 라벨에 중 합 효소 15-20 kb 녹음 용량을 있을 것 이다. 따라서,는 짧은 펄스-라벨 4tU/4sU와 함께 실험에만 3' 끝 5' 끝 지역 4tU/4sU의 추가 하기 전에 기존의 동안 새로 베 껴 진된 RNA의 일부가 표시 됩니다. 따라서, 레이블이 RNAs의 정화는 또한 성적, 특히 포유류 세포로 긴 기록에 대 한 기존의 5' 끝을 풍요롭게. TT-seq 라는 세련 된 프로토콜에서이 편견을 극복 하기 위하여 추출 된 RNA 라는 조각화 되어 새로 합성된 종43의 정화 이전 쥡니다에 의해 있습니다.
전부, 4tU-seq 주소 transcriptional 변화 주어진된 문맥에 있는 훌륭한 방법입니다. 그럼에도 불구 하 고, 그리고 프로토콜은 매우 간단, 그것은 궁극적으로 비교적 광범위 한 되 고 여러 다른 단계로 구성 됩니다. 맨먼저, 때문에이 프로토콜 처리 처음부터 끝까지 RNA, 그것은 깨끗 하 고 저하 무료 샘플에 필요한 모든 요구 사항을 충족은 필수. 따라서, 모든 시 약 RNase 무료 이어야 하며 모든 자료 조작 RNA, RNase 오염 제거 솔루션으로 철저 하 게 그리고 정기적으로 모든 청소에 전념 한다. 둘째, biotin 반응이 매우 구체적인, 하는 동안 반응 하지 않았다-HPDP biotin의 초과 ()을 피하기 위해 covalently에 바인딩되지 RNA, 예를 들어 비타민 b 복합체와 streptavidin 구슬의 채도 샘플에서 제거 되어야 합니다. 셋째, 프로토콜에 설명 된 대로 표시 된 streptavidin 입히는 자석 구슬의 사용 사용 하지 않는 것이 좋습니다, 이후 여러 연구 그룹 우리 얘기 모든 표시이 구슬 배경 저수준에 지도. 넷째, 적절 한 품질 및 실험 제어를 사용 해야 합니다. 4tU/4sU에 노출 되지 셀에서 파생 하는 샘플을 포함 합니다. 이러한 샘플 주소 배경 수준에 큰 가치가 있을 것입니다 하 고 있는지 확인, 실험 기간 동안, 레이블이 아닌 RNA와 오염 발생 하지 않습니다. 또한, 샘플은 새로 합성된 RNA에 대 한 풍부 하는 여부를 테스트 하는 또 다른 우수한 대안 실시간 정량 Pcr을 수행 하는 소개를 포함 하는 유전자에 대 한 프라이 머를 사용 하 여. 뇌관은 3' 끝 및 2 개의 연속 exon과 intron, 또는 그 반대로의 5' 끝에 보완 해야 한다. 마지막으로, microarray 교 잡의 시퀀싱 전에 실시간 정량 Pcr에 의해 샘플을 확인 합니다. 이 대 한 표현과 규제의 다른 수준으로 다른 유전자 해야 선택 되며 분석. 최적으로,이 RNA (정상 상태와 새로 합성 RNA)의 두 개의 서로 다른 분수에 대 한 수행 되어야 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 그의 지원에 대 한 라 즐로 토 라와 V. 피셔, K. 슈마허와 F. 엘 Saafin 그들의 토론에 대 한 감사합니다. 결핵은 마리 퀴리-ITN 화목 (PITN-가-2013-606806, NR 그물)에 의해 지원 되었다 Fondation 아크. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR-15-CE11-0022 SAGA2)에서 기금에 의해 지원 되었다. 이 연구는 ANR-10-LABX-0030-INRT, 관리 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 아래 직원 회 드 라 검색 하는 프랑스 국가 기금에 의해 또한 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
References
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