Summary
Kynurenine 통로 (KP) neuroactive metabolites 변경 정신 질병에 연루 됩니다. 변경 된 kynurenine 통로 신진 대사에서 vivo에서 설치류에서의 기능적인 결과 조사 하 고 새로운 치료 접근을 명료 하 게 하는 것을 도울 수 있다. 현재 프로토콜 쥐에 심각한 kynurenine 도전의 영향을 조사 하기 위해 생 화 학적 및 행동 접근을 결합 합니다.
Abstract
트립토판 저하의 kynurenine 통로 (KP) 정신 장애에 연루 되었습니다. 특히, 사이토 파생 된 대사 산물 kynurenic 산 (KYNA), 두 N에 적-메 틸-d-aspartate (NMDA)와 α7 nicotinic 아 세 틸 콜린 (α7nACh) 수용 체, 건강과 질병에 있는 인지 과정에 연루 되어 있다. KYNA 레벨은 정신 분열 증을 가진 환자의 두뇌에서 상승로 glutamatergic 및 해 수용 체에서 오작동 인지 기능 장애, 질병의 병리학의 핵심 도메인 관련 원인이 될 여겨진다. KYNA는 정신 분열 증을 가진 개인에서 pathophysiologically 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그것은 직접 bioprecursor kynurenine와 동물을 치료 하 여 설치류 두뇌에 내 인 성 KYNA 상승 수 그리고 쥐에 전 임상 연구는 급성 고도 KYNA에 그들의 학습 및 메모리 프로세스 영향을 미칠 수 증명. 현재 프로토콜이 실험 방법을 자세히 설명 하 고 혈액 kynurenine 수준 및 뇌 KYNA 형성 (를 사용 하 여 고성능 액체 크로마토그래피), a)는 생 화 확 적인 분석을 결합 하 여 b) 행동 테스트를 조사 하는 hippocampal 종속 컨텍스트 메모리 (수동 회피 패러다임), 그리고 c) 수 면-각 성 행동 [뇌 파 (EEG)와 치십시오 (EMG) 신호를 결합 하는 telemetric 녹음]의 평가 쥐에서. 함께 찍은, 높은 KYNA, 수 면, 그리고 인식 사이의 관계를 공부 했다, 그리고이 프로토콜 kynurenine 상승 및 KYNA 형성에서 vivo에서 쥐에서의 함수 결과 이해 하는 실험적인 접근 방식을 자세하게에서 설명 합니다. 이 프로토콜의 변화를 통해 얻은 결과 KP와 KYNA 수 면과 건강 및 질병 상태에서 인식 변조에 중추적인 역할을 봉사 하는 가설을 테스트 합니다.
Introduction
KP는 필수 아미노산 트립토판1의 거의 95% 저하 합니다. 포유류 두뇌에서 kynurenine 이다로 효소 kynurenine aminotransferase (KAT) II2로 주로 neuroactive 작은 분자 KYNA에 대사입니다. KYNA 뇌2,3,4, α7nACh와 NMDA 수용 체에 길 항 근으로 작동 하 고 또한 대상 aryl 탄화수소 수용 체 (a h R) 등 G-단백질 수용 체 신호 결합 수용 체 35 (GPR35)5 ,6. 실험 동물에서 뇌 KYNA 고도 행동 분석 실험2,7,8,,910 의 그들의 인지에 관한 퍼포먼스를 손상 표시 되었습니다. . 신흥 가설 제안 KYNA 따라서 변조 수 면의 신경 생물학에서에 더 사이토 파생 분자의 역할을 지 원하는 수 면-각 성 동작11, 영향에 의해 인지 기능 조절에 필수적인 역할 재생 및 인식12.
임상, KYNA 고도 발견 되었습니다 척수 및 사후 뇌 조직에서 정신 분열 증13,,1415,16, 쇠 약 정신 장애를 가진 환자에서 인지 장애가 특징. 정신 분열 증 환자는 또한 종종 병17을 악화 수 있습니다 수 면 방해에 의해 괴 롭 혀. 이 불 쌍 한 결과 정신 분열 증 및 다른 치료에 대 한 새로운 치료의 발전으로 이어질 수 있습니다 변조 수 면과 인식, 학습 및 메모리, 사이 특히 관계에 KP 신진 대사와 KYNA의 역할을 이해 정신과 질병
KP 대사 산물의 측정에 대 한 안정적이 고 일관 된 방법을 다양 한 기관에서 신흥 연구 KP 생물학의 과학적 이해에 통합 될 수을 보장 하기 위해서 중요 하다. 현재, 우리는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 쥐 플라스마에서 kynurenine 및 쥐 두뇌에 있는 KYNA를 측정 하는 방법론을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 만드는 존재 Zn2 +fluorimetric 검색의 사용, 시바타18 등 최근 적응 하 고 허용 후 열 시 약으로 500 m m 아연 아세테이트와 derivatize을 최적화 된에 의해 처음 개발 되었다 생, nanomolar 양의 KYNA 뇌11탐지 합니다.
현재 프로토콜에 설명 된 대로 드 노 보 생 KYNA 생산을 자극, 직접적인 bioprecursor kynurenine intraperitoneally 주입 (i.p.) 쥐에서. KYNA 생산의 정도 확인 하는 생 화 확 적인 평가 함께, hippocampal 종속 메모리 (수동 회피 패러다임)에 도전 하는 kynurenine의 영향 및 수 면-각 성 건축 (EEG 및 EMG 신호) 이기도 조사11. 이러한 기술 조합은 kynurenine 도전에서 vivo에서 쥐에서의 생 화 학적 및 기능적 영향의 연구에 대 한 수 있습니다.
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Protocol
우리의 실험 프로토콜 메릴랜드 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한에 국립 보건원의 가이드를 따 랐.
참고: 성인 남성 Wistar 쥐 (250-350 g)는 모든 실험에 사용 되었다. 별도 동료 동물의 생 화 확 적인 분석, 행동 실험, 그리고 수 면-각 성 녹음 사용 되었다. 동물은 메릴랜드 정신 연구 센터에서 온도 제어 시설에 보관 되어 있었다. 그들은 유지 했다 12/12 h 빛 어두운 주기에, 조명 zeitgeber 시간 (ZT)에 0와 ZT 12에서 조명. 동물 실험 동안 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스를 받았다. 시설 완벽 하 게는 인가의 실험실 동물 관리에 대 한 미국 협회에 의해 공인 되었다.
1. 복 Kynurenine 쥐에 관리
참고:이 프로토콜에서 kynurenine 투여 ZT 0 (빛 단계 시작)에서 그리고 조직 kynurenine 물질 대사에 대 한 시간 코스를 결정 하는 ZT 2와 ZT 4 수집. 식 염 수 주입 동물 제어로 사용 되었다. 예를 들어, 쥐 무게 500 g을 원하는 복용량은 100 mg/kg는 쥐 kynurenine의 10 mg/mL 해결책의 5 mL 주입을 받아야 한다.
- 그리고 L-kynurenine 황산 염 ("kynurenine") 밖으로 무게 20 mL 유리 유리병에 넣습니다. 모든 시간에 얼음에 kynurenine를 유지 해야 합니다.
-
원하는 농도 달성 하 고 1 N 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 7.6에 pH를 조정 하는 염 분을 추가 합니다. 소용돌이는 kynurenine 완전히 해산 했다 때까지 솔루션을 sonicate.
주의: NaOH를 처리 하는 동안 모든 권고 조치를 따르십시오.- 예를 들어 10 mg/mL 해결책을 달성 하기 위해 밖으로 kynurenine의 200 밀리 그램 무게 하 고 유리 유리병에 키를 누릅니다. 염 분 및 소용돌이의 15 mL을 추가 하 고 (20 kHz에 대 한 5-10, 1/8 인치 직경 microtip) sonicate 그것 해산. NaOH를 사용 하 여 솔루션의 pH 조정 합니다. 마지막으로, 염 분을 사용 하 여 20 mL에 양을 맞추십시오.
- 각 실험 쥐의 무게 하 고 동물의 몸 무게와 원하는 치료 복용량에 따라 각 주입의 볼륨을 계산. 조심 스럽게 집 그것의 감 금에서 동물을 제거 하 고 솔루션 intraperitoneally, 주입 하 고, 동물의 감 금 소를 반환.
2. Kynurenine 측정을 사용 하 여 고성능 액체 크로마토그래피
- 조직 컬렉션
참고:이 프로토콜에서 kynurenine 투여 ZT 0 (빛 단계 시작)에서 그리고 조직 kynurenine 물질 대사에 대 한 시간 코스를 결정 하는 ZT 2와 ZT 4 수집. 식 염 수 주입 동물 제어로 사용 되었다.- 이산화 탄소를 사용 하 여 동물을 안락사. 호흡의 징후는 1 분 동안 중지 해야, 후 잘린 보조 안락사 방법을 수행 합니다.
- 전체 트렁크 혈액 수집, K3의 20 μ를 포함 하는 15 mL 튜브에 일회용 퍼 널 배치-EDTA (0.5 M). 튜브에 시체에서 배수를 혈액을 허용 한다. 반전 EDTA를 보장 하기 위해 반복적으로 튜브를 통해 혼합.
- 두개골을 노출 하는 중간 선 아래로 머리 위에 피부를 잘라가 위를 사용 하 여. 뒷면에 두개골, 척수, 두개골에서 다시 앞을 통과 대 한 개통에 있는 과잉 목 근육을 제거 합니다.
- 부드럽게 두뇌, 노출 오픈 두개골의 두 측면을 당겨 하 고을 손상 집게와 두뇌를 조심 스럽게 제거. 면도날으로 후 각 전구를 제거 하 고 정중 선 아래로 반 뇌를 잘라. 집게를 사용 하 여 (즉, 해 마와 대뇌 피 질)의 지역으로는 hemibrain를 해 부.
- 드라이 아이스에 알루미늄 호 일에 모든 해 부 뇌 조각을 놓으십시오. 조직이 완전히 고정 후 전송 20 mL 플라스틱 병 하 고-80 ° c.에 그것을 저장합니다
- 10 분 상쾌한 (플라즈마)를 제거 하 고 새로운 원심 분리기 튜브-80 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 전송에 대 한 300 x g 에서 전체 트렁크 혈액을 원심
- 샘플 준비
- 치료 동물에서 플라즈마: 수집
- 플라즈마와 냉동된 튜브를 녹여 (조직 컬렉션에 대 한 단계 2.1 참조) 젖은 얼음에.
- 새로운 원심 분리기 튜브에서 초순 (kynurenine, KYNA 1시 10분에 대 한 1:2)와 함께 샘플을 희석. 희석된 샘플의 100 μ, 6%과 염소 산의 25 μ 추가 합니다.
주의:과 염소 산을 처리 하는 동안 모든 권고 조치를 따르십시오. - 소용돌이, 모든 샘플 다음 원심 그들 12000 x g 10 분 동안에. 완료 되 면, (각 관)에서 상쾌한의 100 μ를 제거 하 고 kynurenine 또는 KYNA 결정에 대 한 작은 0.25 mL microcentrifuge 튜브에 넣어.
- 두뇌: 치료 동물에서 수집
- 드라이 아이스에 냉동된 뇌 샘플 (조직 컬렉션에 대 한 단계 2.1 참조) 튜브를 놓습니다. 개별적으로 정확한 분석 균형에 각 두뇌 샘플 무게. 튜브를 반환 하 고 다시 제자리에 드라이 아이스.
- 모든 샘플 무게 되었습니다, 튜브 젖은 얼음에 이동 합니다. 각 샘플 1시 10분 희석 초순와 w/v sonicator (20 kHz에 대 한 5-10, 1/8 인치 직경 microtip)를 사용 하 여 균질 하 고. 예를 들어 뇌 조직의 100 밀리 그램, 900 μ 초순의 추가.
- 각 희석 aliquot 100 μ 새로운 튜브를 시음 하 고 25%과 염소 산의 25 μ와 그것을 시 어 지 다. 소용돌이, 다음 10 분 동안 12000 x g 에서 원심.
- 원심, 후 상쾌한의 100 μ를 제거 하 고 KYNA 결정에 대 한 작은 0.25 mL microcentrifuge 튜브에 배치 합니다.
- 치료 동물에서 플라즈마: 수집
- HPLC 설치 및 실행
- 50mm 나트륨 아세테이트 모바일 단계를 준비 합니다. 6.81 g 나트륨 아세테이트 안 초순 물 1 L에의 해산. 6.2 빙 초 산을 사용 하 여에 pH를 조정 하 고 진공 깨끗 한 유리에 그것을 필터링. 깨끗 한 유리병 1 L에 나트륨 아세테이트 모바일 단계를 전송 합니다.
- 500 m m 아연 아세테이트를 준비 합니다. 진공 필터 다음 초순 물 500 mL에 아연 아세테이트의 54.88 g을 분해. 깨끗 한 500 mL 유리 병에 그것을 전송. 초순 수 1 L 병 및 HPLC 급 이기와 500 mL 병 채우기.
- 모바일 위상, 초순, 및 100% 이기에 별도로 HPLC 기계에서 흡입 튜브를 놓습니다. 펌프는 derivatization 이전 및 모바일 단계 후 열과 결합 하는 연동 펌프를 통해 별도로 아연 아세테이트 솔루션.
- 컴퓨터에서 제어판을 사용 하 여, 5% 이기와 95% 초순 0.5 mL/분에서 안정적인 압력 및 기준선을 20-30 분 동안 실행할 수 있도록 실행 프로그램.
- 안정적인 기준 설정 시 5% 이기를 95% 나트륨 아세테이트 모바일 단계 솔루션 구성 변경. 30 분 동안 equilibrate.
- 형광 검출기에 램프를 켜고 따뜻하게 수 있습니다.
- 한편, 0.1 mL/분의 유량을 후 열 펌프에 또한 차례 약 20 분 후 약 500 psi의 안정적인 압력에 도달 수 있습니다.
- 표준 준비.
- KYNA, 1 m m 재고 솔루션으로 시작 하 고 준비 5 표준 농도를 희석 (즉, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM, 그리고 500 분).
참고:이 200 fmoles에서 20 μ 주입 당 10 fmoles에 이르는 표준 곡선을 생산할 예정 이다. - Kynurenine, 1 m m 재고 솔루션으로 시작 하 고 준비 5 표준 농도를 희석 (즉, 10 μ M, 5 μ M, 2.5 μ M, 1 μ M, 및 500 nM).
참고:이 200 pmoles에서 20 μ 주입 당 10 pmoles에 이르는 표준 곡선을 생산할 예정 이다.
- KYNA, 1 m m 재고 솔루션으로 시작 하 고 준비 5 표준 농도를 희석 (즉, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM, 그리고 500 분).
- 샘플 시퀀스 매개 변수를 제어 하 고 여러 샘플의 autoinjections에 대 한 허용을 HPLC 시스템 소프트웨어를 설정 합니다.
- 때 "실행 샘플" 화면에 "파일"을 클릭 하 고 "새로운 예제 집합 만들기"를 끕니다. 새 창이 열리면 "빈"을 선택 합니다. 개별적으로 모든 표준 (단계 2.3.8 참조) 또는 그들을 실행 하는 순서에서 샘플을 나열 합니다.
- "기능" 열에는 표준 및 샘플을 지정 합니다. 표준 시작 하 고 시퀀스의 끝에 분석 한다. 모든 5 샘플 사이 물 주사.
- 샘플의 15 분 주사 20 μ는 표준 및 플라즈마 준비에서 각 샘플에 대 한 런타임 설정 또는 뇌 homogenate 준비에서 샘플의 30 μ 주사.
- 여기에 kynurenine에 대 한 여기 및 방출 파장 (평가 되는 화합물에 따라 다름)을 설정: 365 nm, 방출: 480 nm, 그리고 보존 기간: ~ 6 분, 그리고 여기에 KYNA: 344 nm, 방출: 398, 및 보존 기간: ~ 11 분.
- 모든 매개 변수를 설정 하 고 기계는 equilibrated, 시퀀스를 실행 합니다.
- 계량 데이터를 "프로젝트 찾아보기" 화면으로 이동 합니다. "샘플 세트" 탭 아래에서 측정할 수로 설정 하는 샘플에 두 번 누릅니다. 모든 주사의 목록에서 모든 기준을 선택 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 합니다. 새 창에서 "프로세스", 다음 "어떻게" 옆 "Quantitate 및 보정"을 선택 드롭-다운 메뉴를 사용 하 여:.
- 다시 모든 표준 강조 표시, 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "검토"를 선택 합니다. Chromatograms 열 경우, 위쪽 단추를 사용 하 여 "통합" 및 다음 "보정" 각 표준; 이것은 자동으로 표준 곡선을 만듭니다.
- "샘플 세트" 탭을 샘플 세트를 두 번 클릭. 다음으로, 모든 기준을 강조 한다. 반복 프로세스 위에서 언급 한, 대신, "Quantitate" 드롭 다운 메뉴에서 선택 합니다. 모든 샘플을 다시 강조, 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "검토"를 선택 합니다. Chromatograms을 열 때 "통합" 위쪽 단추를 사용 하 고 각 샘플 "Quantitate".
참고:이 이전에 만든된 표준 곡선에 따라 각 샘플의 농도 출력 합니다.
3. 수동 회피 패러다임
참고: 이러한 행동 실험 급성 kynurenine 도전과 우리의 생 화 확 적인 연구 결과에 따라 설계 되었습니다. 최대화 하려면 뇌 KYNA 증가, kynurenine (100 mg/kg) ZT 2에서 발생 한 hippocampal 중재 학습을 수동 회피 패러다임에 ZT 0 일 2 시간 교육 세션 이전에 관리 되었다. 2 동등 하 게 치수가 재 진된 구획 (21.3 cm 높이, 20.3 c m 폭, 그리고 15.9 c m 깊은) 길로 틴 문으로 구분 하 고 방음 상자 내에 포함 된 장치에 의하여 이루어져 있다. 테스트 장치의 2 개의 구획 "빛"과 "어두운 쪽" 불린다. 빛이 측면의 벽은 분명 하 고, 실험, 빛 켤 것 이다 더 조명에이 구획. 어두운 구획의 벽은 완전히 블랙 아웃 상태를 유지 하기 위해 적용 됩니다.
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제 1 일: 교육 시험
- 테스트 전에 70% 에탄올과 기구를 청소.
- 시험장에는 동물을가지고.
- 부드럽게 실험 동물의 장치 및 주변 빛이 측면에 놓고 래치 장치 문 및 방음 상자.
- 관련된 소프트웨어를 사용 하 여, 재판 시작. 홈 화면에서 드롭 다운 메뉴에서 "파일" 그리고 "오픈 세션"을 선택 합니다. 새 창에서 올바른 절차와 장치 선택 하 고 "닫기"를 클릭 합니다. 다음으로, "구성" 그리고 "신호"를 선택 합니다. 새 창에서 올바른 장치를 선택 하 고 "문제"를 클릭 합니다.
참고: 소프트웨어 기구의 빛이 측면에서 설정 하 고 두 개의 구획 사이 길로 틴 문을 열어 빛을 시작 합니다. 타이머는 시작 될 것 이다. - 때 동물 완전히 기구는 단두대 문 닫힐 것 이다, 그리고 피할 수 없는 발 충격의 어두운 면을 입력 (0.56 1 mA s) 전달 됩니다.
- 동물 어두운 구획 입력 되기 전에 경과한 시간을 기록 합니다.
- 동물에서 충격을 받으면은 허용 30 기구에서 동물을 제거 하기 전에 복구 시간의 s.
- 장소는 집 안의 동물 다시입니다.
- 다음 동물 재판을 시작 하기 전에 깨끗 한 젖은 수건 및 모든 찌 끼 펠 릿의 dispose와 기구를 닦아냅니다.
- 모든 동물을 학습 한 후 동물 시설에 그들을 반환 합니다.
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주 2: 테스트 재판
- 돌려 동물 테스트 룸 24 시간으로 훈련 재판 후. 장치의 밝은 측면에 그것을 배치, 폐쇄 하 고 문과 방음 상자를 래치 하 여 첫 번째 동물에 대 한 테스트 재판을 시작 합니다.
- 이전 날; 동일한 소프트웨어 명령을 사용 하 여 테스트 재판 시작 조명 기구의 빛이 측면에 켤 것 이다 그리고 2 개의 구획 사이 길로 틴 문을 열 것 이다. 타이머는 시작 될 것 이다.
- 동물 어두운 구획 들어가면 길로 틴 문을 닫습니다. 시간 경과 기록.
참고: 평가판 종료 됩니다 소프트웨어를 통해 300의 최대 후 s 동물 테스트 기구의 빛이 측면에 남아 있는 경우. - 그들의 가정 장에 동물 다시 놓고 깨끗 한 장비 (3.1.9 단계에서 설명) 하는 대로 다음 동물 재판을 시작 하기 전에.
4. 수 면 분석
- 무선 뇌 파/EMG 송신기의 외과 이식
참고: telemetric 송신기 소독 및 수술 전에 준비 되어야 한다.- 면도날을 사용 하 여, 부드럽게 작은 길이의 플라스틱 코팅 와이어 연결을 제거 합니다. 살 균 솔루션으로 가득 50 mL 원뿔 튜브에 송신기를 배치 [예를 들어, Wavecide (2.65%도)].
- 적어도 12 h 소독 솔루션에 송신기를 둡니다. 그런 다음, 수술 전에 전송 솔루션 폐기물 컨테이너. 살 균 염 분으로 송신기 린스.
- 수술 당일 마 취 약 실에서 그것을 배치 하기 전에 동물을 무게. 3-5% isoflurane 100% O2를 유도.
- 성공적인 마 취 시 동물을 제거 하 고 신중 하 게 면도, 전기 면도기, 머리와 목, 상단 뿐만 아니라 머리의 작은 패치를 사용 하 여 뒷면 시체, 그냥 약간 왼쪽의 흉 곽 아래에.
- 수술 후 무 통을 위한 피하 carprofen (5 mg/kg)를 관리 합니다.
- 수술 하는 동안 동물의 체온을 유지 하는 동물에서 37 ° C에서 설정 온도 조절 장치로 통제 된 온수 난방 패드를 놓습니다.
- Stereotaxic 프레임에 머리를 안정 시키기 위해 귀 바 마 취 상태를 유지 하는 원뿔에 동물을 놓습니다. 면봉 betadine 스크럽과 70% 에탄올을 번갈아 하 여 면도 피부를 소독. Opthalamic 연 고 눈 그들에 기름칠을 적용 됩니다.
- 첫 번째 절 개 전에 적절 한 마 취를 위해 발가락 핀치 테스트를 사용 합니다.
- 살 균 메스를 사용 하 여 바로 뒤에 목 뒤쪽 아래로 눈에서 절 개를 확인 합니다. 두개골 및 등 자 궁 목 근육 노출 되어야 합니다.
- 경우 두개골을 노출 하는 데 필요한, 도포 면 스쳐를 사용 하 여 어떤 막 제거. 마이크로-불독 클램프 두개골에서 피부를 사용할 수 있습니다. 찾아서는 bregma의 위치를 표시 합니다. 2 버 구멍을 드릴 및 삽입 금속 나사 앞쪽 2.0 m m / + 1.5 m m 측면 및 7.0 m m 후부 /-1.5 m m는 bregma 상대적인 측면. 완료 2 회전 나사를 조입니다. 거 즈의 조각으로 노출 된 두개골을 커버.
- 무 균 수술가 위를 사용 하 여, 신체 구멍 갈비뼈 바로 아래에 절 개를 확인 합니다.
- 수술 장에 이식 될 송신기의 일련 번호를 기록 해야 합니다.
- 신체 구멍 내부 살 균 송신기를 삽입 합니다. 와이어 리드는 몸 밖에 서 여전히 해야 합니다.
- 근육 벽, 절 개의 한쪽 끝에 모여 모든 단서 확보를 흡수 봉합을 사용 합니다.
- 머리에서 거 즈를 제거 하 고 절 개 바로 아래 피부를 리프트. 측면에서 절 개를 머리 절 개에서 한 쌍의 긴 살 균 hemostats 피부 아래를 실행 합니다. 어떤 상해를 최소화 하기 위하여 피부에 압력을 유지.
- 일단은 hemostats 몸 절 개 가까이 볼 수 있습니다, 수술가 위 및 4 개의 송신기는 hemostats 리드 잡아 그들을 커버 수 있습니다 어떤 막 클립. 전선과 피부 아래 누워 두개골까지 실행 되도록 천천히 hemostats, 밖으로 그릴.
- 2 리드를 두개골에 연결 됩니다 지정 합니다. 집게를 사용 하 여 파악 한 손으로 및 다른 플라스틱 칼 집의 끝 바로 아래 와이어의 끝. 개별 루프 밖으로 만들 수 단지 있습니다 때까지에 당겨.
- 단단히 금속 나사 중 하나 주위 노출된 와이어 3-4 x 랩. 일단 보안, 탈피에서 와이어를 방지 하 고 모든 여분의 와이어에서 클립을 나사를 조입니다. 두 번째 리드와 나사가를 반복 합니다.
- 그렇게 그들이 두개골에 대 한 아늑한 앉아 몸 구멍에서 두 뇌 파 리드를 당겨.
- 치과 시멘트를 사용 하 여 나사와 대뇌 피 질의 리드, 노출 된 두개골 위에 모자를 만드는 커버. 아무 치과 시멘트 피부 또는 근육에 집착 하 고 아무 날카로운 가장자리를 만들어집니다 확인 하십시오. 치과 시멘트 건조를 허용 합니다.
참고: 모자 정상 피부를 봉합 될 수 있다 충분히 작은 되어야 합니다. - EMG 리드 4.1.15 단계에서 설명한 대로 와이어 및 플라스틱 칼 집의 끝을 파악. 개별 루프는 명확 하 게 뚜렷한 때까지 와이어를 스트레치.
- 그것을 허용 하기 전에 2-3 mm의 오른쪽에 목 근육 아래 22 G 바늘을 실행 합니다. Nonabsorbable 봉합을 사용 하 여, 단일, 느슨한 봉합 임베디드 바늘 주위 장소.
- EMG 와이어는 바늘에 실 고 밖으로, 스레드에 근육에서 EMG 와이어 수 있도록 바늘. 있도록 장소에 남아 있는 와이어 클립 추가 와이어는 근육에서 나타날 수 있습니다 봉합을 조입니다.
- 두 번째 EMG 리드, 첫 번째 단서에서 내려 약 1 m m 4.1.20-4.1.21 단계를 반복 합니다.
- 그들은 근육에 대 한 아늑한 앉아 있도록 몸 구멍에서 모두 EMG 리드를 당겨.
- Nonabsorbable 스티치를 사용 하 여 머리와 목 절 개를 닫습니다. 신체의 피부 아래 모든 여분의 와이어를 턱 하 고를 닫습니다 시체 절 개 상처 클립을 사용 합니다.
- Lidocaine 연 고 수술 후 통증으로 동물을 돕기 위해 두 절 개 사이트에 적용 됩니다.
- 동물의 집 케이지, 케이지는 동물 마 취에서 회복 될 때까지 난방 패드에 앉아 수를 반환 합니다.
참고: 동물 7-10 일 녹음을 시작 하기 전에 복구 해야 합니다.
- 면도날을 사용 하 여, 부드럽게 작은 길이의 플라스틱 코팅 와이어 연결을 제거 합니다. 살 균 솔루션으로 가득 50 mL 원뿔 튜브에 송신기를 배치 [예를 들어, Wavecide (2.65%도)].
- EEG/EMG 기록
참고:이 프로토콜에서 우리 염 분 또는 ZT 0에서 kynurenine를 관리 하 고 24 h에 대 한 동물의 잠 철 야 패턴을 기록.- 어디 동물 중단 되지 녹음 하는 동안 지정 된 방에 있는 모든 수 면 녹음 완료.
- 수신기 단위에 (이식된 EEG/EMG 송신기 베어링) 동물의 홈 케이지를 놓습니다. 자석 사용 하 여 수술로 이식된 송신기를 켜십시오.
참고: 빛이 나타납니다 수신기 단위에 송신기가 활성화 될 때. - 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 뇌 파/EMG 데이터의 녹화를 설정 합니다.
- 드롭 다운 메뉴에서 "실험" 및 "만들기"를 선택 합니다. 실험, 이름 하 고 그것을 저장 합니다. 다음, "하드웨어" 및 다음 "MX2 구성 편집"을 선택 합니다.
- 새 창에서 모든 송신기 실험에 사용을 선택 하 고는 수신 패드 각와 결합 하 여 나타냅니다. 준비, "시작 모든 연속"를 눌러 녹음을 시작 합니다.
- 실험의 종료에 관련된 소프트웨어에서 "중지 모든 연속" 선택 하 고 송신기는 자석을 사용 하 여 해제 합니다.
- CO2 질 심장 찔린 다음으로 동물을 안락사. 리드 치과 시멘트, 목 근육에서 무료로 수술가 위로 머리의 상단을 따라 절 개를 재개 하 여 송신기를 신중 하 게 제거 합니다.
- 다음, 신체 구멍을 열고, 송신기 찾아서 천천히 몸에서 제거 합니다.
- EEG/EMG 분석
- 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 수 면-각 성 데이터를 분석. 프로그램을 열고 "새 위치 추가"를 선택 합니다. 새 창에서 득점 소프트웨어에 그것을 가져올 데이터를 선택 합니다.
참고:이 소프트웨어를 포함 하는 실험 기간 동안 수집 된 모든 원시 파형 내에서 새 파일을 만듭니다. - 수동으로 원하는 실험에 대 한 경계 상태를 점수. 득점 후 전체 기간, 복싱의 수 등 다양 한 경계 상태 [급속 한 눈 운동 (램), 비-REM과 NREM, 웨이크]의 평균 시 합 기간 매개 변수를 분석 합니다.
참고: 분석 전체 기록 동안 수행 하거나 관심의 포인트를 특정 시간에 단축 될 수 있습니다. 여기, 분석 ZT 0 ZT 2 사이 기록 동안 수행 되었다.
- 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 수 면-각 성 데이터를 분석. 프로그램을 열고 "새 위치 추가"를 선택 합니다. 새 창에서 득점 소프트웨어에 그것을 가져올 데이터를 선택 합니다.
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Representative Results
KYNA 뇌를 높이 방법으로 복 kynurenine 주사를 사용 하 여 유효성을 검사 하려면 조직의 HPLC 분석 수행 되었다. 표준 곡선 (그림 1) 관련된 소프트웨어를 사용 하 고 조직 샘플의 정량화에 대 한 허용에 건설 되었다. Kynurenine 및 KYNA에 대 한 대표 chromatograms는 그림 2에 표시 됩니다. Kynurenine 6 분의 보존 기간에 관찰 되었다 그리고 KYNA 11 분의 보존 기간을 했다. 관찰 하기 위해 KP 역학, kynurenine의 100 mg/kg이이 프로토콜에서 관리 하 고 조직 주입, 또는 2 또는 4 h 후 주입 (그림 3a)는 즉시 다음 수집 된. 플라즈마 kynurenine (그림 3b)와 hippocampal KYNA (그림 3c) 정량 했다. Kynurenine 대사 산물의 HPLC 결정 절차에서 사용 하는 특정 매개 변수는 표 1에 설명 되어 있습니다. 이 프로토콜에 의해 생산 복용량 응답 곡선 피크 2 h 후 주입 및 그들의 기준선 4 h 후 주입을 반환 하는 KYNA의 수준에서 달성 뇌 KYNA 레벨을 증가 하는 방법으로 급성 kynurenine 주사의 설명을 지원 합니다.
상기 생 화 확 적인 연구 결과 바탕으로, 수동 회피 패러다임에서 훈련 kynurenine 주사 (그림 4a) 후 2 h는 수행 했다. 그룹 차이가 훈련 시험 (그림 4b) 기간 동안 관찰 되었다. 테스트 시험 기간 동안 제어 동물 어둠, 상황별 학습을 나타내는 입력 대기 시간이 크게 증가 표시 됩니다. 전날에 kynurenine 주사 동물 학습에 적자를 시연 하는 대기 시간에 동일한 증가 표시 하지 않았다. 이러한 연구 결과 바탕으로, 우리가 메모리 수집 및 통합의 기간 동안 급성 kynurenine 상승 해 마 중재 작업에서 장애인 성능에서 결과 가정할 수 있습니다.
수 면-각 성 건축에 빛 단계 동안 급성 kynurenine 상승의 영향을 조사, 동물 ZT 0 (그림 5a)에서 2 일에 kynurenine와 1 일 분 함께 주입 했다. EEG/EMG 신호는 전체 48 h 동안 telemetrically 기록 되었다. 비교 1 일 식 염 수 주입 (차량)와 하루에 2 kynurenine 주입 되었다. 결과 주사 후 처음 2 h (그림 5b) 동안 총 REM 수 면 기간 (기준선에서 백분율 변경 표시)에 있는 감소를 표시. 이 웨이크 기간이 기간 동안에 증가 하 고 NREM 수 면에서 약간의 감소에 의해 반영 되었다. 이 결과 급성 kynurenine 상승 원인 수 면-각 성 역학에 소요 하는 방법을 보여 줍니다.
그림 1: kynurenine와 KYNA 주입에 대 한 표준 곡선. 각 표준의 20 µ L kynurenine (A)와 (B) KYNA에 대 한 표준 곡선을 만들기를 주입 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: kynurenine 및 KYNA에 대 한 대표 chromatograms. 표준 이전에 그들의 보존 시간을 확인 하는 샘플 실행 되었습니다. 이러한 패널 (A) 혈 청 kynurenine 및 (B) 뇌 KYNA 대표 샘플을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 혈 청 및 kynurenine 도전 다음 HPLC에 의해 hippocampal 조직 분석. (A) Kynurenine (100mg/kg) 또는 염 분 zeitgeber 시간 (ZT) 0에서 복 주사에 의해 관리 되었다. 조직 수집 된 2 또는 4 h 후 주입. 다음 패널 표시 (B) kynurenine-상승 된 혈 청 kynurenine에 노출 및 (C) hippocampal KYNA 주입 후 2 h를 수준. P < 0.001는 양방향 분산 분석 (ANOVA) Bonferroni t다음으로 중요성을 나타냅니다-교정 테스트. N = 그룹 당 4-5. 모든 데이터는 평균 ± SEM. 이 그림 Pocivavsek 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 수동 회피 패러다임에서 hippocampal 종속 메모리에 kynurenine 상승의 효과. (A) Kynurenine (100mg/kg) 또는 식 염 수 (ZT) 0 zeitgeber 시 복 주사에 의해 관리 되었다. 동물 ZT 2 작업에 훈련 했다. 24 시간 훈련 후, 동물 메모리 형성에 대 한 테스트 되었습니다. (B)는 훈련 전에 kynurenine에 노출 테스트 하루에 혐오 어두운 구획을 피하기 위해 대기 시간 감소. P < 0.01, * * * P < 0.001는 양방향 분산 분석 (ANOVA) Bonferroni t뒤에 의해 의미를 표시-수정 테스트. N = 그룹 당 8-14. 모든 데이터는 평균 ± SEM. 이 그림 Pocivavsek 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 수 면-각 성 건축에는 kynurenine 상승의 효과. (A) 염 분 (1 일) 및 kynurenine (100 mg/kg, 2 일) zeitgeber 시간 (ZT) 0에서 복 주사에 의해 관리 되었다. 수 면-각 성 행동 이후 24 h. (B) 급속 안구 운동 (REM) 수 면 기간 감소 되었다 기록 했다 고 웨이크 기간 kynurenine 주입 다음 첫 번째 2 h에 증가 되었다. P < 0.05는 양방향 분산 분석 (ANOVA) Bonferroni t다음으로 중요성을 나타냅니다-교정 테스트. N = 그룹 당 6-8. 모든 데이터는 평균 ± SEM. 이 그림 Pocivavsek 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 모바일 단계 구성 | 50 mM 아세트산 나트륨, pH 6.2 |
| 5% 이기 | |
| 모바일 단계 유량 | 0.5 mL/min |
| 후 열 derivatization 시 약 | 500 m m 아연 아세테이트 |
| 후 열 derivatization 흐름 율 | 0.1 ml/min |
| 열 유형 | ReproSil-Pur C18 |
| 열 크기 | 4 x 150 m m2 |
| 검출기 온도 | 4.0 º C |
| Kynurenine 파장 | 예: 365, Em: 480 |
| Kynurenine 보존 기간 | ~ 6 분 |
| KYNA 파장 | 예: 344, Em: 398 |
| KYNA 보존 기간 | ~ 11 분 |
표 1: 매개 변수 kynurenine 통로 metabolites의 HPLC 결정.
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Discussion
주변 kynurenine 관리 후 두뇌에 있는 KYNA의 신뢰할 수 있는 평가, 결합 하 고 생 화 학적 및 기능 실험 해석 중요 하다. 여기, 우리는 새로운 사용자가 플라즈마 kynurenine 및 KYNA 쥐의 뇌를 측정 하기 위한 효과적인 방법을 설정 하도록 허용 하는 상세한 프로토콜 제시. 플라스마에 kynurenine의 측정 확인 정확한 주입 및 KYNA 대사 산물의 측정 확인 두뇌에 de novo 종합. 설명된 fluorometric HPLC 방법에 맞게 시바타18, Zn2 +, 정확 하 게 nanomolar 범위에서 두뇌에 생 양의 KYNA 검색 하는 기능을 포함 하 여 존재 KYNA derivatize의 몇몇 이점이 있다 . 또한, 메서드는 프로토콜에 설명 된 대로 여기 및 방출의 fluorometric 파장을 조정 하 여 micromolar 범위에 플라스마에 있는 bioprecursor kynurenine를 검출 하기 위하여 적응 되었습니다.
치료 및 안락사, 사이 특정 시간 같은 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 정확 하 게 두뇌에 있는 KYNA 형성의 시간 과정을 결정 및 안내 하는 행동의 분석과 디자인 고 수 면-각 성 설명 실험을 모니터링합니다. Hippocampal 중재 학습 수동 회피 패러다임을 사용 하 여 평가 했다 그리고 수 면-각 성 분석 EEG/EMG 데이터의 telemetric 녹음을 실시 했다. 우리 뇌 KYNA 수준 높은 2 h 후 주입 했다 결정, 우리 초과 행동 패러다임 훈련 세션 따라, 수동 회피 작업에서 수집 발생 KYNA 수준 높은 ZT 2 때 그렇게. 또한, 우리는 또한 ZT 2 시간 프레임 동안 KYNA 수준의 두뇌에 가장 높은 했다 중요 한 ZT 0에 수 면-각 성 행동의 분석을 집중. 함께 찍은, 신중 하 게 고려한 실험 설계는 우리 함께 인식 및 수 면-각 성 동작11의 변조기로 KYNA를 소개, 생 화 학적 및 기능 실험 결과 다리를 허용 했다.
다양 한 제한 설명된 프로토콜에서 고려 되어야 한다. KYNA의 내 인 성 생산을 자극을 직접 bioprecursor kynurenine 주변 쥐에 주입 했다. Kynurenine은 쉽게 혈액 뇌 장벽을 교차 하 고 다양 한 뇌 영역2에서 발생 하는 자극된 KP 신진 대사. 우리는 현재 말머리; 사이토 파생 된 KYNA에 상승에 초점 그러나, 그것은 3-hydroxykynurenine (3-홍콩) 및 quinolinic 산을 포함 한 KP의 신경 분 지의 대사 산물을 상승 하는 kynurenine의 조직의 주사를 고려 하는 것이 중요. 애타게 떨어져 3 홍콩 KYNA 고도 의해 발생에 비해에 인 한 효과, 방법론을 조정 한다. 또한, KP 대사 뇌11 동안에 perfuse 상승 동작에서 변경 중재는 특정 뇌 영역에 대 한 제한 된 통찰력을 제공 합니다.
여기에 설명 된 행동 실험을 설계할 때 컨텍스트 메모리 hippocampal 중재 참여 세부 사항에 설명 된 대로 기존 방법에 관하여 수동 회피 패러다임 최적화 우리. 메모리는 세 가지 주요 하위 구성: 인코딩, 통합, 및 검색. 메모리 통합 프로세스에 대 한 최적의 조건을 메모리 장기 저장19,20에 통합 되어 새로 인코딩된 경우 수 면 중 발생 합니다. 설치류에 학문 메모리 통합의 좁은 시간 창에 초점을 맞추고 있고 식별 메모리 가장 민감한 수 면 인수 후 지연 되 면, 우리는 kynurenine 및 KYNA이이 민감한 뇌의 포메이션을 상승 하기로 시간 창, 인수 및이 문서의 가설을 테스트 하는 통합에 영향을 미치는. 그러나 우리 않았다,, 현재 테스트 하지 경우 메모리의 검색 이전 표시21로 kynurenine 고도 의해 영향을 했다. 그것은 또한 설치류에 종사 하는 작업을 수행 하는 뇌 영역을 고려 하는 매우 중요 하다입니다. 이 연구를 위해 우리는 대부분 인식 변조 해 마의 역할에 관심이, 프로토콜 수정 급성 kynurenine에 의해 영향 될 표시 되었습니다 대체 행동 패러다임에서 동물 테스트에 도움이 될 수 있습니다. 도전, 두려움 컨디셔닝 및 메모리 작업2,7,,89,10일 등.
또한, 뇌 KYNA 높이 kynurenine의 조직의 주사 대신 고려 하는 대체 전략 관심 분야 또는 약리학으로 종합 효소 캣 II의 타겟된 금지에 KYNA의 직접적인 주입 포함 도구 또는 기계적 가설 테스트를 특정 뇌 영역에 분자 눕 접근. 이 방법 또한 측정 하는 기능 결과 독립적으로 영향을 미치는 잠재적으로 침략 적인 절차 소개, 하는 동안 최적의 제어 조건 디자인 실험에 중대 하다.
마지막으로, 수 면 뇌 파/EMG 프로토콜 설명 녹음 telemetric 보다는 오히려 곁에, 전기 잡음, 움직임, 유물과 테더 케이블을 뽑아가 동물에 상해의 위험을 제거 되 고의 이점이 있다. 실제 크기와 가벼운 무게 telemetric 장치, 및 그것의 배치의 intraperitoneally 포스트 외과 복구를 최적화 하기 위해 쥐에 자유와 자연 수 면-각 성 동작을 캡처하는 무선 녹음 수 보다는 피하 움직임의 범위입니다. 그러나, telemetric 시스템을 사용 하는 경우 중요 한 고려 사항은 동시 여러 채널에서 녹음을 제한 하는 기능입니다. 현재 패러다임 하나 뇌 파 채널 및 한 EMG 채널 쌍 고 rem 수 면, NREM, 그리고 웨이크 동작의 점수에 대 한 수 있습니다.
현재 설명 하는 방법의 행동 및 생 화 확 적인 분석 실험의 kynurenine 고도 기능적인 결과 명료 하에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 이러한 프로토콜 KP, 인식, 수 면, 이전 미개척된 동적 사이의 관계를 보여 줍니다. 여기에 제공 된 상세한 실험 방법을 활용 하 고 kynurenine 및 KYNA 동물에서 생물학 기능에 미치는 영향의 과학적 이해를 강화할 것 이다. 궁극적으로,이 분야에서 지속적인된 작업 정신 장애 및 수 면에서 장애를 싸우는 개인 결과 완화 시키기 위해 새로운 치료 접근 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
현재 학문 건강의 국가 학회 (R01 NS102209)와 클레어 E. 포브스 신뢰에서 기부금에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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