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Biochemistry

शारीरिक रूप से सक्रिय Thylakoids के अलगाव और ऊर्जा पर निर्भर प्रोटीन परिवहन परख में उनके उपयोग

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58393
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant Biology, University of California - Davis

Summary

हम वर्तमान प्रोटोकॉल chloroplast ट्विन arginine translocation (cpTat), स्रावी (cpSec1), और संकेत मान्यता कण (cpSRP) रास्ते के लिए शारीरिक रूप से सक्रिय thylakoids और प्रोटीन परिवहन परख के उच्च उपज अलगाव के लिए यहां मौजूद हैं ।

Abstract

Chloroplasts हरे पौधों कई आवश्यक चयापचय रास्ते बाहर ले जाने के लिए जिंमेदार में organelles हैं, सबसे विशेष रूप से प्रकाश संश्लेषण । chloroplasts के भीतर, thylakoid झिल्ली प्रणाली सभी संश्लेषक pigments घरों, प्रतिक्रिया केंद्र परिसरों, और इलेक्ट्रॉन वाहक के अधिकांश, और प्रकाश पर निर्भर एटीपी संश्लेषण के लिए जिंमेदार है । chloroplast प्रोटीन के ९०% से अधिक नाभिक में इनकोडिंग, cytosol में अनुवाद कर रहे हैं, और बाद में chloroplast में आयात किया । इसके अलावा प्रोटीन परिवहन में या thylakoid झिल्ली के पार चार translocation रास्ते में से एक का इस्तेमाल करता है । यहाँ, हम तीन ऊर्जा-निर्भर cpTat, cpSec1, और cpSRP-मध्यस्थता रास्ते के माध्यम से परिवहन परख के साथ-साथ मटर (Pisum सटिवुम), से परिवहन सक्षम thylakoids के अलगाव के लिए एक उच्च उपज विधि का वर्णन । इन तरीकों thylakoid प्रोटीन स्थानीयकरण, परिवहन ऊर्जावान, और जैविक झिल्ली भर में प्रोटीन translocation के तंत्र से संबंधित प्रयोगों को सक्षम ।

Introduction

लगभग सभी उचित chloroplast समारोह के लिए जिंमेदार proteinaceous मशीनरी के cytosol1से translocated होना चाहिए । chloroplast लिफाफे में, प्रोटीन सब्सट्रेट बाहरी झिल्ली (TOC) के translocon और भीतरी झिल्ली (टिक)2के translocon के माध्यम से आयात किया जाता है । इसके अलावा thylakoid झिल्ली और लुमेन के लिए लक्ष्यीकरण जुड़वां arginine translocation (cpTat)3के माध्यम से होता है, स्रावी (cpSec1)4, सिग्नल मान्यता कण (cpSRP)5, और सहज प्रविष्टि रास्ते6 . शारीरिक रूप से सक्रिय chloroplasts और thylakoid झिल्ली के उच्च उपज अलगाव के लिए एक विधि एक translocation घटना के ऊर्जावान और कैनेटीक्स को मापने के लिए आवश्यक है, प्रत्येक मार्ग में विविध परिवहन तंत्र को समझने के लिए, और एक स्थानीयकरण chloroplast के छह अलग डिब्बों में से किसी को ब्याज की विशेष प्रोटीन सब्सट्रेट ।

chloroplast से झिल्ली का अलगाव पर्यावरण कारकों पर बेहतर प्रायोगिक नियंत्रण प्रदान करता है (जैसे नमक और सब्सट्रेट सांद्रता के रूप में, एटीपी/GTP की उपस्थिति, और पीएच शर्तों) है कि परिवहन ऊर्जावान की माप को प्रभावित और कैनेटीक्स. इन विट्रो वातावरण में ही कारणों के लिए translocation के यंत्रवत विवरण की खोज करने के लिए उधार देता है । इसके अलावा, जबकि chloroplast प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर7,8में सुधार हुआ है, इन विट्रो परिवहन परख सूक्ष्म पर पुष्टि के लिए एक तेज विधि आधारित फ्लोरोसेंट परख प्रदान कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट टैग, संयंत्र परिवर्तन और/ यहां, हम chloroplast और मटर (Pisum सटिवुम) से thylakoid अलगाव के लिए प्रोटोकॉल मौजूद है, साथ ही साथ परिवहन परख ऊर्जा पर निर्भर thylakoid translocation रास्ते में से प्रत्येक के लिए अनुकूलित ।

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Protocol

1. प्रारंभिक सामग्री

  1. आसुत जल के ४०० मिलीलीटर में 3 घंटे के लिए मटर के लगभग ५५ ग्राम भिगोएं, और फिर एक प्लास्टिक ट्रे में बोना (३५ सेमी x 20 सेमी x 6 सेमी) मिट्टी में vermiculite की पतली परत के साथ कवर किया ।
  2. 9 से 15 दिनों के लिए 12/12 ज लाइट/डार्क (५० µ e/एम2एस) चक्र के तहत 20 डिग्री सेल्सियस पर मटर की ट्रे बढ़ाएँ ।
  3. एक पसंदीदा विधि के अनुसार प्रोटीन सब्सट्रेट तैयार करें ।
    नोट: हम तैयार किया है प्रोटीन सब्सट्रेट तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर, 1 सहित) इन इन विट्रो प्रतिलेखन शुद्ध plasmids से अनुवाद द्वारा पीछा किया गेहूं रोगाणु अर्क या खरगोश की उपस्थिति में reticulocyte lysates का उपयोग [3ज]-leucine या [३५S]-methionine, 2) इन विट्रो अनुवाद का उपयोग कर एक युग्मित प्रतिलेखन/इस तरह के ऊपर के रूप में radiolabeling के साथ, और 3) ई. कोलाईमें स्पष्ट प्रोटीन की शुद्धि से टीएनटी किट के रूप में अनुवाद किट । रेडियोधर्मी इन विट्रो अनुवाद उत्पादों आम तौर पर परिवहन प्रतिक्रियाओं में उपयोग करने से पहले ५० mM शीत अमीनो एसिड के साथ बुझती हैं । इन तरीकों में से प्रत्येक आम तौर पर प्रत्येक नए प्रोटीन सब्सट्रेट के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता है । इन विट्रो प्रणाली में एक युग्मित का एक उदाहरण के लिए, लिंग और जार्विस (२०१६)9देखें ।

2. Chloroplast अलगाव और ठहराव

नोट: thylakoids की तैयारी में पहला कदम बरकरार chloroplasts10का अलगाव है. तैयारी के दौरान सभी सामग्रियों को ठंडा रखा जाना चाहिए । chloroplasts के निलंबन धीरे से संभाला जाना चाहिए, इस कदम पर टूटना के रूप में गंभीर रूप से बाद में thylakoid उपज सीमा कर सकते हैं ।

  1. पहले से समाधान निंनलिखित तैयार करें ।
    1. 2x पीस बफर (2xGB): १०० मिमी K-HEPES पीएच ७.३, ६६० मिमी सोर्बिटोल, 2 मिमी MgCl2, 2 मिमी MnCl2, 4 मिमी EDTA, ०.२% BSA.
    2. 2x आयात बफर (2xIB): १०० मिमी k-Tricine या k-HEPES पीएच ८.०, ६६० मिमी सोर्बिटोल, 8 मिमी MgCl2.
      नोट: 3 मिमी से 10 मिमी से लेकर2 MgCl की सांद्रता चौकस मतभेदों के बिना इस्तेमाल किया गया है.
  2. Percoll के 15 मिलीलीटर और 2xGB के 15 मिलीलीटर में ३०,९०० g पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में ब्रेक बंद के साथ एक सतत घनत्व ढाल तैयार करते हैं ।
  3. 1xGB के ९५ मिलीलीटर में 9-15 दिन पुरानी मटर और homogenize के लगभग 25 ग्राम फसल । या तो तेज ब्लेड या एक Polytron के साथ एक ब्लेंडर सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है । इस मिश्रण को कीप में Miracloth के कम से 2 लेयर के माध्यम से फ़िल्टर करें ।
    नोट: स्टेम ऊतक की मात्रा सीमित आवश्यक नहीं है, लेकिन homogenization प्रक्रिया आसान बना सकते हैं, जिससे लंबे समय तक सम्मिश्रण के साथ हो सकता है कि chloroplast टूटना को कम करने.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक झूल बाल्टी रोटर में ३,००० जी में गोली, और धीरे 1xGB के 1 मिलीलीटर में resuspend । एक तूलिका सबसे कोमल resuspension तकनीक हो सकता है ।
  5. ध्यान से परत Percoll ढाल के शीर्ष पर हरी निलंबन और 10 मिनट के लिए एक झूल बाल्टी रोटर में ८,००० जी पर केंद्रापसारक बंद के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  6. ध्यान से कम हरी एक ताजा ट्यूब में बरकरार chloroplasts युक्त बैंड फसल । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक झूल बाल्टी रोटर में १,८०० जी पर बरामद बरकरार chloroplasts स्पिन, supernatant त्यागें और धीरे 1xIB में गोली resuspend । इस धोने कदम एक बार फिर दोहराएं, 1xIB के 30 मिलीलीटर में resuspend हर बार, 1xIB के 1 मिलीलीटर में अंतिम निलंबन के साथ ।
  7. क्लोरोफिल (Chl) सामग्री का अंदाजा लगाने के लिए, Whatman 1 फिल्टर पेपर के माध्यम से ८०% एसीटोन और फिल्टर के 5 मिलीलीटर के साथ पूरी तरह से resuspend chloroplasts के 10 µ एल मिश्रण (नाममात्र मोटाई १८० µm) । एक spectrophotometer में ७२० एनएम, ६६३ एनएम, और ६४५ एनएम में अवशोषक रिकॉर्ड और निंनलिखित11सूत्र का उपयोग कर Chl एकाग्रता की गणना:
    [Chl] mg/मब = [40.2 * (a६६३ – a७२०) + 101.4 * (a६४५ – a७२०)] * ०.१
  8. 1xIB के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल Chl समकक्ष के लिए chloroplasts समायोजित करें ।

3. Thylakoids का अलगाव

नोट: Thylakoids बरकरार chloroplasts के hypotonic lysis द्वारा तैयार किए जाते हैं. यह एक hypotonic बफर कमी सोर्बिटोल को chloroplasts उजागर द्वारा हासिल की है । पृथक thylakoids translocation मार्ग के किसी भी परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन stromal निकालने (एसई) भी इस तैयारी के दौरान अलग किया जाना चाहिए अगर या तो cpSec1 या cpSRP रास्ते जांच की जानी है ।

  1. समय से आगे की तैयारी निंनलिखित समाधान ।
    1. Hypotonic Lysis बफर: ५० मिमी k-Tricine या k-HEPES पीएच ८.०, 8 मिमी MgCl2.
    2. 2x क्रूड स्ट्रोमा बफर (एसई की एकाग्रता के लिए): १०० मिमी K-HEPES पीएच ८.०, ६६० मिमी सोर्बिटोल, 8 मिमी MgCl2.
    3. Laemmli नमूना बफर (एसडीएस के लिए-पृष्ठ, EDTA के साथ पूरक): १२५ मिमी Tris पीएच ६.८, 10% एसडीएस, 20% ग्लिसरॉल, ०.०५ मिलीग्राम/एमएल bromophenol ब्लू, 10% β-mercaptoethanol, 10 मिमी EDTA.
  2. एसई वसूली आवश्यक नहीं है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए एक झूल बाल्टी रोटर में १,००० जी में बरकरार chloroplasts केंद्रापसारक ।
    1. supernatant को छोड़ें और Hypotonic Lysis बफ़र में 1 मिलीग्राम/एमएल को पुनर्निलंबित करें । 10 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर गर्मी, सामयिक मिश्रण के साथ ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 8 मिनट के लिए बाल्टी रोटर झूल में ३,२०० जी पर केंद्रापसारक द्वारा thylakoids पुनर्प्राप्त करें । thylakoids दो बार धोने, lysis बफर के 1 से 2 मिलीलीटर हर बार के साथ resuspend । 1xIB के 1 मिलीलीटर के साथ resuspend और chloroplast आइसोलेशन प्रोटोकॉल में ऊपर के रूप में Chl को फिर से बढ़ाता है ।

4. Stromal निकालें वसूली और एकाग्रता

  1. यदि एसई वसूली आवश्यक है, बरकरार chloroplasts में विभाजित ६०० µ l aliquots में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और एक ट्यूब में १,००० g पर 6 मिनट के लिए झूल बाल्टी रोटर में 4 ° c.
    नोट: यह मात्रा सुविधाजनक है जब १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, जो अवशिष्ट झिल्ली के लिए अंतिम गोली की अशांति को रोकने में मदद करता है का उपयोग कर ।
    1. Hypotonic Lysis बफर और 10 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर गर्मी में 1 मिलीग्राम/एमएल Chl को resuspend, के रूप में कदम 3.2.1 में ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए बाल्टी रोटर झूल में ३,२०० x जी पर प्रत्येक ट्यूब केंद्रापसारक और 2x क्रूड स्ट्रोमा बफर की एक समान मात्रा के साथ एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए chloroplast lysis निंनलिखित हल्के हरे या पीले supernatant हस्तांतरण ।
    3. lysis बफर के 2 संस्करणों के साथ thylakoids धो (approximating ०.५ मिलीग्राम/एमएल) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए बाल्टी रोटर झूल में ३,२०० जी पर केंद्रापसारक द्वारा इकट्ठा । बर्फ पर 1xIB में 1 मिलीग्राम/एमएल Chl को रिसस्पेंड करें ।
    4. ४२,००० जी में एक निश्चित कोण रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अवशिष्ट झिल्ली को दूर करने के लिए कच्चे स्ट्रोमा केंद्रापसारक । बाहरी और भीतरी लिफाफा प्रोटीन के लिए Immunoblotting supernatant की पवित्रता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    5. छोटे पीले-हरे गोली परेशान बिना प्रत्येक ट्यूब से मात्रा का ९५% इकट्ठा । प्रत्येक ट्यूब से लिया गया वॉल्यूम नोट करें ।
    6. केंद्रित stromal निकालने (एसई) तैयार करने के लिए, पूल एकत्र supernatants और पांच ध्यान केंद्रित एक 4 मिलीलीटर 30 केडीए MWCO ध्यानी का उपयोग कर गुना ।
      नोट: एसई इस तरह से तैयार २.५ मिलीग्राम/एमएल Chl पर chloroplasts से व्युत्पंन स्ट्रोमा के बराबर है । यदि आवश्यक हो, एसई केंद्रित किया जा सकता है दस-गुना करने के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल Chl समकक्ष । एसई रंग और चिपचिपा में सुनहरा हो जाएगा । में लैब है लीजेंड आरटी झूलते बाल्टी रोटर के साथ, इस के बारे में 10 मिलीलीटर केंद्रित प्रति मिनट की आवश्यकता है ।

5. cpTat मार्ग के माध्यम से परिवहन

नोट: cpSec1 या cpSRP के विपरीत, cpTat मार्ग में घुलनशील घटकों या exogenously जोड़ा ऊर्जा स्रोतों की आवश्यकता नहीं है; केवल प्रकाश चालित प्रोटॉन मकसद बल आवश्यक है3. इसलिए, केवल पृथक thylakoids और सब्सट्रेट प्रोटीन परख के लिए आवश्यक हैं । ठेठ सब्सट्रेट 17 केडीए के मध्यवर्ती रूपों हैं ( चित्रा 1में देखा के रूप में) और 23 केडीए उपइकाईों ऑक्सीजन विकसित जटिल, iOE17 और iOE23, क्रमशः, लेकिन प्रणेता रूपों, prOE17 और prOE23, भी सफलतापूर्वक परिवहन किया जा सकता है. पूर्ववर्ती प्रपत्रों में संपूर्ण द्विपक्षीय N-टर्मिनल लक्ष्यीकरण अनुक्रम होता है, जबकि मध्यवर्ती प्रपत्रों में केवल thylakoid लक्ष्यीकरण अनुक्रम होता है.

  1. ०.३३ मिलीग्राम/एमएल Chl thylakoids, 1xIB में तैयार एक शेयर से 5 मिमी एटीपी के साथ cpTat परिवहन मिश्रण तैयार करें, और dithiothreitol में तैयार किए गए एक स्टॉक से 8 मिमी डीटीटी (1xIB), बर्फ पर । एटीपी अगर रोशनी के तहत आयोजित इस प्रतिक्रिया के लिए सख्ती से आवश्यक नहीं है ।
  2. परिवहन मिश्रण में मात्रा सब्सट्रेट प्रोटीन द्वारा 1:30 खंड शुरू करने से परिवहन आरंभ. यदि सब्सट्रेट प्रोटीन 1xIB में तैयार नहीं है, पहले 2xIB के साथ एक 1:1 कमजोर पड़ने तैयार है, तो परिवहन मिश्रण में पतला सब्सट्रेट की मात्रा से 1:30 मात्रा का उपयोग करें ।
    नोट: सब्सट्रेट की सांद्रता तैयारी विधि के आधार पर भिन्न होगा. आम तौर पर, इन विट्रो तैयारी में nanomolar के लिए micromolar मात्रा की अनुमति देगा, जबकि micromolar के लिए millimolar मात्रा में व्यक्त की अनुमति देगा । पता लगाने के तरीकों पर भी विचार किया जाना चाहिए, के रूप में autoradiography और fluorography immunoblotting से अधिक संवेदनशील हैं.
  3. ८०-१०० µ e/एम2एस के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए photosynthetically सक्रिय विकिरण के (बराबर) में निलंबन रोशन । यदि परिवहन कैनेटीक्स की आवश्यकता है, पूर्व equilibrate दोनों thylakoids और प्रतिक्रिया मिश्रण कमरे के तापमान के लिए और अप करने के लिए 30 मिनट के लिए रोशन ।
  4. बर्फ ठंड 1xIB के एक 8 गुना कमजोर पड़ने के साथ परिवहन प्रतिक्रिया बंद करो और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए microcentrifuge में ३,२०० जी पर केंद्रापसारक द्वारा thylakoids की वसूली ।
  5. अवशिष्ट सब्सट्रेट है कि नहीं पहुंचाया गया है निकालें, 1xIB के १२० µ एल में thylakoid गोली resuspend और thermolysin में 2 मिलीग्राम/एमएल CaCl और 10 मिमी 1xIB2 के 6 µ एल के अलावा द्वारा बाहरी प्रोटीन डाइजेस्ट ।
  6. ४० मिनट के लिए बर्फ पर रिएक्शन की प्रतिक्रिया गर्मी, और फिर 1xIB में तैयार 25 मिमी EDTA के साथ मात्रा दोहरीकरण से छेड़ने बुझाने ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में ३,२०० ग्राम में केंद्रापसारक द्वारा thylakoids पुनर्प्राप्त करें । धो 1xIB में 5 मिमी EDTA के १२० μL में thylakoids बरामद और एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में ३,२०० ग्राम में केंद्रापसारक । 10 mM EDTA के साथ पूरक Laemmli नमूना बफ़र की एक उपयुक्त मात्रा में पुनर्निलंबित । ४० µ एल का एक खंड आमतौर पर एक एसडीएस-पृष्ठ जेल पर सब्सट्रेट का पता लगाने के लिए पर्याप्त है और आवश्यक होने पर दोहराने जैल के लिए नमूना संरक्षित करता है ।
  9. 10 मिनट के लिए एक उबलते पानी में स्नान के नमूने प्लेस और एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ । Autoradiography, fluorography, या वेस्टर्न सोख्ता ऑफ नॉन-नेटिव या epitope-टैग किए गए प्रोटीन्स का इस्तेमाल उत्पात प्रोटीन का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है ।

6. cpSec1 मार्ग के माध्यम से परिवहन

नोट: cpSec1 translocon के माध्यम से परिवहन12,13cpSecA1 stromal प्रोटीन की आवश्यकता है, जो ई. कोलाईमें एक्सप्रेस के माध्यम से खरीद सकते हैं14,15 या ध्यान केंद्रित द्वारा बरामद स्ट्रोमा thylakoid अलगाव के दौरान । एक ठेठ सब्सट्रेट ऑक्सीजन विकसित जटिल (prOE33) के ३३ केडीए उपइकाई है, के रूप में चित्रा 2में देखा.

  1. ०.३३ मिलीग्राम/एमएल Chl thylakoids, ०.८३ मिलीग्राम/एमएल Chl समकक्ष एसई या १.५ μg रिकॉमबिनेंट cpSecA1, और बर्फ पर 5 मिमी एटीपी, और 10 मिनट के लिए मशीन के साथ cpSec1 परिवहन मिश्रण तैयार करें । एक ठेठ परिवहन प्रतिक्रिया यहां मिश्रण ७२ μL है, ६० μL से एसई अतिरिक्त के कारण ।
    1. यदि रिकॉमबिनेंट cpSecA1 के बजाय एसई का इस्तेमाल किया जाएगा, 2xIB की एक बराबर मात्रा के साथ शुद्ध cpSecA1 समायोजित, तो एक सुविधाजनक एकाग्रता को पतला करने के लिए परिवहन प्रतिक्रियाओं को जोड़ने के लिए (जैसे, ०.७५ µ जी/µ एल) ।
      नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, cpSecA1 ठंड के रूप में शुद्धि के बाद एक नियंत्रित, प्रशीतित कमरे में बर्फ पर संग्रहीत गतिविधि समाप्त हो जाती है ।
  2. परिवहन मिश्रण करने के लिए मात्रा सब्सट्रेट प्रोटीन द्वारा 1:10 मात्रा शुरू करने से परिवहन आरंभ. यदि सब्सट्रेट प्रोटीन 1xIB में तैयार नहीं है, 2xIB के साथ एक 1:1 कमजोर पड़ने तैयार है और परिवहन मिश्रण करने के लिए पतला प्रोटीन की मात्रा से 1:10 मात्रा में जोड़ें ।
  3. ८० के तहत 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मशीन-१०० µ e/ फिर, अब समय कैनेटीक्स या कुछ सब्सट्रेट्स के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  4. प्रकाश उपचार के बाद पतला 8-बर्फ ठंड 1xIB के साथ गुना और microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३२०० ग्राम में प्रतिक्रियाओं केंद्रापसारक ।
  5. thermolysin और EDTA के साथ बुझाने के लिए चरणों में ऊपर के रूप में ५.७ के माध्यम से ५.५ के साथ समझो ।
  6. microcentrifuge में 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,२०० जी में केंद्रापसारक और Laemmli नमूना बफर की एक उचित मात्रा में गोली resuspend 10 मिमी EDTA के साथ पूरक । एसडीएस पर लोड करने से पहले 10 मिनट के लिए उबलते पानी स्नान में प्लेस-पृष्ठ जेल ।

7. cpSRP मार्ग के माध्यम से सम्मिलन

नोट: cpSRP-मध्यस्थता एकीकरण प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन (LHCP) चित्रा 3 में देखा की आवश्यकता है cpSRP54, cpSRP43, और cpFtsY16. इन घटकों को cpSec1 ट्रांसपोर्ट प्रोटोकॉल के लिए वर्णित के रूप में केंद्रित stromal निकालने के माध्यम से ट्रांसपोर्ट प्रतिक्रिया करने के लिए प्रदान किए जाते हैं ।

  1. ०.३३ मिलीग्राम/एमएल Chl thylakoids, ०.८३ मिलीग्राम/एमएल Chl समकक्ष एसई, और 10 मिनट के लिए बर्फ और मशीन पर 5 मिमी एटीपी के साथ cpSRP परिवहन मिश्रण तैयार करें ।
  2. परिवहन मिश्रण करने के लिए मात्रा सब्सट्रेट प्रोटीन द्वारा 1:10 मात्रा शुरू करने से परिवहन आरंभ. यदि सब्सट्रेट प्रोटीन 1xIB में तैयार नहीं है, 2xIB के साथ एक 1:1 कमजोर पड़ने तैयार है और परिवहन मिश्रण करने के लिए पतला प्रोटीन की मात्रा से 1:10 मात्रा में जोड़ें ।
  3. ८० में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन की प्रतिक्रिया – १०० µ e/
  4. प्रकाश उपचार के बाद पतला 8-बर्फ ठंड 1xIB के साथ गुना और microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३,२०० ग्राम में प्रतिक्रियाओं केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और 1xIB के १२० µ एल में गोली resuspend ।
  5. ५.७ के माध्यम से ५.५ वर्गों में ऊपर के रूप में thermolysin के साथ समझो । Thermolysin पाचन सफल झिल्ली एकीकरण का आकलन करने के लिए यहाँ आवश्यक है । धो 1xIB में 5 मिमी EDTA के १२० μL में thylakoids बरामद और एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  6. 5 मिनट के लिए microcentrifuge में ३,२०० ग्राम में 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक और गोली फिर से स्थगित 2x Laemmli बफर के एक उचित मात्रा में 10 मिमी EDTA के साथ पूरक । एसडीएस द्वारा विश्लेषण करने से पहले 10 मिनट के लिए उबलते पानी स्नान में प्लेस-पृष्ठ ।
    नोट: परिपक्व LHCP (mLHCP) के एकीकरण एक को छेड़ने की रक्षा की गिरावट उत्पाद (mLHCP-डी) की उपस्थिति के द्वारा मूल्यांकन किया है लगभग 1.5-2 से कम है17uncleav mLHCP ।

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Representative Results

सब्सट्रेट सफलतापूर्वक पहुंचाया की राशि गेज करने के लिए, यह एक या अधिक "प्रतिशत इनपुट" गलियों में शामिल करने के लिए उपयोगी है । नीचे प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, thylakoids के बिना अंतिम परिवहन प्रतिक्रिया का 10% इस्तेमाल किया गया था । यह "प्रतिशत इनपुट" भी अग्रदूत सब्सट्रेट के आकार कल्पना करने में मदद करता है. प्रतिशत के साथ जो सब्सट्रेट के खिलाफ परिवहन सब्सट्रेट की तुलना करने के लिए और ऊपर या नीचे शुरू में तैयार प्रोटीन का उपयोग आवश्यक के रूप में बढ़ाया जा सकता है एक ज्ञात, परिभाषित राशि का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अतिरिक्त, यह बैंड ताना और धब्बा से बचने के लिए ०.७५ mm polyacrylamide जैल पर एक ही लेन में Chl समकक्ष के 4 से कम µ जी लोड करने के लिए सलाह दी जाती है । नीचे सभी सब्सट्रेट तैयार किए गए थे और radiolabeled का उपयोग कर इन विट्रो अनुवाद किट.

cpTat मार्ग के माध्यम से iOE17 का परिवहन

Figure 1
चित्रा 1 . iOE17through के परिवहन cpTat मार्ग । Fluorograph [3एच]-iOE17 परिवहन परख और गैर-परिवहन सब्सट्रेट के thermolysin उपचार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सबसे जैसे सब्सट्रेट के सफल cpTat परिवहन एन टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड3की दरार पर एक आकार परिवर्तन से पता लगाया जा सकता है । सब्सट्रेट में जहां कोई सट सिग्नल पेप्टाइड मौजूद है18,19, छेड़ने उपचार सब्सट्रेट है कि झिल्ली को पार प्रकट करने के लिए आवश्यक है, जिससे को छेड़ने के द्वारा पाचन के लिए दुर्गम बनने. चित्रा 1में, शुरू सब्सट्रेट और परिपक्व प्रसंस्कृत फार्म के बीच लगभग 2-3 केडीए के एक आकार परिवर्तन में iOE17 परिणामों के परिवहन. गैर-परिवहन सब्सट्रेट को छेड़ने के उपचार (लेन 4) के माध्यम से नीचा है ।

cpSec1 मार्ग के माध्यम से prOE33 का परिवहन

Figure 2
चित्रा 2 . cpSec1 मार्ग के माध्यम से prOE33 का परिवहन । Autoradiograph [३५S]-prOE33 परिवहन परख का उपयोग एसई, शुद्ध cpSecA1, या दोनों एक साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

cpSec1 मार्ग (चित्रा 2) के माध्यम से परिवहन परिपक्व सब्सट्रेट में एक आकार बदलाव के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है अगर सब्सट्रेट एक सट thylakoid लक्ष्यीकरण संकेत है, साथ ही उत्पात सब्सट्रेट20के संरक्षण की चिढ़ाना शामिल है ।

cpSRP मार्ग के माध्यम से prLHCP का एकीकरण

Figure 3
चित्रा 3 . cpSRP मार्ग के माध्यम से prLHCP का एकीकरण । Autoradiograph [३५S]-thylakoid झिल्ली में प्रवेश करने के बाद उत्पाद mLHCP-डी करने के लिए prLHCP और पाचन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

cpSRP मार्ग के माध्यम से thylakoid झिल्ली में prLHCP की प्रविष्टि thermolysin पाचन के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है । लगभग 1.5-2 केडीए का एक आकार परिवर्तन सफल झिल्ली प्रविष्टि का संकेत है क्योंकि झिल्ली पूरी प्रोटियोलिसिस15से सट परिपक्व प्रोटीन की रक्षा करती है । चित्रा 3में, को छेड़ने वाली संरक्षित उत्पाद mLHCP-डी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है ।

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Discussion

Chloroplast और Thylakoid अलगाव

अत्यधिक टूटना गरीब chloroplast अलगाव में परिणाम कर सकते है और इस प्रकार ढाल में जुदाई के बाद गरीब thylakoid उपज । यह सुनिश्चित करना है कि सभी सामग्री सम्मिश्रण से पहले जलमग्न है और पूरी तरह से homogenized तक 15 एस चक्र में स्पंदन के द्वारा धीरे से काटा ऊतक homogenize करने के लिए सबसे अच्छा है । यदि आवश्यक हो, प्रत्येक दौर में कम ऊतक के साथ सम्मिश्रण के कई छोटे दौर का उपयोग करें.

प्रशीतन सभी सामग्री है कि काटा ऊतक के साथ संपर्क में आने में मदद करता है अलग chloroplasts गतिविधि को बनाए रखने के लिए 2 घंटे तक । यह chloroplasts के रूप में अच्छी तरह से अलगाव के बाद अंधेरे में बर्फ पर रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यह अलग thylakoids से संपर्क बफ़र्स में मैग्नीशियम शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसा नहीं कर रही है, में उत्पादन और गंभीर रूप से21रोशनी पर प्रोटॉन मकसद बल की पीढ़ी को प्रभावित करता है । Thylakoids जब बर्फ पर रखा और अंधेरे में अलगाव के बाद 2 घंटे के लिए परिवहन प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया गया है ।

ऑप्टिमाइज़िंग ट्रांसपोर्ट प्रतिक्रियाओं

पृथक thylakoids तेजी से बसा है और प्रतिक्रियाओं के बीच असमान Chl समकक्ष में परिणाम कर सकते हैं । जैसे, यह अच्छी तरह से उपयोग करने के लिए पहले thylakoids मिश्रण महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जब नमूनों की एक बड़ी संख्या की स्थापना.

ताट मार्ग

जैसे मार्ग के माध्यम से परिवहन दक्षता Tha4 (टाटा) आंशिक रूप से झिल्ली22से निकाला जा सकता है के बाद से thylakoids के अत्यधिक धोने पर कम किया जा सकता है । ऐसे मामलों में, यह ट्रांसपोर्ट रिएक्शन से पहले thylakoid वॉश स्टेप्स को कम करने में मददगार होता है । इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक रोशनी का पता लगाने में सुधार कर सकते हैं, जहां सब्सट्रेट खराब ठेठ परिस्थितियों में पहुंचाया ।

cpSec1 मार्ग

जब cpSec1 मार्ग परख, केंद्रित एसई में cpSecA1 की राशि परिवहन का समर्थन करना चाहिए, लेकिन है कि परिवहन कमजोर हो सकता है । अलग thylakoids में कुशल परिवहन कुछ प्रोटीन के लिए शुद्ध cpSecA1 के अलावा से लाभ हो सकता है, हालांकि stromal chaperones एसई भी15परिवहन की क्षमता को बढ़ाने में मदद कर सकता है । इसके अलावा, cpSecA1 प्रोटीन की तैयारी परिवहन में उपयोग करने से पहले जमे हुए नहीं किया जाना चाहिए, के रूप में यह परिवहन गतिविधि कम कर देता है । इसी तरह, जमे हुए एसई हौसले से तैयार निकालने से कम प्रभावोत्पादक है । जैसे के परिवहन में, परिवहन मिश्रण में अब गर्मी की अवधि मुश्किल सब्सट्रेट के साथ मदद कर सकते हैं ।

cpSRP मार्ग

जबकि cpSRP परिवहन के पुनर्गठन व्यक्तिगत घटकों का उपयोग कर रहा है23प्रदर्शन किया गया है, यह cpSRP43, cpSRP54 की आपूर्ति सुविधाजनक है, और एसई के साथ cpFtsY । Thermolysin प्रतिरोध LHCP एकीकरण के लिए सबसे कड़े मानदंड है16, 17, लेकिन alkaline निष्कर्षण के रूप में अच्छी तरह से17प्रदर्शन किया जा सकता है । जबकि पुरोगामी अक्सर जमे हुए किया जा सकता है और पर संग्रहित-८० ° c कई परिवहन प्रतिक्रियाओं के लिए, prLHCP द्वारा तैयार इन विट्रो संश्लेषण ठंड के बिना संश्लेषण के तुरंत बाद परिवहन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

एक उपंयास है सब्सट्रेट लक्ष्यीकरण मार्ग के लक्षण वर्णन

मामलों में जहां translocation मार्ग एक उपंयास सब्सट्रेट द्वारा लिया अज्ञात है, यह पहले से silico में संभावित संकेत पेप्टाइड्स की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है पूर्ववर्ती या मध्यवर्ती रूप के एमिनो एसिड अनुक्रम का उपयोग कर. cpTat मार्ग आमतौर पर संकेत पेप्टाइड में एक विशिष्ट जुड़वां arginine आम सहमति आकृति की आवश्यकता है और3सममूल्य के तहत सफल परिवहन के लिए कोई एटीपी । जैसे मार्ग के विपरीत, cpSec1 मार्ग एटीपी और cpSecA1 प्रोटीन की आवश्यकता है । इन घटकों की कमी शर्तों में विफल परिवहन cpSec1 मार्ग20पता चलता है । cpSRP मार्ग संकेत मांयता कण एसई में पाया की आवश्यकता है । असफल परिवहन शुद्ध cpSecA1 और एटीपी का उपयोग कर, लेकिन संकेत पेप्टाइड में जुड़वां arginine आम सहमति आकृति की कमी, पता चलता है cpSRP मार्ग23.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह पांडुलिपि रसायन विज्ञान, भूविज्ञान, और जैव विज्ञान, ४०८ अनुदान DE-SC0017035 के माध्यम से अमेरिका के ऊर्जा विभाग के बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय के विभाजन के द्वारा वित्त पोषण के साथ तैयार किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pisum sativum seeds Seedway LLC, Hall, NY 8686 - Little Marvel
Miracloth Calbiochem, Gibbstown, NJ 475855-1
80% Acetone Sigma, Saint Louis, MO 67-64-1
Blender with sharpened blades Waring Commercial BB155S
Polytron 10-35 Fischer Sci 13-874-617
Percoll Sigma, Saint Louis, MO GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor Beckman-Coulter 8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor Sorvall 8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB Sigma, Saint Louis, MO 12/3/83 Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIB Sigma, Saint Louis, MO 74804-12-9 Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) Sigma, Saint Louis, MO 9073-78-3 Can be frozen in aliquots for future use
HEPES Sigma, Saint Louis, MO H3375
K-Tricine Sigma, Saint Louis, MO T0377
Sorbitol Sigma, Saint Louis, MO 50-70-4
Magnesium Chloride Sigma, Saint Louis, MO 7791-18-6
Manganese Chloride Sigma, Saint Louis, MO 13446-34-9
EDTA Sigma, Saint Louis, MO 60-00-4
BSA Sigma, Saint Louis, MO 9048-46-8
Tris Sigma, Saint Louis, MO 77-86-1
SDS Sigma, Saint Louis, MO 151-21-3
Glycerol Sigma, Saint Louis, MO 56-81-5
Bromophenol Blue Sigma, Saint Louis, MO 115-39-9
B-Mercaptoethanol Sigma, Saint Louis, MO 60-24-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इंजीनियरिंग अंक १३९ प्रोटीन परिवहन प्रोटीन लक्ष्यीकरण ट्विन arginine translocon (cpTat) स्रावी मार्ग (cpSec1) सिग्नल मान्यता कण (cpSRP) thylakoid अलगाव
शारीरिक रूप से सक्रिय Thylakoids के अलगाव और ऊर्जा पर निर्भर प्रोटीन परिवहन परख में उनके उपयोग
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Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L.,… More

Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays. J. Vis. Exp. (139), e58393, doi:10.3791/58393 (2018).

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