Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR

Published: November 10, 2018 doi: 10.3791/58596
Automatic Translation
1, 2, 2
1Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty, University of Bern, 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart University

Summary

Denne protokol diagnoser Tilapia søen Virus (TiLV) i tilapia væv ved hjælp af RT-PCR metoder. Den hel metode er beskrevet af væv dissektion til total RNA udvinding, efterfulgt af cDNA syntese og påvisning af TiLV af enten konventionel PCR eller kvantitativ PCR ved hjælp af dsDNA bindende en fluorescerende bindende farvestof.

Abstract

Formålet med denne metode er at lette hurtig, følsom og specifik påvisning af Tilapia søen Virus (TiLV) i tilapia væv. Denne protokol kan bruges som en del af programmer, overvågning, biosikkerhedsforanstaltninger og i TiLV grundlæggende forskningslaboratorier. Guldstandarden af virus diagnostik involverer typisk virusisolation efterfulgt af supplerende teknikker som reverse-transskription polymerase kæde reaktion (RT-PCR) for yderligere kontrol. Det kan være besværligt, tidskrævende og kræver typisk vævsprøver tungt inficeret med virus. Brugen af RT-kvantitative (q) PCR i påvisning af virus er fordelagtig på grund af dens kvantitative natur, høj følsomhed, specificitet, skalerbarhed og dens hurtig tid til at føre. Her, baseret den hel metode af PCR tilgange til TiLV opdagelse er beskrevet fra tilapia orgel skæring, samlede ribonukleinsyre (RNA) udvinding ved hjælp af en guanidium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform løsning, RNA kvantificering, efterfulgt af en to-trins PCR protokollen indebærer, supplerende deoxyribonukleinsyre (cDNA) syntese og påvisning af TiLV af enten konventionel PCR eller kvantitative identifikation via qPCR bruger SYBR green jeg farve. Konventionelle PCR kræver post-PCR skridt og vil blot informere om tilstedeværelsen af virus. Den sidstnævnte tilgang vil gøre det muligt for absolut kvantificering af TiLV ned til så lidt som 2 eksemplarer og er således særdeles nyttigt for TiLV diagnose i sub kliniske tilfælde. En detaljeret beskrivelse af de to PCR tilgange, repræsentative resultater fra to laboratorier og en grundig diskussion af de kritiske parametre for begge har været medtaget for at sikre, at forskere og bilinspektionsteknikere finde deres mest egnede og relevante metode til TiLV påvisning.

Introduction

Globale indbygger fisk levering nået en ny rekord på 20 kg i 2014 og det var på grund af kraftig vækst i akvakulturen. Akvakultur er fortsat en af de hurtigst voksende dyrefoder producerende sektorer på verdensplan og er det eneste animalske fødevareproduktion sektor, der vokser hurtigere end den menneskelige befolkning1. Tilapiine cichilds omfatter den næstvigtigste ferskvandsfisk opdrættet på verdensplan med en samlet global produktion af 6.4 millioner tons (MT) og en anslået værdi om 9,8 milliarder amerikanske dollars i 20152. De ti bedste producenter af tilapia er Kina (1,78 MT), Indonesien (1,12 MT) og Egypten (0,88 MT), efterfulgt af Bangladesh, Vietnam, Filippinerne, Brasilien, Thailand, Colombia og Uganda2. Det forventes, at globale tilapia produktion vil være omkring 7,3 MT af 20303. Tilapia er blevet en vigtig global fødekilde, ikke blot fordi de er en billig kilde til protein4 men også fordi de er nemme at opdrætte i kapacitet under en bred vifte af vand og klima forhold5,6. Bare et par årtier siden, mente man at der var få kommerciel betydning sygdomme truer tilapia landbrug, men dette er ikke længere sandt. En ny viral sygdom kaldet tilapia søen virus sygdom (TiLVD) er den første nogensinde kritiske sygdomsepidemi fundet i tilapia og hele branchen er i fare. Denne sygdom har alvorlige socioøkonomiske konsekvenser og er en direkte trussel om fødevaresikkerhed for millioner af mennesker i Afrika7, Asien og Sydamerika. I starten af 2018 rapporterede Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE), at den ætiologiske agent for denne sygdom, TiLV, havde konstateret officielt, på tre kontinenter, der dækker otte lande8 , og da dette patogen oplysningskort var opdateret der har været flere rapporter om TiLV i Tanzania, Uganda9, Indonesien10, Taiwan11 og Peru12. TiLV er en roman enkeltstrenget RNA-virus beskrevet for at være en orthomyxo-lignende virus, fordi det indeholder en bred vifte af egenskaber der minder om andre orthomyoxoviruses såsom Influenza eller infektiøs lakseanæmi virus (ISAV)13. Det blev først identificeret i kølvandet på store tab af af vilde og opdrættede tilapia i søen Galilæa, Israel14. Derefter omhandlet lignende sygdomsudbrud, som sommeren mortalitet og én måned dødelighed syndrom tilknyttet TiLV infektion blev rapporteret i Nilen tilapia (Oreochromis niloticus) i Egypten15 og Nilen og red hybride tilapia (Oreochromis spp.) i Thailand16, henholdsvis. Påvisning af akvatiske dyr vira er historisk set udført af vækst og isolering af virus i cellekultur. Forskellige cellelinjer er blevet testet for formering og dyrkning af TiLV herunder, E-11 celler stammer fra snakehead fisk (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB og TmB stammer fra Oreochromis mossambicus18, og OnlB og OnlL stammer fra Nilen tilapia (O. niloticus)19. Mens virus kultur har den fordel, at det giver materiale til yderligere forsøg, har det den ulempe, at det kræver mindst 4-7 dage til at observere dannelsen af cytopatisk effekt (CPE) og afgørende, forskellige piscine vira, der er mere egnet til kopiere kan overføres og producerer lignende CPE.

I de seneste årtier, har der været en bevægelse væk fra traditionel, ofte tidskrævende diagnostiske metoder såsom cellekultur, serologi og antigen afsløring og udskiftning med hurtigere og mere følsomme nukleinsyre baseret detektion tests20, 21. Det fremgår klart af det faktum, at mange qPCR assays er blevet udviklet som vigtige diagnostiske metoder for en lang række virale sygdomme hos vanddyr, som for ISAV22,23, egtvedsyge virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 laksefisk alphavirus28, fisk iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, og Lymphocystis disease virus (LCDV)31 . Robuste metoder til diagnosticering og patogen overvågning er tvingende nødvendigt at mindske spredningen af TiLV. Sådanne metoder bør give mulighed for tidlig påvisning af infektion før kliniske symptomer udvikler og påvisning af lav virus belastninger. Til dato har forskellige PCR-protokoller, herunder RT-PCR14,32, er indlejrede RT-PCR18, semi-indlejrede RT-PCR33og RT-qPCR32,34 blevet udviklet til påvisning af TiLV i fiskevæv. En sammenligning af RT-qPCR og virus isolation i modtagelige cellelinjer til TiLV påvisning afslørede, at RT-qPCR var 1.000 gange mere følsom end virus isolation32. Selv om hver offentliggjorte PCR-protokol har rapporteret forskellige følsomheder til påvisning af TiLV, er de fleste assays meget følsomme med påvisningsgrænserne for viral kopier på 7,5 Kopier33, 7 eksemplarer18 eller 2 kopier32 per reaktion.

Formålet med denne metoder artikel er at forklare i detaljer, hvordan man udfører TiLV påvisning assays, begyndende med tilapia væv samling, at total RNA udvinding, cDNA syntese og derefter TiLV specifikke PCR baseret assays. Specifikt, er omfattende protokoller af både konventionelle RT-PCR, og også SYBR green-baserede RT-qPCR blevet beskrevet til at appellere til en bred vifte af forskere med det formål at opdage TiLV. Førstnævnte er mindre følsomme, men er typisk en billigere mulighed for detektion. Sidstnævnte kræver mere omfattende infrastruktur såsom en kvantitativ PCR-maskine og dyrere reagenser, men det har fordelene ved at være kvantitative, hurtig og meget følsomme, hvilket betyder, at det kan anvendes til påvisning af TiLV i sub klinisk inficerede fisk. RT-PCR og RT-qPCR protokoller blev udført på to forskellige laboratorier med adskilte geografiske isolater af TiLV og inkluderet resultater højdepunkt følsomheden og reproducerbarhed af assays beskrevet her.

Protocol

Brug af dyr-protokollen for denne undersøgelse blev godkendt af det Kasetsart Universitet dyr etiske udvalg under tilladelse nummer ACKU 59-VET-016.

Bemærk: Der henvises til Tabel af materialer til udvidede oplysninger om reagenser og udstyr foreslået til denne protokol.

1. Vævscentre prøvetagning

  1. Aflive fisk ved hjælp af en overdosis af Fed olie (mængden afhænger af størrelsen af fisk og koncentration af produkter, normalt mere end 3 mL/L). Fordybe en fjerdedel af pincet og mayo saksen til 95% (v/v) ethanol efterfulgt af brændende udstyr med en alkohol-brænder til at sterilisere udstyr.
    Bemærk: Tricaine methanesulfonate (MS-222) kan bruges i stedet for fed olie.
  2. Find leveren og afskåret et lille stykke (ca 20-100 mg) eller indsamle 200 µL af slim ved hjælp af dækslet glas eller kirurgiske kniv til at fjerne slim fra forreste til bageste af tilapia fisk og placere prøverne i et 1,5 mL microcentrifuge rør.
  3. Proces prøver straks, opbevares i en RNA stabiliserende løsning eller flytte dem til-80 ° C indtil videre anvendelse.
    Bemærk: Den største opgave i at arbejde med RNA forbereder intakt RNA molekyler og holde dem ubeskadigede hele enhver efterfølgende håndteringer. RNA rygraden er medfødt mere følsomme over for skade end DNA. Udvinding og isolation af total RNA fra væv celler kræver omhyggelig laboratorium teknik; tage alle bestemmelser for at forhindre, at RNase forurening ved at bære handsker, ved hjælp af RNase gratis vand, reagenser, udstyr, plast ware, glasvarer, arbejdsplads og ved hjælp af filter tips for pipettering.

2. Guanidium kaliumthiocyanat - Phenol - Chloroform udvinding af RNA

  1. Der tilsættes 1 mL af monofasiske løsning indeholdende phenol og guanidin isothiocyanat ind i et rør, der indeholder vævsprøve fra punkt 1.
    Advarsel: Denne løsning er meget giftigt og skal håndteres med omhu i en laminar flow hætte med beskyttende udstyr og ved at bære de rette beskyttende briller, tøj og sikkerhed handsker.
  2. Grind vævsprøve ved hjælp af en væv pistil homogeniseringsapparat indtil homogen.
    Bemærk: Prøver kan også være homogeniseret ved hjælp af en magt homogeniseringsapparat kombineret med keramiske perler. Sikre, at vævsprøve helt homogeniseret, før du fortsætter til næste trin eller stoppe protokollen her og gemme de fuldstændigt homogeniserede prøver på-80 ° C indtil videre anvendelse.
  3. Tilføje 200 µL chloroform til faseadskillelse.
    FORSIGTIGHED Chloroform er en potentiel narkotiske og er ekstremt farlige. Det skal håndteres med omhu i en laminar flow hætte med beskyttelsesudstyr og iført de rigtige beskyttelseshandsker briller, tøj og sikkerhed. Som et mindre giftigt alternativ, 1-Bromo-3-chloropropane kan også bruges.
    NOTE: Skalaen diskenhederne op eller ned hvor det er relevant. For eksempel, hvis kun 500 µL af monofasiske løsning indeholdende phenol og guanidin isothiocyanat blev brugt, så kun tilføje 100 µL chloroform på dette trin.
    1. Bland prøver godt ved inversion for 15 s.
    2. Inkuber prøver i 3 min. ved stuetemperatur (RT).
  4. Der centrifugeres i 15 min. ved 12.000 × g og 4 ° C.
    Bemærk: Der skal være en klar adskillelse i en lavere organiske fase, en hvid interphase og en øvre vandig fase indeholder RNA. Denne top fase er normalt farveløs, men afhængigt af den type og mængde af homogeniseret væv, kan det have en lys pink udseende.
  5. Overføre den øverste vandige lag (ca. 500 µL) til en frisk microcentrifuge tube uden at forstyrre interfasen.
    Bemærk: forsøg ikke at overføre den hele vandfasen, efterlade en lille mængde for at forhindre enhver mulig kontaminering af RNA indeholdende vandig fase med den økologiske eller interfasen.
  6. Tilføj 1 bind af 100% isopropanol at udfælde RNA.
    1. Valgfrit, hvis meget små mængder af væv blev brugt, derefter tilføje 1 µL (5-10 µg) af RNase-fri glykogen til hver prøve at fremme effektiv RNA nedbør. Dette vil støtte identifikationen af RNA pellet taktfast 2.8.
      Bemærk: Glykogen fungerer som bærer af RNA og vil forhindre små mængder af RNA klistrer til siden af røret.
    2. Mix rør godt ved inversion flere gange.
    3. Opbevare prøver for 2 h til overnatning på-20 ° C.
  7. Centrifuge prøver for 15 min på 12.000 x g og 4 ° C.
  8. Supernatanten være omhyggelig med ikke at løsne RNA pellet i bunden af microcentrifuge rør.
  9. Der tilsættes 1 mL af 75% ethanol (v/v) og blandes RNA prøver ved at vende røret flere gange.
  10. Der centrifugeres i 15 min på 10.000 x g og 4 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan blive stoppet her og prøver bestående af RNA pellet i 75% ethanol kan opbevares ved-20 ° C indtil videre anvendelse.
  11. Supernatanten at være vagtsom ikke at løsne RNA pellet i bunden af microcentrifuge rør.
    1. Valgfrit, Gentag trin 2,9-2.11 med 70% ethanol (v/v). Grundigt vaske RNA pellet vil minimere enhver salt eller forurenende fremførsel, der kan forstyrre bliver følsomme downstream anvendelser.
  12. Tegner ud den resterende ethanol ved hjælp af en pipette og derefter lufttørre RNA pellet ved stuetemperatur i længere end 5-10 min.
    Bemærk: over tørret pellets vil være vanskeligt at genopslæmmes.
  13. Tilføj 30-60 µL af RNase-fri vand, pre opvarmes til 55-60 ° C til solubilize RNA pellet.
  14. Placer RNA på is til umiddelbar anvendelse eller opbevares ved-80 ° C til senere brug.

3. kvantificere RNA koncentration ved hjælp af en mikro-volumen Spektrofotometer

  1. Skift indstillingerne for spektrofotometrets til RNA.
  2. Brug 1-2 µL af RNase-fri vand som en tomme.
  3. Brug 1-2 µL af hver prøve, RNA til at vurdere RNA mængden.
  4. Optage aflæsninger på 230 nm, 260 nm og 280 nm for hver prøve.
  5. Fortynd RNA til 200 ng/µL ved hjælp af RNase-fri vand.

4. Sammenfatning af supplerende DNA (cDNA) ved hjælp af total RNA

  1. Bland 1 µg af total RNA fra protokol 2, 2 µM oligo (dT), 0,5 mM dNTP'er blanding og bringe det endelige rumfang på 10 µL med nukleasen-gratis vand. For dette, forberede en RT-master-mix afhængig af antallet af prøver og kontroller skal testes.
    Bemærk: Kontrollen er et minus-reverse transkriptase prøven (-RT) hvori RT enzym er erstattet med nukleasen-gratis vand (Se trin 4.3) og en ingen template control (NTC) hvori nukleasen-gratis vand føjes til master-mix i stedet for RNA skabelon.
    1. Bland prøverne godt af pipettering efterfulgt af en kort centrifugering.
  2. Inkuber prøver på 65 ° C i 5 min. efterfulgt af en 2 min inkubation på is.
    1. Kort centrifugeres prøver for at samle alle væske i bunden af rørene.
  3. Tilsæt 1 x reverse transkriptase buffer, 100 U reverse transkriptase og bring den endelige mængden af hver prøve 20 µL bruger nukleasen-gratis vand.
    1. Bland prøverne godt af pipettering efterfulgt af en kort centrifugering.
  4. Inkuber prøver på 42 ° C i 60 min. efterfulgt af 85 ° C i 5 min.
  5. Fortyndes den syntetiserede cDNA til en ønskede koncentration af tilføjer en passende mængde nukleasen-gratis vand og Placer cDNA på is til øjeblikkelig brug eller Opbevar den ved-20 ° C til senere brug.

5. TiLV konventionelle PCR

  1. Bruge cDNA, prøver og kontrol, genereret i protokollen afsnit 4 som skabeloner for en PCR reaktion ved hjælp af nogen af de etablerede primer par beskrevet i tabel 1, sammen med en DNA polymerase valg.
    Bemærk: En ekstra no-template control (NTC) bør medtages her ved at erstatte cDNA for nukleasen-frit vand i PCR reaktionen. En positiv kontrol, hvis tilgængelige, bør også medtages bestående af tidligere verificerede TiLV positive prøver eller passende TiLV cDNA fragment klonet i til et plasmid.
  2. Forberede en PCR master mix ifølge retningslinjerne fra DNA polymerase system i brug og antallet af prøver og kontrol til at blive testet. Denne blanding bør omfatte den fremskudte primer, reverse primer, dNTP'er, MgCl2 og den valgte DNA polymerase, sammen med sin buffer.
  3. Ifølge retningslinjerne for den valgte DNA polymerase, kombinere den udpegede volumen af master-mix med foreslåede mængden af cDNA prøver og kontrolprøver.
    Bemærk: Forbereder en 0,5 x reaktion overskydende er ofte gavnligt da nogle af master-mix er tabt under pipettering.
  4. Udføre PCR cykling betingelserne efter retningslinjerne for udnyttede DNA polymerase system og ved hjælp af en passende udgloedning temperatur for primere i brug (tabel 1). Normalt, et sådant program vil indebære en indledende denaturering ved 95 ° C i 2-5 min, efterfulgt af 30-40 cyklusser af denaturering ved 95 ° C til 30 s, udglødning ved den anbefalede temperatur for 30 s og brudforlængelse ved 72 ° C i 30 s, efterfulgt af en sidste brudforlængelse ved 72 ° C i 5-10 min.
  5. Indlæse 5-15 µL af hver PCR reaktion og en passende DNA ladder i brønde i en 1-2%-agarosegel, afhængigt af den forventede PCR produktstørrelse. Adskille amplificerede DNA ved gelelektroforese og plette gel af ethidiumbromid (EthBr) til at lette visualisering af DNA bands af den forventede størrelse (tabel 1) i en gel dokumentation maskine ved hjælp af UV-lys.
    Forsigtig: EtBr er giftige; Det skal håndteres med omhu ved at bære korrekt beskyttelsestøj og beskyttelseshandsker.
Target TiLV genom segment Fremad primer
5' - 3'		 Omvendt primer
5' - 3'		 PCR produktstørrelse (bp) Tm
° C		 Oprindelige henvisning
1 CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT 1641 50 Surachetpong et al., 2017
1 CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG 1000 62 Mugimba et al., 2018
2 ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT TTACCATATATATAGTGAAGGC 1445 45 Surachetpong et al., 2017
2 GTCCAGGGCGGTATGTATTG CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG 834 62 Mugimba et al., 2018
3 GTTGGGCACAAGGCATCCTA TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT 250 56 Eyngor et al., 2014
3 TATGCAGTACTTTCCCTGCC TTGCTCTGAGCAAGAGTACC 491 57 Eyngor et al., 2014
3 ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT 1352 50 Surachetpong et al., 2017
3 GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG GAGCTAAGGGAACGGCTATTG 834 62 Mugimba et al., 2018
4 AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG ACCGTCCTGTTTCTGAATGG 358 60 Nicholson et al., 2017
4 CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT 1250 50 Surachetpong et al., 2017
4 GCCCAATGGTTCCCATATCT GCCCAATGGTTCCCATATCT 524 62 Mugimba et al., 2018
5 CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG 1087 57 Surachetpong et al., 2017
5 CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC CGTTCTGCACTGGGTTACA 696 62 Mugimba et al., 2018
6 CCAAATTTTACCTCTCGCAT TCAAGCACTTAAAACTGTACC 1027 45 Surachetpong et al., 2017
6 CCCACACGACAGGACATATAG GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA 948 62 Mugimba et al., 2018
7 CTCTCTTTGCATTGCATACCGT GACCAATTATCCCTGCTTTCA 704 57 Surachetpong et al., 2017
7 TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC TTCCATCGACTGCTCCTAGA 486 62 Mugimba et al., 2018
8 ACCTCATCTACACTAACATTTCCA TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT 637 50 Surachetpong et al., 2017
8 CTTAAGGGCCATCCTGTCATC TGGCTCAAATCCCAACACTAA 476 62 Mugimba et al., 2018
9 TTGGTGATGTCACGATGGATA AGTTCTATCGCCAGCCATGT 351 60 Nicholson et al., 2017
9 ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA 530 50 Surachetpong et al., 2017
9 GATATCCTCCACATGACCCTTC GTACGTCACTTTGTGCCATTAC 261 62 Mugimba et al., 2018
10 AACCCTACTAACACCAAATATAGCT CTTTCCCTCTGACACCCTGT 450 50 Surachetpong et al., 2017
10 TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT 276 62 Mugimba et al., 2018

Bord 1. Offentliggjorte primer par til forstærkning af TiLV cDNA ved hjælp af slutpunkt PCR. Primer sæt vises i fed skrift blev brugt til at generere de repræsentative resultater vist i figur 3A og 3B.

6. TiLV kvantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)

  1. Ved hjælp af et plasmid som indeholder de relevante TiLV genomisk segment 3 cDNA som en standard, som pTiLV32, forberede en duplikeret eller triplicated 10-fold seriel fortynding serie.
  2. Forberede en qPCR master-mix til alle prøver, standarder og kontroller, at tage i betragtning, at reaktionerne, der skal udføres i duplikere eller tredobbelt udnytte 0,4 µL nukleasen-gratis vand, 0,3 µL af fremad primer, 0,3 µL af reverse primer og 5 µL af 2 x SYBR Green DNA polymerase master mix pr. reaktion.
    1. Bruge primere i en koncentration på 10 µM, og oplysningerne om primer og den standard pTiLV som følger:
      Videresende primer: TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3')
      Vende primer: TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3')
      Standard pTiLV:10 pg/µL
      Bemærk: Hvis det samlede antal prøver og kontroller er 10 og vil blive udført i tre, dette svarer til en qPCR master-mix bestående af 12 µL nukleasen-gratis vand, 9 µL fremad primer, 9 µL omvendt primer og 150 µL af SYBR Green DNA polymerase master-mix. Kommercielt købt 2 x universal SYBR Green DNA indeholder polymerase master-blander alle de nødvendige komponenter til qPCR reaktion, nemlig SYBR Green jeg farve, hot start Taq DNA polymerase, dNTP'er, MgCl2 og passive reference farvestoffer. Beskytte SYBR Green master mix fra lys.
  3. Undvære 6 µL af qPCR master-mix i qPCR strip rør eller en 96 godt plade kompatibel med qPCR maskinen i brug.
  4. Tilføj 4 µL cDNA skabelon, kontrolelementer eller seriefremstillede fortyndet TiLV standarder i rør eller brønde af 96 godt plade.
  5. Luk qPCR rør eller forsegle 96 godt pladen med en kompatibel plade cover for qPCR maskinen i brug
    1. Forsigtigt svirp qPCR rør for at blande løsning og spin-ned qPCR rør eller 96 godt plade ved hjælp af en centrifuge for at samle alle væske i bunden af fartøjerne.
  6. Sted rør eller pladen ind i real-time termisk cycler.
    1. Programmere qPCR thermocycler til at udføre en indledende denaturering ved 95 ° C i 3 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 10 s og 60 ° C i 30 s for primer udglødning og strækforlængelse, slutter med en smeltende kurve trin 65 ° c til 95 ° C med en tilvækst på 0,5 ° C / 5 s.
    2. Vælg SYBR som en fluorophore farve, så vælg ukendt som en prøvetypen og indsætte et navn i boksen en prøve.
    3. Åbn låget af RT-qPCR maskine og placere qPCR strip i de tildelte brønde, så luk låget.
  7. Udføre RT-qPCR assay med de valgte betingelser. Maskinen begynder at køre efter låget har nået den ønskede temperatur. Indsamle fluorescens af hver prøve efter hver udvidelse skridt til at overvåge status for reaktionen.
    Bemærk: QPCR maskine og tilhørende software vil automatisk beregne alle parametre for analysen og vise forstærkning kurver i real-time, mens standardkurven og smeltende kurve vil blive genereret i slutningen af qPCR cyklus.
  8. Udføre dataanalyse og erhvervelse ved først at sikre, at smeltningen kurver for hver prøve og standard har en ensartet peak på den forventede temperatur for amplikonen.
    1. Evaluere forstærkning kurver af prøver og standarder og sæt tærskel i en region var de forstærkning af cDNAs er den samme i alle prøver. Dette er normalt udføres automatisk af software men skal kontrolleres omhyggeligt.
    2. Beregne antallet af TiLV kopier ved hjælp af standardkurven.

Representative Results

Efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 1, døende red hybride tilapia viser kliniske tegn på TiLV infektion (figur 1A) blev aflivet af badning i en høj koncentration af Fed olie, der fungerer som et bedøvelsesmiddel. Rapporterede kliniske symptomer er variabel, men de almindelige symptomer synes at være sløvhed, hud erosion og misfarvning, exophthalmia, fritliggende skalaer, åbne sår/læsion og unormal adfærd15,16,33, 35,36, nogle af disse kan tydeligt ses i figur 1A. Bugvæggen er blevet fjernet for at indsamle indre organer som leveren, milten eller hoved nyre (figur 1B). Slim prøver blev også indsamlet i denne fase af forsigtigt skrabe huden fra de forreste til bageste af fisken med en cover glas eller kirurgiske kniv37.

Figure 1
Figur 1 . Tilapia dissektion og prøve samling. A. TiLV-inficerede red hybride tilapia med hud leisons, rødme omkring munden og laag, hud erosion og kornea. B. Sectioned red hybride tilapia tillade til indsamling af væv fra leveren (ved blå pil), milt eller hoved nyre organer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Derefter blev fulgt op af protokollen, beskrevet i afsnit 2 til Guanidium kaliumthiocyanat-Phenol-Chloroform ekstraktion af total RNA og RNA kvantificering som skitseret i afsnit 3 blev udført for at vurdere prøve renhed ved beregning af renhed nøgletal og undersøgelse af spektrale profiler (figur 2). Figur 2A viser et repræsentativt resultat fra en vellykket total RNA ekstraktionsmetode, mens figur 2B repræsenterer en dårlig RNA forberedelse. Nukleinsyrer har absorbans maxima på 260 mens proteiner har deres på 280 nm. Forholdet mellem målinger på 260 nm og 280 nm angive renheden af hver prøve og nøgletal 1,9 til 2.1 angive ren RNA som er tilfældet for eksemplet i figur 2A. Lavere A260/280 nøgletal observeret i figur 2B viser mulige protein eller phenol forurening sidesten fra ekstraktionsmetode RNA. Absorbans ved 230 nm kan være resultatet af prøven forurening og A260/230 nm ratio beregnes også for denne årsag. Dette forhold bør være i rækken af 2,0-2,2 for ren RNA præparater som illustreret af en værdi på 2,03 til eksemplet i figur 2A, mens figur 2B har et lavt A260/230-forhold på 1,07 og den spektrale profil viser et skift i trug på 230 nm mod 240 nm, som er vejledende for resterende guanidin eller phenol i prøven. For eksemplet vist i figur 2B, kan re fældningen RNA for at fjerne forureningen forbedre renheden af prøven.

Figure 2
Figur 2 . Spektrofotometriske kvantificering af total RNA ekstraheret fra syge tilapia væv. A. renhed nøgletal og spektral profiler fra en vellykket RNA forberedelse. B. som A, undtagen repræsentant for en dårlig RNA udtræk procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at registrere TiLV af RT-PCR, ren prøver som repræsenteret i figur 2A var omvendt transskriberede (protokol 4) til cDNA og bruges som en skabelon for PCR assay nærmere i afsnit 5 og repræsentative resultater er vist i figur 3A. Primere vist i fed i tabel 1 blev brugt til at forstærke en 491 bp fragment af TiLV genomisk segment 314. PCR produkter var adskilt af gelelektroforese og farves med EtBr til visualisering. Figur 3A viser resultaterne af en to-trins RT-PCR ved hjælp af 4 cDNA prøver (S1-S4), stammer fra leveren af syge tilapia isoleret i Thailand, og i hver prøve, en ren enkelt band på ca 500 bp kan overholdes og prøver 1-4 er således TiLV positiv. Samme PCR produktet blev indhentet fra den positive kontrolprøve, bestående af cDNA af TiLV segment 3 klonet i et plasmid32 , mens den ingen template control (NTC) ikke give PCR produkter. Analysen i figur 3B blev udført ved hjælp af de samme primere som i figur 3A , men på et andet laboratorium, ved hjælp af en et-trins RT-PCR tilgang og med 5 RNA prøver stammer fra hoved nyre væv af tilapia med oprindelse i egyptiske akvakultur 15. det var fast besluttet på ved hjælp af denne opdagelse assay at prøver 1, 3 og 5 er TiLV positive, mens prøver 2 og 4 er TiLV negative siden ingen PCR produkt blev fundet på den korrekte størrelse. Negative kontroller, herunder to minus reverse transkriptase kontrol og to NTCs ikke generere nogen PCR produkter. En et-trins RT-PCR assay blev også udført målretning tilapia ActinB genet. Amplikon størrelsen af 217 bp blev genereret i hver prøve (S1-S5) som forventet38. Denne analyse fungerede som en kontrol for integriteten af RNA prøver samt giver mulighed for en semi-kvantitative undersøgelse af TiLV positive prøver. Genererede Tilapia ActB produktet er forholdsvis lige, kan så forskellene i TiLV specifikke PCR produkt genereret fortolkes som en sand afspejling af mængden af TiLV i en given vævsprøve.

Figure 3
Figur 3 . TiLV RT-PCR. A. cDNA prøver fremstillet af leveren væv af syge tilapia, indsamlet fra Thailand var skærmen for TiLV infektion ved hjælp af specifikke primere for segment 3 (vist i fed i tabel 1) af TiLV ved hjælp af en 2-trins RT-PCR assay. M = markør vist i basepar; S1-S4 = prøver 1-4; C1 = positiv kontrol bruge pTiLV som en PCR skabelon; og C2 = ingen template control (NTC). B. One-step RT-PCR ved hjælp af de samme primere som A og prøver fra hoved nyre væv af syge tilapia indsamlet fra Egypten15. M = markør vist i basepar; S1-S5 = prøver 1-5. Kontroller C1-C2 er minus reverse transkriptase kontrol og C3-C4 NTCs. nederste panel er en et-trins RT-PCR ved hjælp af primere rettet mod tilapia ActinB38 (Se tekst for detaljer) producerer en PCR produkt af 217 basepar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I modsætning til slutpunkt PCR'er repræsenteret i figur 3, qPCR assays, som er forklaret i protokol 6, måle mængden af PCR produkt efter hver PCR cyklus. Forstærkning af target-DNA er opdaget ved hjælp af fluorescerende molekyler, der interagerer med DNA genereret fra hver runde af reaktion. Her, blev SYBR Green jeg farve udnyttet, som intercalates med dobbelt-strenget DNA. Den fluorescerende signal er fulgt under reaktionen og dens intensitet vedrører mængden af produkt dannet 39,40,41,42,43. TiLV qPCR assays blev udført som beskrevet i protokol 6 på forskellige laboratorier ved hjælp af forskellige SYBR Green reagenser, qPCR maskiner og prøver fra forskellige lande. De resulterende forstærkning kurver er vist i figur 4A og 4B. Det kan bemærkes, at for hvert assay, forløbet af eksperimentet har fire faser: den lineære jord fase, tidlige eksponentiel fase, sent eksponentiel fase og plateau fase. Den lineære jord fase opstår under de tidlige cykler hvor DNA kopiering kan ikke endnu blive identificeret DNA mængder producerer utilstrækkelig signal/baggrund ratio. Baseline fluorescens beregnes i denne fase. Derefter, begynder target DNA at dobbelt koncentration med hver cyklus, inducerende signal at blive påviselige over baggrunden og stige eksponentielt. Et godt optimeret qPCR assay forstærkning effektivitet (E) er meget høj (nær 100%) i begyndelsen af den reaktion og forbliver stabil i denne tidlige eksponentiel fase af forstærkningen og det er på dette punkt at kvantificering er udført, når reaktion effektivitet er stadig støt. I senere cyklusser signalet begynder at plateau, og intensiteten af Fluorescens er ikke længere korreleret til skabelon kopi startnummer, fordi komponenterne reaktion er opbrugt44. Mætning kan også opstå på grund af konkurrencen fra re udgloedning reaktioner, de skiftende koncentration nøgletal af komponenterne eller mængden af enzymet enheder til DNA substrat molekyler. Eventuelt, sådanne parametre højde for forskellene mellem forstærkning kurverne for de undersøgelser, som vist i figur 4A og 4B. Den medfølgende kontrol ikke generere disse karakteristiske forstærkning kurver.

Figure 4
Figur 4 . Forstærkning grunde at vise ophobning af produktet over varigheden af real-time PCR analysen. A. forstærkning kurver af TiLV-positive prøver stammer fra Thailand, NTCs og positive plasmid kontrol bruge en SYBR-grøn 2-trins qPCR assay. Diagrammet blev genereret af plotte relative fluorescens (RFU) vs cyklus nummer. B. forstærkning kurver af TiLV positive prøver stammer fra Egypten, som i figur 3B og en NTC. Forstærkning kurve er fluorescens af reporter signalet normaliseret til fluorescens af passive ROX farvestoffet inkluderet i analysen (Rn) versus cyklus nummer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For enden af qPCR termocycler på de forskellige maskiner i hvert laboratorium var data erhvervet og analyseret. Figur 5A og 5B Vis repræsentative smeltende kurver fra assays udført i hvert laboratorium. Hver qPCR maskine var programmeret til at udføre en smeltende kurve analyse i slutningen. Dette blev opnået ved trinvist stigende temperatur og overvåge fluorescens som funktion af temperaturen. Når temperaturen er høj nok til at denaturere dsDNA, registreres et stort fald i fluorescens, fordi fluorophore molekyle er frigivet. Softwaren fra hver qPCR instrument beregnet den udgloedning temperatur (Tm) fra den smeltende kurve data ved at plotte den negative første afledte vs temperatur (figur 5). Det kan ses, at i figur 5A og 5B at produkterne dannet i de forskellige prøve sæt har ensartede smeltende overgang ved den forventede temperatur på ca. 80 ° C for analysen. Ingen andre toppe ved lavere temperaturer blev observeret. På grund af deres lille størrelse er Tm af primer-dimerer typisk lavere end for mål DNA-sekvens. Derfor, denne forskel mellem Tmgør det nemt at identificere potentielle primer-dimerer eller andre ikke-specifikke forstærkning produkter. Kontrolelementerne kunne ikke oprette smelte kurver som TiLV positive prøver og standarder og kan ses som en næsten vandrette linje nederst på hitlisterne i figur 5A og 5B.

Figure 5
Figur 5 . Smelt kurve analyse for at sikre assay specificitet og forskellige PCR produkter kan adskilles ved deres smeltende funktioner. A. smelte kurve analyse af TiLV-positive prøver stammer fra Thailand, negativ kontrol og positive plasmid kontrol. B. Smelt kurve analyse af TiLV positive prøver stammer fra Egypten, pTiLV standarder og en NTC. Hitlisterne i A og B begge viser ændringen i fluorescens divideret med ændringen i temperatur plottes temperatur til at producere et klart billede af den smeltende dynamik. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

De fleste qPCR maskiner kommer med en software at lette yderligere evaluering af qPCR køre og vil kvantificere prøverne ved at generere en standardkurve ved at plotte automatisk cyklus tærskel (Ct) mod logaritmen af pTiLV standarder skabelon Kopier nummer som vist i figur 6A og 6B for de to uafhængige laboratorier. Kort, Ct er den enhed, der anvendes til vurdering af qPCR resultater. Ct værdi angiver antallet af cyklusser kræves for at nå frem til et sæt tærskel fluorescens signalniveau. Jo større mængden af starter skabelon, jo færre cykler det tager at opnå en påviselig fluorescens. Faktisk vil prøver med en høj belastning af TiLV have lavere Ct værdier end prøver med en lav belastning af TiLV som i fisk med en subklinisk infektion. For at bestemme Ct værdier, trækkes fluorescens baggrundsværdier først fra rådata. Næste, den software, der er knyttet til qPCR enheden vil automatisk vælge en fluorescens tærskel ved søgning af data kurver for hver prøve og indarbejde en Ct der repræsenterer hvor prøven krydsede grænsen. Dette gøres separat for hvert assay og hver tærskel bør blive omhyggeligt vurderet, at sikre, at tærsklen, der er angivet i den logaritmiske del af forstærkning kurver og på et sted, hvor alle kurver er parallelle. Således, den specifikke Ct erhvervet er en relativ værdi og det er i forhold til den begyndende skabelon kopi nummer45, men det er også specifikt for qPCR maskine og reagenser, der anvendes, effektiviteten af PCR-amplifikation og følsomheden af påvisning. Disse parametre bidrage til forskelle observeret ved hjælp af den samme analyse i figur 6.

Fra standard kurver i figur 6, regression analyser, herunder beregning af standardkurven pister (m) og aflytninger, forstærkning effektivitetsfordele (100 x (101/m -1))46 og lineariteten af reaktionen blev udført. Standardkurven analyser blev også brugt til at bekræfte følsomhed (grænsen for opdagelse), repeterbarhed og reproducerbarhed af analysen. Teoretisk, mængden af DNA er fordoblet med hver PCR cyklus, hvilket betyder, at effektivitet (E) er lig med 100%. I praksis er sådan en ideel effektivitet, sjældent nået på grund af sub-optimale PCR betingelser såsom DNA-polymerase hæmning, forurenende stoffer, for meget cDNA og pipettering fejl47. Typisk, forstærkning E varierer fra 90 til 110% for god assays, i figur 6A en effektivitet på 94,5% blev beregnet ved hjælp af 8 seriefremstillede fortyndet pTiLV prøver, mens assay effektivitet i analysen vist i figur 6B ved hjælp af 7 seriefremstillede fortyndet pTiLV prøver var 101.2%. En effektivitet på over 100% er normalt på grund af tilstedeværelsen af PCR-hæmmere i analysen. Lineær regressionsanalyse af standard plottet giver også mulighed for beregning af antallet af TiLV kopier i hver prøve41,42,45, som kan iagttages de tre TiLV prøver vist i rødt i fig. 6B som er i overensstemmelse med resultaterne prøver S1, S3 og S5, vist i figur 3B.

Figure 6
Figur 6 . RT-qPCR standard kurver. Real-time PCR af 10-fold serielle fortyndinger af pTiLV, den standard, som bruges i begge laboratorier. A. 8 seriefremstillede fortyndet pTiLV prøver blev testet, alle kendt koncentration og korreleret til antallet af TiLV kopier / reaktion. Standardkurven blev genereret af plotte log kopi nummer vs cyklus tærskel (Ct). Hældning =-3.462, R2 = 0.9992 og effektivitet er 94.47%. B. som i A, undtagen 7 seriefremstillede fortyndet pTiLV prøver (grøn) blev testet og diagrammet vises tærskel cyklus på y-aksen og antal kopier TiLV (antal) på x-aksen. Y-skæringspunktet = 32.327, hældning =-3.292, R2 = 0,98 og effektivitet er 101.2%. For begge standarder kurver er i A og B, hældningen, y-skæringspunkt og korrelationskoefficienten værdier (R2) udnyttet til at forstå udførelsen af analysen. Vigtigere, bør Rasmussen2 værdi være tæt på 1, da det er et mål for lineariteten af standardkurven. Hældningen er brugt til at måle PCR effektivitet hvori 100% effektivitet svarer til en skråning af-3.32, se hovedteksten ligning og yderligere oplysninger. En god qPCR reaktion har generelt en effektivitet mellem 90-110% korrelerede til en hældning mellem-3.58 og-3.10. Standardkurven bruges til absolut kvantificering af ukendt TiLV positive prøver og bestemmer det nøjagtige antal TiLV kopier / reaktion, som det er tilfældet for de tre TiLV positive prøver farvet rødt i B.

Discussion

TiLV blev først rapporteret i 2014 i Israel14 og siden da er det blevet identificeret i flere lande, herunder Egypten, Colombia, Indien, Malaysia, Uganda, Tanzania og Thailand15,16,18, 35 , 48. globale bevidsthed, især tilapia producerende lande har placeret mere opmærksomhed på virus og forskellige restriktioner og kontrolforanstaltninger fra offentlige myndigheder har gennemført forsøg på at forhindre spredning af TiLV. Her, er en detaljeret protokol for TiLV påvisning i tilapia væv, der dækker prøvetagning, RNA isolering, cDNA syntese, PCR og qPCR assays blevet forklaret. Der er forskellige aspekter til disse metoder, der garanterer specifikke drøftelse. TiLV er blevet identificeret i fisk, der spænder over en række størrelser9,12,14,15,49 og arter af tilapia hidtil, herunder opdrættet hybrid tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nile tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 og rød tilapia (Oreochromis sp.)16,33,48,51, som godt som i vilde Nilen tilapia9,12, sort tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus og T. simonis intermedia14 og ganske nylig TiLV blev identificeret i vilde karper (Barbonymus schwanenfeldii)52. Vævsprøver fra indre organer (gill, milt, leveren, hjerte, hoved nyre) eller slim37 kan blive indsamlet fra sunde samt døende tilapia uanset alder, størrelse eller arter og forarbejdet til RNA isolering. Den samlede RNA udvinding protokol skitseret bruger her en monofasiske løsning af phenol og guanidinium kaliumthiocyanat, som er en chaotropic denaturering agent. Væv er direkte homogeniseret i denne løsning, efterfulgt af tilsætning af chloroform og centrifugering at opnå faseseparation hvori en klar RNA indeholdende øverste vandfasen, en interfase og en lavere organiske fase er genereret. RNA er isoleret fra den vandige fase af isopropanol nedbør, efterfulgt af vask af det gendannede RNA kan slippe af forurenende stoffer. Isolering af RNA ved denne metode var pioner af Piotr Chomczynski og Nicoletta Sacchi og blev omtalt som guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform udvinding53,54. Denne type af reagens, der anvendes til RNA udvinding kan være kommercielt købt eller fremstillet i laboratoriet (Se Tabel af materialer for yderligere oplysninger). Denne protokol tager lidt længere tid end kolonne-baserede metoder såsom kvarts-baserede rensning, men generelt, det er mere omkostningseffektive og giver mere RNA.

I denne protokol, kvantificere RNA ved hjælp af A260 værdier blev skitseret hvorved spektrofotometri værdier kan angive RNA kvalitet (A260/A280 = 1,9-2,1). Mens denne metode vil give en god indikation af prøven renhed, kan det absolut informere om kvaliteten af den udpakkede RNA. Bestem ordentligt om RNA er intakt eller delvist nedbrudte, prøver kan være separation ved agarosegelelektroforese gelelektroforese hvori udtværing af EtBr farves 18S og 28S rRNA bands angive RNA nedbrydning. Yderligere kontrol af RNA kvalitet kan omfatte hjælp af en lab-on-a-chip instrument. Derudover er det også vigtigt at fordøje den oprensede RNA med DNase jeg fjerne forurener vært genomisk DNA, som afhængigt af de downstream applikationer kan føre til forkerte resultater. Hvis værten gDNA stadig forurener RNA prøven i vid udstrækning, en supplerende DNaseI behandling kan også udføres i slutningen af RNA udtræk procedure (Se Tabel af materialer).

Supplerende DNA syntese kan i høj grad påvirke de samlede qPCR resultater og er et aspekt af den metode, der kan indføre variation. CDNA protokollen anbefalet her består af en enkelt komponent set-up bruger oligo (dT) og dermed kun transcribes mRNAs indeholdende polyA haler. Det giver brugerkontrol af præcis hvilke komponenter kan bruge til reverse transkription reaktion og denne tilstand af cDNA syntese er lykkedes TiLV påvisning32. Et alternativ til dette set-up er en kommercielt købte master-blanding indeholdende alle komponenter, der kræves til reverse transkription reaktion og er meget hurtig og enkel uden de sædvanlige Multi-trins, pipettering og multitemperatur protokol. Dette er en fordel fordi det minimerer håndtering og fremmer ensartethed på tværs af alle prøver. Sådan master-blander ofte omfatter både oligo(dT) og tilfældige primere gør det relevant at forskellige RNA skabeloner og generering af repræsentative cDNA kopier af sekvenser fra hele længden af RNA'er i en population (viral og tilapia vært mRNA) og i teorien, alle ønskede RNA arter kan derefter måles ved konventionelle PCR eller qPCR fra sådan en prøve. Denne alsidighed er den største fordel ved en 2-trins RT-PCR tilgang; Det giver en langsigtet pulje, der kan bruges til mange forskellige eksperimenter. En et-trins RT-PCR tilgang har været repræsenteret i resultaterne, hvori sekvens specifikke primere (tabel 1) blev brugt og RT og PCR blev udført i et rør (Se materiale liste). I almindelighed, sekvens specifikke primere giver mulighed for en højere RT effektivitet af det specifikke mål RNA end ved hjælp af tilfældige priming, men det specifikke mål RNA er den bare sig at kan kvantificeres i sådan en cDNA prøve, som kan være den eneste mål af visse laboratorier (Se Tabel af materialer for cDNA syntese produktforslag).

Mens konventionelle RT-PCR synes at være almindeligt anvendt hidtil i TiLV diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR har vist sig at være et mere effektivt redskab for påvisningen og kvantificeringen af små mængder af TiLV i fiskevæv eller slim32,37. I almindelighed, er qPCR udbredt i klinisk virologi diagnostiske laboratorier på grund af sin høje følsomhed, specificitet, god reproducerbarhed, bredt dynamikområde og hastighed21. Mens qPCR kan være i første omgang dyrere at implementere end konventionelle RT-PCR, giver det mange vigtige fordele i forhold til konventionelle PCR; Det har en hurtigere turn-around tid fra prøve til resultater og det kræver ikke nogen post-PCR trin. Dette sidste punkt betyder, at der er minimal risiko for laboratoriet forurening og det kan være mere let tilpasses til høj overførselshastighed situationer som i tilfælde af udbrud. Desuden er det i sagens natur mere følsomme end konventionelle RT-PCR, som er af afgørende betydning at opdage lave virale belastninger i subklinisk infektioner21. Dette ville kræve et indlejret PCR tilgang kræver reverse transkription, to yderligere PCR reaktioner og derefter analyse ved agarosegelelektroforese gel elektroforese. Disse mange trin tager en masse tid og øge chancerne for fejl eller forurening. Ikke desto mindre på grund af sin høje følsomhed kræver RT-qPCR omhyggelig eksperimentelle design og en grundig forståelse af kvantificering teknikker til at generere nøjagtige resultater56,57.

DNA bindende fluorophore, SYBR Green jeg har påvist i denne protokol. Det er en dsDNA uspecifik DNA bindende farvestof og dermed specificiteten af analysen ligger helt i sæt af primere, der kan generere falske positiver58. Derfor, mens dsDNA smeltende kurve analyse udført ved udgangen af hver PCR er en specielt vigtig del af PCR reaktion, fordi det bekræfter, at kun en PCR-amplikon af den korrekte Tm er produceret (dette bør opnås ved gel elektroforese når nye assays gennemføres). Thomsenm af et DNA-fragment er afhængig af en række forskellige funktioner som dens længde, GC sammensætning, sekvens, strand komplementaritet, koncentration såvel som på buffer komponenter og PCR smagsforstærkere. De smeltende kurve analyser i de repræsentative resultater vist fra to laboratorier ikke afsløre tilstedeværelsen af primer-dimerer eller andre uønskede PCR produkter, men hvis dette er observeret med andre prøver og/eller eksperimentelle set-ups, så analysen bør være re optimeret. Mere avancerede qPCR teknologier kræver ikke sådan en smeltende kurve trin og faktisk, siden denne metoder papir var skrevet, en TaqMan baseret TiLV RT-qPCR har udviklet udnytter to primere og en sonde, hvilket gør det yderst TiLV specifikke34.

Utvivlsomt, primere designet til RT-qPCR assays er grundlæggende for succes af analysen og primere her blev designet baseret på den offentligt tilgængelige TiLV genomisk data på tid32. Men RNA-vira er kendt at udstille høj mutation priser og mulige stammer vil slippe de nuværende diagnostiske test, som blev observeret for ISAV59. Det vil altid være vanskeligt for sådanne virustyper til at generere en universel pan-TiLV RT-qPCR analysen og disse analyser vil kun løbende forbedres, hvis flere TiLV genomisk data fra vidtrækkende placeringer og tidsperioder.

Endelig er det vigtigt at køre identiske eller om muligt eksemplarer reaktioner i både inden for og inter qPCR assays. Hvis Ct værdier er meget høj, så er brugen af flergangsbestemmelser især vigtigt at fastslå, at PCR reaktionen er pålidelig og reproducerbar. Generelt, hvis data fra replikerer reaktioner varierer mere end 0,5 cyklusser, reaktioner bør gentages og hvis Ct værdier konsekvent variere > 0,5 cyklusser i replikater, analysen bør optimeres igen. Anvendelse af en integreret qPCR pipettering robot hjælper utroligt med dette spørgsmål, men det er en luksus værktøj. Som med enhver eksperiment er den optagelse tilstrækkelige og passende kontrol af største vigtighed for udviklingen af robust molekylære assays, især i diagnostiske laboratorier, hvor disse analyser skal være akkrediteret. Kontrollen skal omfatte positive (positiv TiLV prøve, TiLV plasmid standard) og negative kontroller (NTC og -RT) prøver samt påvisning af endogene tilapia husholdning gener. Kontrollen kan ikke undervurderes, og bør indgå i hvert assay at korrekt forstå kvaliteten af hvert trin af analysen og korrekt fortolke resultaterne.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Institut for veterinær bakteriologi, Vetsuisse Fakultet, Berns universitet for deres støtte. Dette arbejde blev støttet af Udvalget for akademisk forfremmelse af tidlige karriere forskere og ligestilling mellem kønnene på det Vetsuisse Fakultet, Universitet af Bern af 120% model finansiering tildeles PN. WS og PR er støttet af Center for Advanced Studies for landbrug og fødevarer, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under videregående uddannelse forskning fremme og nationale forsknings Universitet projekt i Thailand, Office af videregående uddannelser Kommissionen, Undervisningsministeriet, Thailand. Vi vil gerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for hendes fortælling og Piyawatchara Sikarin til redigering af video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue collection Step 1
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative to clove oil. 
Step 1.1
RNAlater stabilization solution Thermo Fisher Scientific   AM7020 For storing tissues if they cannot be processed immediately
Step 1.3
RNA extraction Step 2
TRIreagent Sigma-Aldrich  Step 2.1
TRIzol Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) 15596026 Step 2.1
GENEzol Geneaid GZR100 Step 2.1
Trisure Bioline BIO-38032 Step 2.1
Homemade solution  -  - 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate
30.45 g/L  (400 mM) ammonium thiocyanate
8.20 g/L  (100 mM) sodium acetate
380 mL/L  (38 % v/v) phenol
50 mL/L (5 % v/v) glycerol
1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0
Store up to 2 years at 4oC
Step 2.1
MagNA Lyser Green Beads Roche 3358941001 An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below
Step 2.2
Lysing Matrix D, 2 mL Tube MP BIOMEDICALS 116913050
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Step 2.3
Chloroform RCI Labscan AR1027E-G2.5L Step 2.3
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B9673 A less toxic alternative to chloroform
Step 2.3
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % Sigma-Aldrich 59300 Step 2.6
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.09634.2500 Step 2.6
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) R0551 Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation
optional
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % Sigma-Aldrich (EMD Millipore) 1.00983 Step 2.9
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck (EMSURE) 1.00983.2500 Step 2.9
Nuclease-free water Promega P1193 Step 2.13
Nuclease-free water Multicell 809-115-CL Step 2.13
Ambion TURBO DNA-free kit  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) AM1907 Can be performed at the end of the RNA extraction protocol
optional
cDNA synthesis Step 4
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis cDSK01 Step 4.1 & 4.3
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover Toyobo A1172K An alternative option 
see discussion
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101 An alternative option 
see discussion
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase  Agilent Technologies 600107 An alternative option 
PCR Step 5
DNA polymerase systems: Step 5.2
   - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)  14001012a Step 5.2
   - GoTaq Mastermix Promega M7122 Step 5.2
Separate PCR mixture components: Step 5.2
10mM dNTP Mix Vivantis NP2409 Step 5.2
25mM MgCl2 Thermo Fisher Scientific R0971 Step 5.2
10X Taq Buffer with KCl Thermo Fisher Scientific 00348114 Step 5.2
Taq DNA polymerase Vivantis PL1202 Step 5.2
   - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq Thermo Fisher Scientific  AB1454 One step RT-PCR exemplified in Figure 3B
Gel electrophoresis: For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 17898 Step 5.5
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: Step 5.5
   - Tris Vivantis PR0612-1KG Step 5.5
   - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.00063.2500 Step 5.5
   - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BIO-RAD 161-0729 Step 5.5
Agarose Vivantis PC0701-100G Step 5.5
DNA ladders and markers Vivantis NL1405 Step 5.5
DNA gel loading dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611 Step 5.5
qPCR Step 6
PowerUP SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) A25779 Exemplified in Figures 4-6B
Step 6.2
iTaq Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD 1725120 Exemplified in the video and in Figures 4-6A
Step 6.2
Equipment 
Dounce tissue grinder pestle Sigma-Aldrich P1110 Protocol 2
MagNA Lyser Instrument Roche 3358976001 An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above
Step 2.2
FastPrep-24 5G Homogenizer MP BIOMEDICALS 116005500
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5427R Protocol 2
Step 2.4, 2.7 & 2.10
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5418R
Heat box Labnet AccuBlock Digital Dry Bath Protocol 2
Step 2.13
Microvolume spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) Nanodrop 2000 Protocol 3
Step 3.1 - 3.4
PCR machine BIO-RAD T100 Thermal Cycler Protocol 5
Step 5.4
Power supply BIO-RAD PowerPac HC Protocol 5
Step 5.5
Horizontal gel electrophoresis BIO-RAD Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu Protocol 5
Step 5.5
Mini microcentrifuge Corning LSE 6766 Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6
Step 6.5.1
Microcentrifuge LioFuge LM-60 Step 6.5.1
qPCR machine and software Thermo Fisher Scientific 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 Protocol 6
Step 6.6-6.8
qPCR machine and software BIO-RAD CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software
General Materials 
Mayo scissors Step 1.1-1.2
Forceps Step 1.1-1.2
Pipette Rainin Pipette-Lite XLS
Aerosol-barrier pipette tips Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2014. Opportunities and Challenges. , Rome. (2014).
  2. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2016. Contributing to Food Security and Nutrition for all. , Rome. (2016).
  3. WorldBank. FISH TO 2030: Prospects for Fisheries and Aquaculture. Agriculture and Environmental Services Discussion Paper 03. , (2013).
  4. Wing-Keong, N., Nicholas, R. A review of the nutrition and feeding management of farmed tilapia throughout the culture cycle. Reviews in Aquaculture. 5 (4), 220-254 (2013).
  5. Cleasby, N., et al. The socio-economic context for improving food security through land based aquaculture in Solomon Islands: A peri-urban case study. Marine Policy. 45, 89-97 (2014).
  6. Ponzoni Raul, W., et al. Genetic improvement of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with special reference to the work conducted by the WorldFish Center with the GIFT strain. Reviews in Aquaculture. 3 (1), 27-41 (2011).
  7. Hounmanou, Y. M. G., et al. Tilapia lake virus threatens tilapiines farming and food security: Socio-economic challenges and preventive measures in Sub-Saharan Africa. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 493, 123-129 (2018).
  8. OIE. Tilapia Lake Virus (TiLV) - a novel orthomyxo-like virus. OIE technical disease cards. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf (2018).
  9. Mugimba, K. K., et al. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. Journal of Fish Diseases. , (2018).
  10. Koesharyani, I., Gardenia, L., Widowati, Z., Khumaira,, Rustianti, D. D. Studi kasus infeksi tilapia lake virus (tilv) pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur. 13 (1), 85-92 (2018).
  11. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Chinese Taipei. Immediate Notification. , http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=24033 (2017).
  12. OIE. Tilapia Lake Virus Disease (TiLV), Peru. Immediate Notification. , (2018).
  13. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), e00431-e00416 (2016).
  14. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  15. Nicholson, P., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. Journal of Fish Diseases. 40 (12), 1925-1928 (2017).
  16. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  17. Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., Surachetpong, W. Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). Veterinary Microbiology. 207, 170-177 (2017).
  18. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  19. Thangaraj, R. S., et al. Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 492, 206-214 (2018).
  20. Hanson, L. A., Rudis, M. R., Vasquez-Lee, M., Montgomery, R. D. A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virology Journal. 3, 28-28 (2006).
  21. Josko, D. Molecular virology in the clinical laboratory. Clinical Laboratory Science. 23 (4), 231-236 (2010).
  22. Munir, K., Kibenge, F. S. Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 117 (1), 37-47 (2004).
  23. Snow, M., et al. Developement, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo salar). Developments in Biologicals. 126, discussion 325-136 133-145 (2006).
  24. Matejusova, I., McKay, P., McBeath, A. J., Collet, B., Snow, M. Development of a sensitive and controlled real-time RT-PCR assay for viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in marine salmonid aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms. 80 (2), 137-144 (2008).
  25. Garver, K. A., et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. 95 (2), 97-112 (2011).
  26. Dalla Valle, L., et al. Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Veterinary Microbiology. 110 (3-4), 167-179 (2005).
  27. Hodneland, K., Garcia, R., Balbuena, J. A., Zarza, C., Fouz, B. Real-time RT-PCR detection of betanodavirus in naturally and experimentally infected fish from Spain. Journal of Fish Diseases. 34 (3), 189-202 (2011).
  28. Hodneland, K., Endresen, C. Sensitive and specific detection of Salmonid alphavirus using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 131 (2), 184-192 (2006).
  29. Wang, X. W., Ao, J. Q., Li, Q. G., Chen, X. H. Quantitative detection of a marine fish iridovirus isolated from large yellow croaker, Pseudosciaena crocea, using a molecular beacon. Journal of Virological Methods. 133 (1), 76-81 (2006).
  30. van Beurden, S. J., et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of anguillid herpesvirus 1. Journal of Fish Diseases. 39 (1), 95-104 (2016).
  31. Ciulli, S., et al. Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of lymphocystis disease virus. Journal of Virological Methods. 213, 164-173 (2015).
  32. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  33. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 476, 111-118 (2017).
  34. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 497, 184-188 (2018).
  35. Behera, B. K., et al. Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 484, 168-174 (2018).
  36. Ferguson, H. W., et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report. Journal of Fish Diseases. 37 (6), 583-589 (2014).
  37. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 486, 75-80 (2018).
  38. Yang, C. G., et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Gene. 527 (1), 183-192 (2013).
  39. Bustin, S. A. Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (4), 493-498 (2005).
  40. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  41. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  42. Mackay, I. M., Arden, K. E., Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 30 (6), 1292-1305 (2002).
  43. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  44. Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25 (2), 169-193 (2000).
  45. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 6 (10), 986-994 (1996).
  46. Rutledge, R. G., Côté, C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 31 (16), e93-e93 (2003).
  47. Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
  48. Amal, M. N. A., et al. A case of natural co-infection of Tilapia Lake Virus and Aeromonas veronii in a Malaysian red hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus) farm experiencing high mortality. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 485, 12-16 (2018).
  49. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 473, 430-432 (2017).
  50. OIE. Tilapia Lake Virus disease (TiLV), Philippines. Immediate Notification. , (2017).
  51. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Malaysia. Immediate Notification. , https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=24809 (2017).
  52. Abdullah, A., et al. First detection of tilapia lake virus (TiLV) in wild river carp (Barbonymus schwanenfeldii) at Timah Tasoh Lake, Malaysia. Journal of Fish Diseases. 41 (9), 1459-1462 (2018).
  53. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  54. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  55. Del-Pozo, J., et al. Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes. Veterinary Pathology. 54 (1), 164-170 (2017).
  56. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  57. Purcell, M. K., Getchell, R. G., McClure, C. A., Garver, K. A. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of aquatic animal pathogens in a diagnostic laboratory setting. Journal of Aquatic Animal Health. 23 (3), 148-161 (2011).
  58. Simpson, D. A., Feeney, S., Boyle, C., Stitt, A. W. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR. Molecular Vision. 6, 178-183 (2000).
  59. Kibenge, M. J., et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virology Journal. 13, 3 (2016).

Tags

Miljøvidenskab sag 141 Tilapia søen virus tilapia diagnose RT-PCR RT-qPCR orthomyxo-lignende virus
Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nicholson, P., Rawiwan, P.,… More

Nicholson, P., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR. J. Vis. Exp. (141), e58596, doi:10.3791/58596 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter