Summary
Här beskriver vi en kliniskt relevant, hög verkningsgrad, feeder-fri metod att omprogrammera humana primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller använder modifierade mRNA kodning omplanering faktorer och mogen mikroRNA-367/302 härmar. Här ingår också metoder för att bedöma omplanering effektivitet, expandera klonal iPSC kolonier och bekräfta uttryck för pluripotens markören TRA-1-60.
Abstract
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har visat sig vara ett värdefullt verktyg att studera människans utveckling och sjukdom. Ytterligare främja iPSCs som en regenerativ terapeutiska kräver en säker, robust, och ändamålsenligt omplanering protokoll. Här presenterar vi ett kliniskt relevant, stegvisa protokoll för extremt hög verkningsgrad omprogrammering av mänskliga dermal fibroblaster in iPSCs använder ett icke-integrerande tillvägagångssätt. Kärnan i protokollet består av att uttrycka pluripotency faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) från in vitro- transkriberas messenger RNA syntetiseras med modifierat nukleotider (modifierade mRNA). De omprogrammering modifierade mRNA är transfekterade till primära fibroblaster varje 48 h tillsammans med mogen embryonala stamceller-specifika mikroRNA-367/302 härmar i två veckor. De resulterande iPSC kolonierna kan sedan isoleras och direkt expanderat i feeder-fria villkor. För att maximera effektivitet och konsekvens i våra omplanering protokoll över fibroblast prover, vi har optimerat olika parametrar, bland annat den RNA transfection regimen, timing av transfections, odlingsbetingelser och sådd tätheter. Ännu viktigare, genererar vår metod högkvalitativa iPSCs från de flesta fibroblast källor, inklusive svårt-att-programmera sjuka, äldre eller senescent prover.
Introduction
Omprogrammering av somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kräver utökade uttryck för en grundläggande uppsättning transkriptionsfaktorer som är viktiga att upprätthålla pluripotency1,2. Vid framställning av iPSCs för kliniska tillämpningar, är det viktigt att mutationsanalys bördan i indataceller minimeras under bearbetning och effektiviteten i iPSC generation upprätthålls på en relativt hög nivå över patientprover. Men lider majoriteten av omprogrammering metoder, inklusive integration-fritt protokoll, av mycket låga omplanering effektivitetsvinster, vilken gräns kliniska nyttan av dessa närmar sig3. Låga omplanering effektivitet kan också främja selektiva omprogrammering av celler som bär redan existerande mutationer, ökar mutationsanalys börda i resulterande iPSCs. Dessutom lider alla DNA-baserade omplanering metoder, såsom lentivirus - och episomal-baserade metoder, den säkerhet oro att DNA slumpmässigt kan integrera i genomet och skapa möjlighet för skadliga insertionsmutationer och oönskade ( potentiellt onkogena) uttryck för pluripotens gener i nedströms vävnad derivat4.
En lovande strategi för att uppnå effektiv induktion av pluripotency i somatiska celler och minska mutationsanalys börda i resulterande iPSCs är att använda syntetiska utjämnade messenger RNAs som innehåller modifierade nucleobases (modifierade mRNA) för omprogrammering5. Effektiviteten av modifierade mRNA omplanering tillvägagångssätt kan förbättras ytterligare genom att lägga till embryonala stamceller (ESC)-specifika mikroRNA (Mirna) -367/302s3, som har visat att omprogrammera kroppsceller med ökad effektivitet6 ,7. Men även med tillägget av Mirna-367/302s misslyckas den modifierade mRNA omplanering synsätt ofta under applicering till nybakade isolerade patientens celler3. Till adress inkonsekvenser i denna modifierade mRNA-baserade strategi, har vi nyligen rapporterat en optimerad, integration-gratis strategi som inducerar pluripotency i mänskliga primära fibroblaster med en hög framgång och använder båda modifierade mRNA kodning omprogrammering faktorer och mogen miRNA-367/302 härmar8. I vår metod innehåller omplanering modifierade mRNA cocktail en modifierad version av OCT4 som smält med MyoD transkription domänen (kallas M3O)9 och fem andra omplanering faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A och NANOG). Att kombinera modifierade mRNA kodning pluripotency faktorer med miRNA tycktes härmar ha en synergistisk effekt på omprogrammering effektivitetsvinster i detta protokoll. Ytterligare optimeringar av RNA transfection regimen, cell sådd och odling villkorar var också nödvändigt att öka omplanering effektiviteten i metoden till en extremt hög nivå8.
Till skillnad från många andra protokoll kräver vår omplanering tillvägagångssätt normalt endast några tusen ingående fibroblaster. Dessutom innebära många gemensamma icke-integrerande strategier använder episomal plasmider, Sendai virus eller självreplikerande RNA omfattande passaging för att späda ut den omprogrammering vektorn i genererade iPSCs. Omvänt, modifierade mRNA och mogen miRNA härmar har en kort halveringstid och elimineras snabbt från celler. Sammantaget den kumulativa cell kulturtid mellan patientprover och generering av användbara iPSCs är minimal i detta tillvägagångssätt, att effektivt begränsa mutation ackumulering i resulterande iPSCs och förbättra kostnadseffektiviteten.
Här presenterar vi detaljerade stegvisa protokollet för att uppnå hög verkningsgrad omprogrammering av vuxen mänskliga fibroblaster in iPSCs använder våra kombinatoriska modifierade mRNA/miRNA-baserad metod8. Detta RNA-baserade omplanering protokoll ger en enkel, kostnadseffektiv och robust metod för att skapa integration-fri iPSCs för forskning och potentiella kliniska tillämpningar. Dessutom gäller det en omprogrammering av en mängd fibroblast linjer inklusive svårt-att-programmera, sjukdomsassocierade, åldern, och senescent fibroblaster. En schematisk för protokollet för omprogrammering mänskliga fibroblaster visas i figur 1. Protokollet beskrivs specifikt en metod för omprogrammering tre brunnar av mänskliga vuxen primär fibroblaster i en 6-väl format plattan. Två brunnar ger normalt ett tillräckligt antal högkvalitativa iPSC kolonier. I många fall bara en är väl nödvändiga, och tredje väl kan användas för analys av omprogrammering effektivitet. Om det behövs kan antalet brunnar skalas upp.
Protocol
Arbeta under RNase-fria förhållanden och Använd aseptisk teknik när det är möjligt. Utföra alla cell kulturrelaterade manipulationer i biologiska säkerhetsdragskåp med aseptisk teknik. Följ institutionella biosäkerhet standarder för arbete med mänskliga celler.
1. reagenser och utrustning för beredning av omprogrammering initiering
- Förbereda de modified-mRNA cocktail kodning omplanering faktorerna.
- Följ de tidigare publicerade protokoll10 för att utföra in vitro- transkription, tak, och dephosphorylation förfaranden för varje modifierade mRNA kodning individuell omplanering faktor. Efter den sista reningssteg, eluera modifierade mRNA med nuclease-gratis vatten, komplettera renat modifierade mRNA lösningen med 1 U/µL RNase inhibitor, kvantifiera den modifierade mRNA med en spektrofotometer och förvaras vid-80 ° C i upp till 6 månader. Laga flera portioner av varje modifierade mRNA att minimera antalet frysning-tining cykler.
Obs: Liknande protokoll för modifierade mRNA produktion har varit rapporterade någon annanstans5,8,11. Mallar för in vitro- transkription kan genereras av PCR-amplifiering från motsvarande plasmid mallar med hjälp av primers som anges i Tabell av material enligt de tidigare publicerade protokoll10. Plasmid mallar för varje omplanering faktor (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) och mWasabi (kontroll för transfection) är tillgängliga från Addgene, en ideell plasmid-databasen. - Blanda ihop alla de modifierade mRNA i 3:1:1:1:1:1 molar förhållandet (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) och inkluderar 10% mWasabi ändras mRNA som en kontroll för transfection effektivitet. Justera koncentrationen av komplett modifierade mRNA omprogrammering mix till en slutlig koncentration på 100 ng/µL genom att tillsätta nuclease-fritt vatten kompletteras med 1 U/µL RNase inhibitor. Förbereda sju 33 µL portioner av den kompletta modified mRNA cocktail. Lagra de blandade omplanering alikvoter vid-80 ° C.
Obs: för varje transfection, 1000 ng av modifierade mRNA cocktail läggs per brunn (dvs. totalt 3.000 ng för 3 brunnar). Varje 33 µL alikvotens är dimensionerad för att transfect 3 brunnar i en 6-väl format plattan och inkluderar 3 µL av överskottet för pipettering fel. Förbereda sju 33 µL portioner räcker det att slutföra en fullständig fibroblast omprogrammering av 3 brunnar i en 6-väl format plattan.
- Följ de tidigare publicerade protokoll10 för att utföra in vitro- transkription, tak, och dephosphorylation förfaranden för varje modifierade mRNA kodning individuell omplanering faktor. Efter den sista reningssteg, eluera modifierade mRNA med nuclease-gratis vatten, komplettera renat modifierade mRNA lösningen med 1 U/µL RNase inhibitor, kvantifiera den modifierade mRNA med en spektrofotometer och förvaras vid-80 ° C i upp till 6 månader. Laga flera portioner av varje modifierade mRNA att minimera antalet frysning-tining cykler.
- Förbereda cocktailen av omprogrammering miRNA härmar.
- Lös upp frystorkat skick miRNA härmar (Syn-har-miR-302a - 3p, Syn-har-miR-302b - 3p, Syn-har-miR - 302c - 3p, Syn-har-miR-302d-3 p, Syn-har-miR-367-3 p) till en slutkoncentration på 5 pmol/µL (5 µM) i nuclease-fritt vatten kompletteras med 1 U/µL RNase inhibitor. Förbereda flera portioner av varje miRNA härma och förvaras vid-80 ° C för långtidsförvaring.
- Blanda alla miRNA härmar i en 1:1:1:1:1 molar förhållandet till en slutkoncentration på 5 pmol/µL (5 µM). Förbereda sju 14 µL portioner av miRNA härmar mix. Lagra de blandade alikvoter vid-80 ° C.
Obs: För varje transfection tillkommer 20 pmol miRNA härmar mix per brunn (dvs. totalt 60 pmol för 3 brunnar). Varje 14 µL alikvotens är dimensionerad för att transfect 3 brunnar i en 6-väl format plattan och inkluderar 2 µL av överskottet för pipettering fel. Förbereda sju 14 µL portioner räcker det att slutföra en fullständig fibroblast omprogrammering av 3 brunnar i en 6-väl format plattan.
- Förbereda transfection bufferten.
- Pre varm en 500 mL-flaska och en 100 mL flaska med färska minskas-serum medium till rumstemperatur (RT) för cirka 2 h. Använd inte ett vattenbad.
- Överföra en pH-mätare till en biosäkerhet skåp. Tvätta mätarens glaselektrod med nuclease-gratis vatten. Kalibrera pH-mätaren enligt tillverkarens instruktioner. Tvätta elektroden igen med nuclease-gratis vatten.
- Över både flaskor av minskad-serum medium till biosäkerhet skåp. Använda 500 mL RT flaskan för att justera pH.
- Mäta bas pH-värdet av minskad-serum medium genom att infoga av pH-mätaren glaselektrod i bufferten. Vänta upp till 1 min innan du läser pH-värdet på mätaren.
- Tillsätt 3-4 mL 1 M NaOH till 500 mL minskas-serum medium, Stäng flaskan och blanda väl. Vänta upp till 5 min innan du öppnar flaskan för pH-mätning. Infoga den pH-mätarens elektrod i bufferten och vänta tills behandlingen på pH-mätaren stabiliserar.
- Fortsätt lägga till små volymer av 1 M NaOH tills pH-värdet minskas-serum medium når 8.15 – 8,17. Kalibrera pH-mätaren flera gånger under processen. Om vid något tillfälle blir pH högre än 8.18, minska den genom att lägga till färska minskas-serum medium från pre värmde 100 mL flaskan (steg 1.3.1).
Obs: pH minskad-serum medium-baserade transfection bufferten är kritisk. Omprogrammering kommer att lyckas om pH-värdet i transfection bufferten är ca 8,2 ± 0,05 men kan misslyckas om pH-värdet är högre än 8.25. Därför är det klokt att sluta lägga NaOH när den buffertens pH når 8.15 – 8,17. Detta kommer att säkerställa att den slutliga pH transfection bufferten är cirka 8,2 – 8.22 efter sterilisering. - Filter sterilisera transfection bufferten 0,22 µm dammsugarfilter system med. Alikvot steriliserad bufferten i 5 eller 15 mL rör med minimal luftar utrymme.
- Lagra alikvoter av transfection bufferten för upp till 3 månader vid 4 ° C. Mäta pH-värdet i alikvoter regelbundet. Kassera alikvoter om pH-värdet är högre än 8.25. Begränsa alikvotens användande till 2 transfections endast eftersom exponering transfection bufferten för Atmosfärisk luft ökar pH-värdet i bufferten.
- Förbereda fibroblast expansion medium (FEM): minsta viktigt medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1 x 1 x glutamin tillägg, 55 µM 2-merkaptoetanol, icke-essentiella aminosyror, 1 x penna/strep/fungizone. Lagra FEM vid 4 ° C.
- Förbereda det omprogrammering mediet: DMEM/F12 (ingen HEPES) kompletteras med 20% knockout serum ersättning (KOSR), 0,5 x icke-essentiella aminosyror, 0,5 x glutamin tillägg, 55 µM 2-merkaptoetanol, 50 µg/mL askorbinsyra, 1 x penna/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF , och 200 ng/mL B18R. Förbereda mediet vid inledandet av omprogrammering utan bFGF och B18R och förvara den vid 4 ° C. Använd den inte mer än 1 månad efter beredning. Lägga till bFGF och B18R omedelbart före varje användning en alikvot storlek för dagens användning.
- Förbereda plätering mediet genom att lägga till 5% Värmeinaktiverade (HI) FBS till omplanering medium innehållande 20% KOSR utan bFGF och B18R från steg 1,5. Förbereda de medelstora färska på dagen för avsedd användning. Lägga till bFGF och B18R omedelbart före användning på dag 0 i omprogrammering.
- Kalibrera vävnadsodling inkubatorerna innan omprogrammering enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av en handhållen digital CO2 analyzer. Använd en låg-O2 inkubator för omplanering stegen för att säkerställa framgångsrika iPSC generation.
2. odling av fibroblaster för omprogrammering
- Förbereda fibroblaster före inledandet av omprogrammering (dag -2).
- Coat en ny 10 cm vävnadsodling platta med 5 mL 0,1% gelatin. Tryck eller snurra på plattan för att säkerställa att hela ytan är belagd. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C. Aspirera gelatin och tillsätt 10 mL av FEM. Ställ åt sidan. Låt inte den belagda ytan av plattan torka innan du lägger till FEM.
- Aspirera försiktigt använt medlet från fibroblaster. Skölj cellerna en gång med 5 mL av DPBS att ta bort kvarvarande serum. Tillsätt 3 mL av trypsin-EDTA. Skaka försiktigt på plattan för att säkerställa fullständig täckning över cellerna.
- Sug ut överflödig vätska, lämnar ~ 500 µL av trypsin. Inte alltför aspirera, eftersom detta kan torka och döda fibroblaster. Inkubera fibroblaster med trypsin-EDTA under 3 minuter vid 37 ° C.
- Avlägsna plattan från inkubatorn och fast men försiktigt knacka på sidan av plattan rubba cellerna. Kontrollera cellerna i Mikroskop. Om cellerna är fristående och flytande, Fortsätt. Om cellerna är fortfarande kopplade, inkubera i en annan 3 min.
- Snabbt skölj/samla fristående cellerna med 5 mL av FEM för att neutralisera den trypsin-EDTA. Flytta den fibroblast suspensionen i en 15 mL koniska rör. Säkerställa att cellerna är väl blandad.
- Blanda försiktigt cellsuspensionen för att bryta stora klumpar av celler och sedan räkna dem på en hemocytometer. Överföring 2,5 x 105 celler i gelatin-belagd 10-cm skålen bereddes i steg 2.1.1. Inkubera cellerna övernattning i de 37 ° C, 5% CO2 befuktade regelbundna vävnadsodling inkubator.
Obs: Cell densiteten är avgörande för att uppnå hög omplanering effektivitet, eftersom det är viktigt att fibroblaster är hälsosamma och snabbt delande. Plätering 2,5 x 105 celler ger en 40-60% konfluens 2 dagar senare för de flesta fibroblast prover. Justera beloppet för sjuka eller senescent celler för att uppnå den önskade 40-60% konfluens 48 h senare. - Ersätta mediet med 10 mL färsk FEM följande dag (dag -1).
- Tallrik fibroblaster för att initiera omprogrammering (dag 0).
- Kontrollera att fibroblaster omprogrammeras på 40 – 60% konfluens (bild 2, dag 0). Om cellerna är över- eller under konfluenta, passage fibroblaster som beskrivs i steg 2.1 och justera plätering tätheten. Kultur i ytterligare 2 dagar.
- Överföra 4 mL av DPBS till en 15 mL koniska rör. Tillsätt 100 µL av rekombinant humant (rh) laminin-521. Pipettera upp och ner för att blanda.
- Tillsätt 1 ml per brunn av utspädda rhLaminin-521 i 3 brunnar i en 6-bra platta. Inkubera belagda plattan vid 37 ° C i 2 h.
- Värma 6 mL FEM och 4 mL plätering medium till 37 ° C. Komplettera det plätering mediet med bFGF till en slutlig koncentration på 100 ng/mL och B18R till en slutlig koncentration på 200 ng/mL.
- Aspirera försiktigt använt medlet från fibroblaster (steg 2.2.1). Skölj cellerna med 5 mL av DPBS och tillsätt 3 mL av trypsin-EDTA. Skaka försiktigt på plattan för att täcka cellerna med trypsin-EDTA.
- Sug ut överflödig vätska, lämnar ~ 500 µL av trypsin, som gjort steg 2.1.3. Inkubera fibroblaster med trypsin-EDTA under 3 minuter vid 37 ° C. Avlägsna plattan från inkubatorn och fast men försiktigt knacka på sidan av plattan rubba celler. Kontrollera cellerna i Mikroskop. Om cellerna är fristående och flytande, Fortsätt. Om cellerna är fortfarande kopplade, inkubera i en annan 3 min.
- Skölj/samla fristående cellerna med 5 mL av FEM för att neutralisera den trypsin-EDTA. Flytta den fibroblast suspensionen i en 15 mL koniska rör. Säkerställa att cellerna är väl blandad och räkna dem på en hemocytometer. Pipettera över 12.000 celler till 4 mL av förvärmd plätering medium från steg 2.2.4.
Obs: Inte Centrifugera cellerna när som helst. Antalet guldpläterade celler kan justeras upp eller ner som krävs för långsam eller snabb-växande linjer, respektive. - Avlägsna belagda plattan från inkubatorn och aspirera utspädda rhLaminin-521 från belagda brunnarna. Låt inte brunnarna torka yta. Försiktigt resuspendera cellerna plätering medium. Pipettera 1 mL cellsuspension i varje belagd väl (dvs. 3 000 celler per brunn).
- Placera de guldpläterade cellerna i en tri-gas vävnadsodling inkubator med O2 satt till 5% (låg-O2). När plattan sätts, försiktigt men grundligt skingra celler genom att växla mellan en upp/ner och vänster/höger sedan rörelse. Upprepa hela proceduren 2 gånger. Inkubera cellerna över natten. Inte snurra plattan att blanda.
- Pipettera 4 mL omprogrammering medium till en 15 mL konisk slang och placera den i låg-O2 inkubator med badmössa lossade temperera över natten. Lägg inte till bFGF och B18R förrän följande dag.
3. inledande av omprogrammering (dag 1)
Obs: När en omprogrammering är inlett, dagligt underhåll krävs för ca 1 månad. Glöm inte att planera därefter. Alla efterföljande cell inkubationer måste utföras under låg-O2 förhållanden i 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 befuktade tri-gas vävnadsodling inkubator.
- Ersätta plätering medium minst 1 timme före transfection.
- Ta bort skakad omplanering mediet från låg-O2 inkubatorn. Lägg till bFGF till en slutlig koncentration på 100 ng/mL och B18R till en slutlig koncentration på 200 ng/mL. Blanda väl.
- Fortsätter med 1 väl i taget, Använd en 1 mL pipett att ta bort det förbrukade mediet och ersätta det med 1 mL av omplanering medium kompletteras med bFGF och B18R. Upprepa detta för varje brunn. Använd inte vakuum aspiration, som överdrivet torkar cellerna, som orsakar stress och minskar omplanering effektivitet. Flytta plattan med celler tillbaka till låg-O2 inkubatorn.
- Transfect fibroblaster med 5 µL RNAiMax transfection reagens per 1 µg modifierade mRNA och 1 µL av transfection reagens per 6 pmol av miRNA härmar per transfection.
Obs: Optimalt resultat erhålls när transfections fortsätta för 16 – 20 h. Transfection reagenset är utspädda 10 x; de 100 ng/µL modifierade mRNA cocktail är utspädd 5 x; och de 5 pmol/µL miRNA härmar mix är utspädd 8.33 x med transfection bufferten innan komplexering. Se tabell 1 för en sammanfattning av transfection installationen.- Samtidigt förbereder transfection mixar, minimera potentiella exponering av reagenser för RNase genom att följa standard laboratoriesed.
- Temperera en alikvot av transfection bufferten (steg 1.3) för ca 1 h på RT. Använd inte en 37 ° C vattenbad eller inkubator för att värma upp transfection bufferten.
- Ta bort en enda alikvot av modifierade mRNA (33 µL) och miRNA härmar (14 µL) från-80 ° C och värma dem RT för cirka 3-5 min, tills tinat. Inte Tina alikvoter vid 37 ° C. Snurra dem ner kort i en microfuge.
- Varma transfection reagensen RT för cirka 3-5 min. Använd inte en 37 ° C vattenbad eller inkubator. Invertera stängda röret 2 – 3 gånger att blanda reagensen. Snurra den ner kort i en microfuge.
- Över 279 µL av RT transfection bufferten till ett RNase-fri mikrocentrifug rör. Tillsätt 31 µL av transfection reagens att uppnå en slutlig volym av 310 µL. Blanda grundligt genom pipettering. Gör inte vortex. Inkubera röret på RT för 1 min.
Obs: Denna volym av utspädda transfection reagens räcker till komplexa både modifierade mRNA och miRNA härmar alikvoter från steg 3.2.3. - Lägga till 132 µL av RT transfection bufferten den 33 µL alikvoten av modifierade mRNA. Pipettera försiktigt för att blanda: slutlig volym är 165 µL.
- Lägga till 102,6 µL av RT transfection bufferten den 14 µL alikvoten av miRNA härmar. Pipettera försiktigt för att blanda: slutlig volym är 116,6 µL.
- Lägga till 165 µL utspädda transfection reagensets från steg 3.2.5 till utspädda modifierad mRNA från steg 3.2.6. Pipetten att blanda: slutlig volym är 330 µL.
- Lägga till 116,6 µL utspädda transfection reagensets från steg 3.2.5 till utspädda miRNA härmar mixen från steg 3.2.7. Blanda väl (slutlig volym är 233.2 µL). Inkubera i 15 min på RT att tillåta transfection bufferten till komplexa med den modifierade mRNA och miRNA härmar.
- Avlägsna plattan med celler från låg-O2 inkubatorn. Tillsätt 100 µL (1 µg) av den komplexa modified mRNA transfection mix i varje brunn, droppvis över brunnen. Skingra transfection komplexen av försiktigt men grundligt agitera plattan med en upp/ner och vänster/höger sedan rörelse. Inte snurra plattan att blanda.
- Lägga till 66,7 µL (20 pmol) komplex miRNA härmar transfection mix i varje brunn, droppvis över brunnen. Skingra transfection komplex av försiktigt men grundligt agitera plattan med en upp/ner och vänster/höger sedan rörelse. Inte snurra plattan att blanda.
- Placera de transfekterade cellerna i tri-gas inkubatorn med O2 satt till 5% (låg-O2). När plattan sätts, skingra transfection komplexen igen genom försiktigt men grundligt agitera plattan med en upp/ner och vänster/höger sedan rörelse.
- Pipettera 4 mL omprogrammering medium i en 15 mL koniska rör och placera den i låg-O2 inkubator med lossade cap temperera över natten. Lägg inte till bFGF och B18R förrän följande dag.
| Tube 1 - RNAiMax utspädning (1: a mix) | ||
| Reagens | Koncentration | Volym |
| Transfection buffert | 279 ΜL | |
| RNAiMax (Lägg till 2: a) | 10 x | 31 ΜL |
| Totalt: 310 µL | ||
| (Inkubera 1 min i rumstemperatur) | ||
| Rör 2 - modifierade mRNA blanda (2nd mix) | ||
| Reagens | Koncentration | Volym |
| modifierade mRNA mix | 100 ng/µL (5 x) | 33 ΜL |
| Transfection buffert | 132 ΜL | |
| Totalt: 165 µL | ||
| (Lägg till lika stor volym av utspädda RNAiMax från Tube 1) | ||
| Tub 3 - miRNA härmar blanda (3rd mix) | ||
| Reagens | Koncentration | Volym |
| miRNA härmar mix | 5 pmol/µL (8.33 x) | 14 ΜL |
| Transfection buffert | 102,6 ΜL | |
| Totalt: 116,6 µL | ||
| (Lägg till lika stor volym av utspädda RNAiMax från Tube 1) | ||
Tabell 1: Beredning av transfection mix.
4. byte omprogrammering Medium mellan Transfections (dagar 2, 4, 6, 8, 10 och 12)
- Ersätta den medelstora 16 – 20 h efter transfection som beskrivs i 3.1.1–3.1.2. Lägg till bFGF till en slutlig koncentration på 100 ng/mL och B18R till en slutlig koncentration på 200 ng/mL till omplanering medium alikvoter.
- Övervaka mWasabi uttryck dagligen för att bekräfta transfection kvalitet med hjälp av ett mikroskop som konfigurerats för att visualisera andra.
Obs: mWasabi uttryck bör synas minimalt på dag 2 och öka i ljusstyrka med varje ytterligare transfection.
5. varje-annan-dag Transfections (dagar 3, 5, 7, 9, 11 och 13)
- Utför transfection som beskrivs i steg 3,2. Ändra inte mediet på dagar i transfection.
- Förbereda en 4 mL alikvot av omprogrammering medium och placera den i låg-O2 inkubatorn temperera för medelstora ändringen på följande dag. Lägg inte till bFGF och B18R förrän följande dag.
6. förfaranden för att utföras efter sista Transfection
- Utföra dagliga medelstora förändringar från dag 14 genom cirka dag 17. Värma 7 mL omprogrammering medium till 37 ° C. Lägg till bFGF till en slutlig koncentration på 100 ng/mL.
Obs: B18R behövs inte längre efter den slutliga transfection. Bortom dag 14 är det inte längre nödvändigt att temperera medium över natten i låg-O2 inkubatorn. - Ta bort mediet från alla brunnar med serologiska pipett. Fortsätta att undvika att använda aspiration. Tillsätt 2 mL av omprogrammering medium kompletteras med bFGF per brunn.
- På dag 17 och 18, analysera de omprogrammerade brunnarna under en inverterad eller dissekera Mikroskop. Om kolonier bildas i nära närhet till varandra på grund av hög effektivitet av omprogrammering och kan inte vara manuellt isolerad, separat kolonierna genom att utföra en valfri passaging omprogrammerade brunnar som beskrivs i steg 7 nedan. Om kolonier är gles och väl separerade, manuellt plocka klonerna direkt från de omprogrammerade väl enligt beskrivningen i steg 8 och subkultur iPSCs enligt standardprotokoll.
7. tillval procedur: Passaging celler från omprogrammeras brunnarna med EDTA
- Förbereda 0,5 mM EDTA i DPBS (EDTA) genom att späda ut 0,5 M EDTA stamlösning. Filter sterilisera EDTA 0,22 µm dammsugarfilter system med.
- Förbereda feeder-fri pluripotenta stamceller (PSC) medium (t.ex. mTeSR1) enligt tillverkarens anvisningar. Pre varma 32 mL PSC medium till 37 ° C.
- Täck alla brunnar i två 6-väl format plattor med hESC-kvalificerade extracellulär matrix (ECM) efter tillverkarens anvisningar. Seal-plattor med paraffin filma och inkubera dem för 1 h på RT.
- Aspirera ECM lösningen från pre värmde plattorna och ersätta det med 2 mL av PSC medium per brunn. Låt inte brunnarna torka yta. Ställ dem åt sidan.
- Aspirera omplanering mediet från 2 omprogrammeras brunnar på en dag när kolonierna är stora och tydligt bildade (vanligtvis dag 18). Skölj en gång med 1 mL av EDTA och aspirera.
- Tillsätt 1 mL av EDTA per brunn. Inkubera i 4 min vid 37 ° C.
- Försiktigt avlägsna plattan från inkubatorn och placera det i biosäkerhet skåp.
Obs: vid denna punkt, celler kan vara mycket löst fastsatta och lätt rubbas. - Aspirera försiktigt EDTA från båda brunnarna. Lägga till 3 mL före värmde PSC medium var väl behandlade med EDTA. Använda en cell-skrapa försiktigt men grundligt rubba celler från båda brunnarna.
- Använd en serologisk pipetten försiktigt Pipettera cellsuspensionen och bryta upp stora klumpar. Pipettera inte tills alla cell klumpar är borta. Bevara iPSC kluster.
Obs: Plätering stora klumpar påverkar inte iPSC kolonin utväxt. Om det finns alltför stora cell klumpar, helt enkelt undvika att överföra dem till nästa skålen. - Med serologisk pipett jämnt fördela celler från varje EDTA-behandlade väl genom pipettering 0,5 mL i varje brunn av ECM-belagd 6-väl plattan.
Obs: Blanda inte celler från omprogrammerade brunnarna (dvs omprogrammeras väl 1 bör fördelas jämnt i de första 6-väl-plattan och omprogrammeras väl 2 bör fördelas jämnt i andra 6-väl plattan). - Flytta guldpläterade celler tillbaka i låg-O2 inkubatorn. För att jämnt fördela celler, skaka varje platta och tillbaka och sida till sida. Inte snurra. Ersätta PSC medium dagligen.
8. plockning iPSC kolonier
- Pre varma 15 mL av PSC medium till 37 ° C. Coat alla brunnar i en enda 6-väl plåt med hESC-kvalificerade ECM följa tillverkarens instruktioner. Förslut plattorna med paraffin film och inkubera dem för 1 h på RT.
- Aspirera odlingssubstratet från brunnar som används för att samla iPSCs. Skölj en gång med 1 mL av EDTA och aspirera. Tillsätt 1 mL av EDTA per brunn. Inkubera i 4 min vid 37° C. Medan cellerna ruvning, aspirera ECM lösningen från pre värmde plattorna och ersätta med 2 mL av PSC medium per brunn. Avsätta plattorna.
- Ta försiktigt bort plattan med iPSCs att plockas ur ruvmaskinen och placera den i biosäkerhet skåp.
Obs: vid denna punkt, celler kan vara mycket löst fastsatta och lätt rubbas. - Aspirera försiktigt EDTA. Mycket försiktigt lägga 3 mL före värmde PSC medium, noga med att inte rubba iPSC kolonier.
- Flytta plattan till en inverterad eller dissekera omfattning till bättre visualisera kolonier. Förbereda en 1 mL pipett med en steril spets. Trycka ned kolven helt och sedan använda pipettspetsen försiktigt skrapa en koloni samtidigt långsamt dra vätska i spetsen att samla kolonin. Rita som liten medium som möjligt samtidigt plocka iPSC kolonin.
- För att överföra kolonin, Pipettera upp och ned 3 – 4 gånger i en enda brunn av ECM-belagd plattan från steg 8,2. Upprepa tills 6 kolonier har plockats och överförs i enskilda brunnar. Plocka inte mer än 2 kolonier från någon enstaka väl om en valfri passaging som beskrivs i steg 7 har utförts.
- Använda ett standard mänskliga stamceller protokoll för att frysa ner alla återstående brunnar. Tina och åter tallrik fryst lager om fler kolonier måste plockas senare.
9. karakterisering av iPSCs
- Utföra TRA-1-60 färgning för analys av omprogrammering effektivitet (dag 18).
Obs: 2 av 3 omprogrammeras brunnar är anpassade för framtida kolonin plockning. Väl de återstående kan användas för TRA-1-60 färgning. Proceduren kan utföras på laboratoriet bänk toppen.- Tvätta de omprogrammerade väl med 1 mL PBS. Fixa celler med iskall metanol vid-20 ° C i 5 min.
- Aspirera metanol. Torr brunn för cirka 2 min. var noga med att inte alltför torr. Cellerna har torkat tillräckligt när de blir en genomskinlig/Matt färg.
- Tvätta de väl 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min med milda skakningar. Under tvättarna, förbereda 3 mL 3% väteperoxid i PBS.
- Aspirera PBS. Tillsätt 2 mL utspädd peroxid lösning. Inkubera i 15 min på RT med milda skakningar. Förbered 4 mL av blockerande lösningen: 10% bovint serum albumin (BSA) i PBS.
- Aspirera peroxid lösningen. Tvätta de väl 2 gånger med 1 mL PBS för 5 min.
- Aspirera PBS och tillsätt 2 mL av blockering lösning i brunnen. Inkubera i 1 h på RT.
- Tvätta de väl 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min med milda skakningar.
- Späd primär anti-TRA-1-60 antikropp på 1: 100 i blockerande lösningen kompletteras med 0,05% natriumazid. Laga 1 mL av antikropp utspädning för 1 väl av en 6-väl format maträtt. Lägg till antikropp utspädning till brunnen och Linda plattan med parafilm att undvika avdunstning. Inkubera över natten vid 4 ° C under varsam skakning.
Obs: Om det behövs, inkubering med primära antikroppen kan göras för 1 h på RT med milda skakningar. Primär antikropp utspädningen kan återanvändas upp till 5 gånger. - Efter inkubation med den primär antikroppen, tvätta de väl 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min med milda skakningar.
- Späd den sekundära antimus HRP-konjugerad antikroppen på 1: 200 i blockerande lösningen. Inkubera brunnen med den sekundära antikroppar utspädningen för 2 h på RT med milda skakningar.
- Aspirera sekundär antikropp utspädning och tvätta de väl 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min med milda skakningar.
- Under den tredje tvätten, Bered substratlösningen följa tillverkarens instruktioner. Efter den sista tvättningen, aspirera PBS. Tillsätt 1 mL substratlösningen och inkubera tills önskad färg framkallar (ca 10 min).
- Aspirera substratlösningen. Skölj väl med vatten i 5 minuter medan du försiktigt skaka.
- Räkna kolonierna, om så önskas. Omprogrammering effektivitet = (antal kolonier) / (antalet guldpläterade fibroblaster) x 100%.
- För långsiktig lagring, sug ut vatten från den färgade plattan och lufttorka över natten på RT. Seal torkade plattan med parafilm och förvaras vid 4 ° C i upp till 2 år att bedöma omplanering effektivitet senare.
Representative Results
Det tar normalt cirka 5 – 6 veckor från inledandet av fibroblast omprogrammering till frysning av första skålarna innehållande iPSCs (figur 1). Protokollet omplanering kan generellt kategoriseras in i två faser. Fas 1 omfattar fibroblast kultur och sju transfections, med omprogrammering RNA cocktail utförs varje 48 h. fas2 omfattar isolering, expansion och karakterisering av iPSC kolonierna.
Innan protokollet, bör det säkerställas att fibroblaster omprogrammeras är av bra kvalitet. Friska fibroblaster ska visas spolformad, bipolär, och refractile med en fördubbling tid av ungefärligt 24 h. Av dag 0, bör 250.000 celler klädd i en 10 cm skål dag -2 växa till 40 – 60% konfluens (figur 1, dag 0) och ger cirka 6 – 10 x 105 celler. Celler som frodas i en långsammare takt kan kompenseras genom bordläggningen på en högre densitet på dag -2 och på dag 0 för omprogrammering.
Fibroblaster ska visas mycket glesa följande plätering i en brunn i en 6-väl format maträtt för omprogrammering (bild 2, dag 1). Tjugofyra timmar efter den första transfection, kommer att fibroblaster förlora sin spindel form och anta en mer avrundad morfologi (figur 2, dag 2), som upprätthålls genom resten av omprogrammering. Grön fluorescens från mWasabi mRNA bör vara minimalt observerbara på dag 2 och öka stadigt i ljusstyrka för att synas tydligt av dag 4. Förmågan att upptäcka mWasabi fluorescens kan bero på omfattningen känslighet och setup. Celldensitet ökar gradvis och konsekvent under de första tre transfections (dagar 1-6), med en skenbar brista i spridningen mellan dagar 7 och 8. Cellerna bör visas i hög grad konfluenta dag 10 (figur 2, dag 10). De första iPSC kolonierna kan visas så tidigt som dagen 11 (figur 2, dag 11); kolonierna kan dock inte vara observerbara så sent som dagen 18. I allmänhet från dygn 15 – 18, det kommer att finnas stora och uppenbara iPSC kolonier som tydligt skiljer sig från omgivande, ofullständigt omprogrammerade fibroblaster (figur 2, dag 15 och figur 3, dag 17). Immunfärgning för pluripotens markören TRA-1-60 kan utföras för att bedöma omplanering effektivitet (figur 3, dag 17, TRA-1-60). Vår erfarenhet, de flesta fibroblast linjer ger hundratals kolonier per omprogrammeras väl (figur 3, infällda B).
Suboptimal plätering densitet är den vanligaste orsaken till nedsatt effektivitet omprogrammering i våra protokoll och associeras ofta med fibroblaster som är sjuka, senescent eller hög-passage. Om plätering densitet är för låg, blir det stora acellulärt karga fläckar i slutet av omprogrammering (figur 4 c) och iPSC kolonier kan inte bilda (figur 4 d). Omstyrda celler bör vara mycket konfluenta dag 14 (jämför figur 4A och 4B till figur 2, dag 14). Likaså om celler är pläterade alltför tätt eller föröka sig alltför snabbt, reduceras omprogrammering effektivitet dramatiskt.
För att upprätthålla enhetligheten av patientderiverade iPSCs, är det viktigt att expandera cellinjer från en enda koloni. Omprogrammering effektivitet är mycket hög i vårt protokoll, kan angränsande iPSC kolonier bilda i närheten och växa till varje annan (figur 3, dagar 15 – 17). Detta gör det ibland svårt att mekaniskt separera en enda koloni för klonal expansion. Vi har funnit att det är bra att första passagen en omprogrammerade väl och späda ut det över ett större kulturområde. En bra passage förhållande består av jämnt dela en omprogrammerade 6-brunn-format plattan väl över en hela 6-väl-plattan.
Efter utspädning passagen, iPSCs växa som kolonier och lätt urskiljbara från fibroblaster (figur 5, dag 18). Inledningsvis iPSC kolonier får packas löst, och enskilda celler har ett relativt stort Cytoplasmatisk område. Under loppet av 4 – 7 dagar, iPSCs föröka sig och bilda en karakteristisk tätt packad koloni med definierade kanter. Enskilda celler inom kolonin har en stor nukleär fraktion med framstående nukleolerna (figur 5, dag 22). Det bör finnas många kolonier som bildas i varje brunn, och endast de med klassiska iPSC morfologi bör plockas för expansion.
Figur 1 : Omprogrammering av mänskliga fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). En schematisk protokoll för omprogrammering av mänskliga fibroblaster presenteras. Fibroblaster är först överförda på en låg densitet i en brunn i en 6-väl format maträtt, följt av sju transfections utförs 48 h mellanrum. Medium är utbytta 16 – 20 h efter varje transfection. Omprogrammerade iPSCs är först överförda på cirka dag 18 och klonal kolonier plockas av dag 26. Typiskt, fibroblast-derived iPSC linjer kan frysas för långsiktig lagring av dag 38. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa dagliga bilder under varje dag av omprogrammering. Fibroblaster ska vara cirka 40 – 60% konfluenta på tiden av passagen inleda omprogrammering (dag 0, celler är klädd i en 10 cm maträtt). Den första transfection (T1) förekommer på dag 1, och cellerna ska visas mycket gles på denna punkt. Följande dag (dag 2), bör en mer avrundad morfologi bli uppenbara. Cellerna fortsätter att öka i täthet i hela protokollet med iPSC kluster börjar visas så tidigt som dagen 11 (inringad i rött). Dag 15 blir iPSC kolonierna stora med diskret gränser. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kolonin bildandet efter transfections med omprogrammering modifierade mRNA och miRNA härmar. Låg-förstoring bilder togs av en representant som omprogrammering på dagar 15 – 17. Efter den slutliga transfection bildar omprogrammerade iPSCs tydliga kolonier med definierade gränser som expanderar i storlek och kondensera för att bli tydligt skiljer sig från ofullständigt omprogrammerade omgivande fibroblaster. Immunfärgning för pluripotens markören TRA-1-60 anger förekomsten av iPSCs (infälld A) och kan användas för beräkning av omprogrammering effektivitet genom att räkna alla kolonier inom en enda brunn (infällt B, exempel räknebart kolonier inringat i grönt). Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa bilder av suboptimal plätering densitet för omprogrammering. (A, B) Exempel på fibroblaster som är alltför glesa av dag 14 av omprogrammering (jämför figur 2, dag 14). (C) låg förstoring bilden på dag 17 av omprogrammering med en stor, karga patch inringad i rött. (D) samma brunnen var fixeras och färgas för TRA-1-60 att bekräfta övergripande fattiga omprogrammering effektivitet på grund av låg cell densiteten. Skala barer = 200 µm (A, B) och 1 mm (C, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa bilder av iPSCs efter inledande passagen. Efter att ha avslutat transfections med omprogrammering modifierade mRNA och miRNA härmar, Omstyrda celler är överförda från dygn 17 – 20. iPSCs har en tillväxt fördel i PSC medium och köra snabbt om någon fibroblaster som var ofullständigt omprogrammerade. Inledningsvis kommer iPSCs bildar kolonier som kan förekomma lös med dåligt definierade gränser. Inom några dagar, cellerna snabbt föröka sig och ta på den karakteristisk morfologin av tätt packade celler med förhållandet för hög nucleus-till-cytoplasman, tätt kluster till kolonier med tydliga gränser. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Det här protokollet beskriver en kliniskt relevant, icke-integrering, RNA-baserad metod som möjliggör för omprogrammering av normala och sjukdomsassocierade mänskliga fibroblast linjer till iPSCs på en extremt hög verkningsgrad. Hittills har varje mänsklig fibroblast linje har vi försökt att programmera med protokollet beskrivs gett ett tillfredsställande antal högkvalitativa iPSCs för nedströms tillämpningar. Resulterande iPSCs kan omedelbart överföras och expanderat i feeder-fri odlingsbetingelser.
Kvalitet av fibroblaster för omprogrammering:
Omprogrammering framgång är starkt beroende av kvaliteten på Start fibroblaster. Idealiskt, omprogrammering initieras med lägsta passage fibroblaster att uppnå högsta möjliga effektivitet. Omprogrammering effektivitet är bäst med fibroblaster av passage 2 – 4. Omprogrammering kan fortfarande arbeta med hög-passagen (passage 5 – 8), även senescent fibroblaster, om än med en minskad effektivitet. Ibland låg-passage fibroblaster är otillgänglig eller patientprover har en genetisk mutation som förhindrar tillväxt. I det här fallet, kan optimering av inledande plätering densitet krävas. Omprogrammering av komprometterad fibroblast linjer är vanligtvis förknippas med ökad celldöd under RNA transfections. Som ett resultat, verkar cellerna i en omprogrammering väl vara glesa av 10 – 14 dagars omprogrammering. Stora acellulärt områden kommer också att visas i brunnen. Om så är fallet, behöver omplanering protokollet återupptas med ett högre inledande tal av fibroblaster. Plätering 3.000 indataceller per brunn av en 6-väl format maträtt arbetar konsekvent för de flesta vuxna fibroblast linjer. Dock kan ökar plätering nummer 5 000 – 10 000 (50.000 för senescent linjer) bidra till att förbättra omprogrammering av sjukdomsassocierade prover, vilket har rapporterats i vår föregående publikation8. Celler att nå konfluens för tidigt kan däremot också vara resistent mot omprogrammering. Om celler som genomgår transfections med omprogrammering RNAs föröka alltför snabbt (vilket ibland är fallet med primära neonatal fibroblaster) inleda omprogrammering med 500 fibroblaster per brunn av en 6-väl format maträtt8.
Hantering av transfection bufferten:
PH-värdet i transfection bufferten (minskad-serum medium justerat till pH 8,2) är avgörande för att uppnå optimal transfection effektivitetsvinsterna krävs för detta omprogrammering protokoll. Av denna anledning rekommenderas flera försiktighetsåtgärder avseende hanteringen av transfection bufferten. Vi har funnit att även korta exponering transfection bufferten för Atmosfärisk luft påverkar pH i bufferten. Transfection bufferten bör därför aliquoted i en behållare med skruvlock med minimal luftar utrymme (vi använder antingen 5 eller 15 mL skruvlock koniska rör). För att ytterligare minimera luft exponering, använda varje transfection buffert alikvotens för högst två transfections. Slutligen, sedan temperaturen påverkar pH är det kritiskt att transfection bufferten är utjämnad RT för montering av transfection komplexen. Det är klokt att inte värma transfection bufferten till 37 ° C.
Passaging av iPSCs:
Medan många publicerade tidigare protokoll rekommenderar plocka enskilda iPSC kolonier i slutet av omprogrammering, detta kan vara svårt att uppnå när effektiviteten av omprogrammering är mycket hög eller om kolonierna kluster tillsammans, som ofta är fallet i våra protokoll. Om iPSC kolonier är i närheten av varandra, rekommenderar vi först passaging cellerna att sprida ut omprogrammerade iPSCs innan manuellt plocka kolonier. I området i närheten finns det flera fördelar med att utföra detta tidiga passage steg. Sprider ut kolonierna ger dem mer utrymme att växa, vilket ger mycket större kolonier för plockning än annars skulle kunna uppnås i den ursprungliga väl. Detta förbättrar avsevärt framgång i upprättandet av en iPSC linje från en plockade klon. Vi tycker också att ytterligare kultur tiden med fibroblaster, om än i förhållandet utspädda, visas att förbättra den genomsnittliga kvaliteten på plockade iPSC kolonier. Ofullständigt omprogrammerade fibroblaster kan ge stödjande parakrin faktorer, som fortsätter för att upprätta iPSCs och underlätta direkta övergången till feeder-fri cell odlingsbetingelser. Fibroblaster har slump en selektiv tillväxt nackdel jämfört iPSCs när odlade i mTeSR1. Kontaminerande fibroblast cell befolkningen späds därför snabbt till försumbara mängder inom 3 – 4 passager.
ROCK-hämmare såsom Y-27632 används ofta för rutinmässig kultur av mänskliga iPSCs. Vi har funnit att frekventa eller förlängda kultur av vissa iPSC linjer med Y-27632 kan ha skadliga effekter på kvaliteten. När du använder en dunge passaging metod, är som med EDTA, Y-27632 inte nödvändigt att upprätthålla iPSC lönsamhet efter klyvning. Vi har helt elimineras komplettera media med Y-27632 för alla iPSC isolering, expansion eller rutinmässiga kultur.
Protokoll begränsningar:
En begränsning att den beskrivna RNA-baserade omplanering strategin är initiala kostnaden och komplexiteten som är associerad med förberedelsen av omplanering reagenserna. Även om förberedande förfaranden att generera mRNA reagenser är alla rutin och har tidigare beskrivits (PCR, in vitro- transkription, DNase behandling, tak, Defosforylering, rening), är kumulativt produktionen av mRNA reagenser en relativt utdragen och icke-trivial process. Den andra stora utmaningen i detta protokoll är behovet av att transfect celler varje 48 h, öka labor intensiteten av protokollet omplanering. Dessa överväganden kan vara oöverkomliga om omprogrammering av endast några patientprover önskas. Om det främsta övervägandet är framtagning av kliniskt relevanta iPSCs eller uppnå mycket hög omplanering effektivitet, är dock den beskrivna RNA-baserade omplanering metoden perfekt.
Sammanfattningsvis gångjärn den beskrivna högeffektiv RNA-baserade omplanering metoden på optimerad transfection effektivitet av somatisk typ omprogrammeras som beskrivs i våra tidigare publikation8. RNA transfection protokollet presenteras i denna studie är mycket trimmad för mänskliga primära fibroblaster men potentiellt kan anpassas till andra celltyper att förbättra omplanering effektiviteten av olika somatiska celler.
Disclosures
I.K. och G.B. är samtidig uppfinnare på en patentansökan rätt ”metoder och kompositioner för omprogrammering celler”, PCT ansökan nr PCT/US2016/063258.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för finansiellt stöd från National Institutes of Health (T32AR007411-33) och University of Colorado hud sjukdomar Research Core Center (P30AR057212). Vi tackar också Epidermolysis Bullosa (EB) forskning partnerskapet, EB Medical Research Foundation, bota EB välgörenhet, dystrofa Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) International, King Baudouin Foundation's Vlinderkindje fonden, och Gates Gränser fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
