방법 논문

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

9.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58825

⸱

2019년 1월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Genetics and Bioengineering, Yeditepe University, 2National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Sickle Cell Branch, National Institutes of Health (NIH)

이 논문에서

요약

우리 치과 펄프에서 격리 된 중간 엽 줄기 세포와 공동 문화를 직접 및 간접 방법에 따라 전립선 암 세포 상호 작용의 평가 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 조건 매체 및 트랜스-잘 막 간접 paracrine 활동 분석에 적당 하다. 차동 시드 직접 셀 상호 작용에 대 한 적절 한 모델입니다 함께 셀 스테인드.

초록

다단계 프로세스와 복잡 한 질병으로 암은 개별 세포 증식 및 성장 뿐만 아니라 또한 종양 환경과 세포 세포 상호 작용에 의해 제어. 암 및 줄기 세포 상호 작용, 세포 외 환경, 물리적 상호 작용 및 분 비 요소에 변화를 포함 하 여 새로운 치료 옵션의 발견을 사용 수 있습니다. 우리는 시스템을 만들 모델 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)와 암 세포 상호 작용 알려진된 공동 문화 기술을 결합 한다. 현재 연구에서 치과 펄프의 줄기 세포 (DPSCs) 및 PC 3 전립선 암 세포 상호 작용은 직접 및 간접 공동 문화 기술에 의해 시험 되었다. 조건 매체 (CM) DPSCs에서 얻은 고 0.4 µ m 기 공 크기의 트랜스-잘 막 paracrine 활동을 연구 하는 데 사용 했다. 다른 세포 유형의 공동 문화 함께 직접 셀 상호 작용을 연구 수행 되었다. 결과 공개 CM 세포 증식을 증가 하 고 전립선 암 세포 배양에 있는 apoptosis를 감소. CM 및 트랜스-잘 시스템 PC-3 셀의 셀 마이그레이션 용량을 증가 했다. 다른 막 염료와 스테인드 셀 같은 문화 혈관으로 시드 했다 고 DPSCs PC-3 셀이 직접 공동 문화 조건 자체 조직된 구조에 참가 했다. 전반적으로, 결과 표시 공동 문화 기술 모델 시스템으로 암 및 MSC 상호 작용에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

서론

차별화와 같은 뼈, 연골, 근육, 인 대, 힘 줄, 그리고 지방, 간 엽 조직의 재생에 기여의 능력을 가진 중간 엽 줄기 세포 (MSCs),1 성인 신체에서 거의 모든 조직에서 분리 되어 , 2. 조직의 항상성 만성 염증 또는 상해 거주 셀을 생산 하 여 제공 하는, 다른 그들은 중요 한 cytokines 및 통합 하는 신생, 면역 체계, 그리고 조직3개장을 성장 요인 생산. 암 조직으로 MSCs의 상호 작용은 잘 이해 하지만 축적 증거 나왔다 MSCs가 종양 개시, 진행, 전이4를 홍보 수 있습니다.

부상 또는 만성 염증이 지역 MSCs의 귀환 능력은 그들이 줄기 세포 기반 요법에 대 한 귀중 한 후보. 그러나, 암 조직, "상처를 치유 하지", 또한 염증 성 cytokines, 프로-신생 분자, 그리고 cancerogenous 지역5MSCs를 유치 하는 중요 한 성장 요인 풀어. 그러나 거기에 제한7, 그들의 암 진행과 전이 홍보 효과 광범위 하 게 되어 암 성장6,에 MSCs의 억제 효과 보여주는 보고서 보고8. MSCs 직접 또는 간접적으로 영향을 미칠 발암 억제 면역 세포, 암 세포 증식 및 마이그레이션, 신생 활동을 강화 하 고 규제를 지 원하는 성장 인자/cytokines를 은닉 하는 등 다른 방법으로 상피 엽 전환 (응급)9,10. 암 관련 된 섬유 아 세포 (CAFs) 또는 myofibroblasts, 내 피 세포, adipocytes, 그리고 면역 세포11을 포함 한 여러 세포 유형 종양 환경에 의하여 이루어져 있다. 그 중, CAFs는 암 성장과 전이8을 홍보 하는 다양 한 발산을 분 비 하는 종양 영역에서 가장 풍부한 셀 유형입니다. 그것은 종양 기질12골 파생 MSCs CAFs로 분화 할 수 표시 되었습니다.

치과 펄프의 줄기 세포는 (DPSCs), Gronthos 그 외 여러분 에 의해 첫 번째 치과 조직 파생 MSCs로 특징 2000 년에 13 널리14,15다른 사람에 의해 조사, Oct4, Sox2및 Nanog16 등 pluripotency 마커를 표현 하 고 다양 한 셀 linages17으로 분화 할 수 있다. 유전자와 단백질 표정 분석 입증 DPSCs 성장 인자/cytokines 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), angiogenin, 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2), 인터 루 킨-4 (IL-4), 다른 MSCs와 대 등 한 수준의 생산 일리노이-6, 일리노이-10, 그리고 줄기 세포 요소 (SCF), 뿐만 아니라 신생을 촉진, 면역 세포를 조절 하 고 암 세포 확산 및 마이그레이션18,19,20 지원 수 fms 같은 티로신 키 니 아 제 3 ligand (Flt-3 L) . 동안 암 환경 상호작용 MSCs의 문학에서 문서화, DPSCs와 암 세포 사이 관계 아직 평가 하지는. 현재 연구에서 우리는 높은 전이성 전립선 암 세포 선, PC-3, 및 암 진행과 전이에 치과 MSCs의 메커니즘의 잠재적인 행동을 제안 하는 DPSCs에 대 한 공동 문화 및 상태 중간 치료 전략을 설립.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

환자 서 면된 동의 기관 윤리 위원회에서 승인 후 얻은 것입니다.

1. DPSC 격리와 문화

  1. 17 ~ 20 15 mL 튜브 포함 하는 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 세 젊은 성인에서 얻은 사랑니 전송 [낮은 포도 당 DMEM 미디어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충 / 암포 (PSA) 솔루션], 절제 후 8 시간 이내. 잠재적인 세포 죽음을 방지 하는 전송 하는 동안 조직 자료 감기 (4 ° C)를 보관.
  2. 신중 하 게 치아의 중심에서 무 균 추출 겸 자 펄프 조직 제거, 펄프 조직 10cm 조직 문화 요리, 감기 완전 한 DMEM 매체에 놓고 메스로 작은 조각 (2-3 m m)으로 그들을 말하다.
    참고: 모든 실험 절차 수행 되어야 합니다 밖으로 층 류 후드에서 무 균 조건 하에서. 이 비 효소 기술 이전에 사용한21,,2223되었습니다.
  3. 내부 조직 문화 장소 작은 펄프 조직 6 잘 플레이트 취급 하 고 커버 각 작은 펄프 조직 조각에 완전 한 DMEM 미디어의 200 µ L를 추가 합니다.
  4. 2 h 조직 첨부 파일을 제공 하기 위한 5% CO2 와 37 ° c 습도 공기 분위기 (80% 습도)에서 조직 문화 웰 스를 품 어.
    참고:이 단계 수 수 연장에 3-4 미디어의 증발을 조절 하 여.
  5. 우물에 완전 한 DMEM 매체의 적절 한 볼륨 (2-2.5 mL)를 추가 하 고 조직에서 확산 하는 셀에 대 한 5% CO2 습도 공기 분위기에서 37 ° C에서 품 어.
    참고: 셀 약 4 일 후에 표시 되 고 8-9 일 후에 confluency를 도달.
  6. 셀 80 %confluency 도달, 6 잘 플레이트에서 미디어를 제거 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 2 개 mL로 씻어 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO2품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
  7. 완전 한 DMEM 미디어와 추가 실험에 대 한 저장소에 플라스 크를 통로 셀. 6 잘 플레이트 한 T-75 플라스 크에의 2 개의 우물에서 T-75 플라스 크 및 전송 셀 완전 한 DMEM 미디어의 15 mL를 추가 하 고 37 ° C 습도 공기 분위기와 5% CO2에서 품 어.

2입니다. DPSCs의 특성

  1. 형태소 분석을 수행 합니다.
    1. 씨 셀 (단계 1.6) 조직 문화에 플라스 크 (또는 6 잘 플레이트) 셀 형태를 관찰 하기 위해 적어도 8 구절에 대 한 완전 한 DMEM 매체에 코팅.
    2. 가벼운 현미경으로 세포를 시각화 하 고 구와 같은 셀 형태를 정의 합니다. 셀 문화 요리를 연결 하 고 스핀 들 모양의 세포 형태를가지고 해야 합니다.
      참고: 또는, 셀 수 수 경작 단일 셀으로 섬유 아 세포와 MSCs의 특정 특성은 식민지 형성 능력을 관찰을 잘 플레이트에 최대 14 일 동안.
  2. 표면 마커 분석을 수행 합니다.
    1. 1.7 단계에서 셀 trypsinize T-75 조직 배양 플라스 크에서 미디어를 제거 하 고 PBS의 2 개 mL로 씻어 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO2품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
    2. 1.5 mL 튜브에 실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 하 고 paraformaldehyde 제거 하려면 PBS 3 번 500 µ L로 그들을 씻어.
    3. PBS의 100 µ L에 4 ° C에서 1 시간을 위한 CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166, 및 CD73에 대 한 항 체와 고정된 셀을 품 어.
      참고: 사용 하는 항 체의 농도 0.5 µ g/mL. CD34, CD14, CD45 CD29, CD90, CD105, CD166, 및 CD73 MSCs에 대 한 긍정적인 세포 표면 표식으로 사용 하는 동안 부정적인 표식으로 사용 됩니다.
    4. 셀 3 회 PBS로 세척 하 고 fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), 등 각각 2 차 항 체를 사용 하 여 라벨에 대 한. 4 ° C에서 30 분 PBS의 100 µ L에 희석 1: 500 2 차 항 체와 세포와 PBS로 3 회 세척을 품 어.
    5. 샘플 흐름 cytometry 분석을 위해 어둠 속에서 유지 하 고 긍정적이 고 부정적인 얼룩 cytometry에 의해 감지.
      참고: 앞으로 및 측면 분산형을 흠 없는 제어 셀을 사용 합니다. 죽은 세포, 파편, 및 유엔 스테인드 인구를 제외 하 여 인구 스테인드 게이팅의 긍정적으로 정렬 합니다. 45 psi 칼 집 압력 100 µ m 노즐을 사용 하 여 고 10000 이벤트 채널을 정렬 하 여 긍정적인 DPSCs 결정를 수집 합니다.
  3. DPSCs의 차별화를 수행 합니다.
    1. 씨앗 1 × 10에 24-잘 접시에4 셀 DMEM 미디어를 완료 하 고 5% CO2습도 공기 분위기에서 37 ° C에서 24 h에 대 한 품 어.
    2. 차별화를 공식화 미디어를 사용 하 여 기본 미디어 DMEM 매체 경쟁. 100 nM dexamethasone, 10 m m β-glycerophosphate, 및 0.2 m m 의약품을 혼합 하 여 osteogenic 미디어를 준비 합니다. 혼합 하 여 1 × 인슐린-처리가-셀레늄 (ITS-G), 100 nM dexamethasone, 100 ng/mL 변형 시키는 성장 인자 beta (TGF-β), 의약품 14 μ g/mL, 1 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) chondrogenic 미디어를 준비 합니다. 100 nM dexamethasone, 5 μ g/mL 인슐린, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 그리고 60 μ M indomethacin을 혼합 하 여 adipogenic 미디어를 준비 합니다.
      참고: 차별화 미디어 보관할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 1 주일에 대 한.
    3. 2 주 동안 일주일에 두 번 osteo, chondro 또는 adipo genic 차별화 미디어 성장 매체 및 새로 고침 미디어를 변경 합니다.
    4. Von Kossa Alcian 블루 얼룩, 효소 활동 (알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동), immunocytochemistry, 및 프로토콜 앞에서 설명한21에 따라 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석 하 여 차별화를 확인 합니다.
      1. Von Kossa 수행 하 고 Alcian 블루 stainings 10 분에 대 한 실 온에서 4 %paraformaldehyde 고정 된 셀에 PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 칼슘 예금 관찰 하는 제조 업체의 권장 사항에 따라 vonKossa 키트와 함께 얼룩 .
      2. Alcian 블루 추가 얼룩에 대 한 3% (v/v) 초 산 100ml에 파란 Alcian 염료의 1.00 g을 용 해 하 여 솔루션 얼룩을 준비 합니다. PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 30 분 Alcian 블루 솔루션에 대 한 셀을 얼룩. 가벼운 현미경에 의해 스테인드 샘플을 시각화.

3. 조건 매체 (CM)의 준비

  1. CM 컬렉션 전에 신선한 완전 한 DMEM 24 h 단계 1.7에서에서 셀의 미디어를 바꿉니다.
    참고: 통로 2-4는 것이 좋습니다.
  2. 셀 도달 80 %confluency 교양된 DPSCs에서 조건 매체 (CM)를 수집 합니다. 폐 조직 재료와 세포 파편을 제거 하 5 분에 대 한 300 x g에서 수집 된 미디어 원심
    참고: 또는, 조건 매체에서 파편을 제거 하려면 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 합니다.
  3. 상쾌한 수집 하 고 추가 실험-20 ° C에서 저장.
    참고: 장기 저장을 위한-80 ° C에는 상쾌한을 유지.

4입니다. CM와 암 세포의 치료

  1. 세포 생존 능력 분석을 수행 합니다.
    1. 씨앗 PC-3 셀 (인간의 전립선 암 세포)의 5 × 103 셀/에 셀 밀도에서 96 잘 접시에 DMEM 고 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 습도 챔버에 품 어.
    2. 24 h에 대 한 완전 한 DMEM 혼합 10, 20, 30, 40, 및 CM (v/v)의 50%에 포함 된 셀을 취급 합니다.
    3. (MTS) 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium를 사용 하 여 세포 생존 측정-24이전에 설명 된 대로 시험.
  2. 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 분석을 수행 합니다.
    1. 6 잘 세포 배양 접시 2 × 105 셀 밀도에 셀/잘와 하룻밤에 37 ° C, 5% CO2 습도 챔버에 품 어에 씨 PC-3 셀.
    2. 혼합 20%와 CM (v/v) DMEM 매체를 완료 하 고 24 시간에 대 한 셀에 적용 합니다.
    3. 셀 trypsinize TUNEL 반응 혼합물 (솔루션 + 효소 솔루션, 키트와 함께 제공 된 라벨)의 50 μ에 중단 하 고 습도 하 고 5% CO2 분위기에서 60 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: trypsinization에 대 한 6-잘 세포 배양 배지에서 미디어를 제거, 1 mL의 PBS로 세척 및 추가 500 µ L의 트립 신. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO2품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 1 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
    4. PBS와 린스를 cytometry 사용 하 여 PBS에 세포를 분석 합니다.
  3. 정량 분석을 수행 합니다.
    1. 6 잘 세포 배양 접시 2 × 105 셀 밀도에 셀/잘와 하룻밤에 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에서 품 어에 씨 PC-3 셀.
    2. 혼합 20%와 CM (v/v) DMEM 매체를 완료 하 고 24 시간에 대 한 셀에 적용 합니다.
    3. Trypsinize 셀을 RNA 격리 및 cDNA 합성 펠 렛 셀을 수집 합니다.
      참고: 6 잘 세포 배양 배지에서 미디어를 제거 하 고 PBS의 1 mL로 씻어 trypsin의 500 µ L을 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분, 5% CO2를 품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 1 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
    4. 앞에서 설명한 프로토콜25에 따라 정량 실험 수행 합니다.
  4. 암 세포의 세포 마이그레이션을 수행 합니다.
    1. 씨앗 1 × 105 PC-3 12-잘 접시에 셀 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 습도 인큐베이터에서 품 어.
    2. 살 균 200 μ 팁 셀 긁 고 즉시 CM의 다양 한 농도 포함 하는 신선한 매체와 매체 변경 [예를 들어, 10, 20, 30, 40, 및 완전 한 DMEM 섞인 CM (v/v)의 50%].
    3. 거꾸로 현미경 흠집을 관찰 하 고 다른 시간 간격 (0, 24 h)에서 사진을 찍을.
    4. 수식을 사용 하 여 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 스크래치 폐쇄를 측정:
      figure-protocol-1
      참고: 이미지 J 소프트웨어와 함께 스크래치 이미지를 엽니다. 눈금 막대는 이미지에 이미 있는 동일한 크기를 가진 선을 그립니다. 클릭 분석, 규모, 설정 하 고 그려진 선의 확대 픽셀에서 거리를 관찰. 알려진된 거리 부분에 눈금 막대의 크기를 작성, 단위 (픽셀, cm, 등), 배열 하 고 확인을 클릭 합니다. 분석 섹션에 다시가 고 측정 클릭. 이 먼저 선택한 단위로 눈금 막대의 크기를 줄 것 이다. 처음의 한 가장자리에 클릭 하 고 처음의 다른 쪽 끝을 도달할 때까지 끕니다. (오와 24 h) 각 시간 점의 값 note 위의 공식에 이러한 값을 연결 하 고 스크래치 폐쇄를 계산.

5. 암 세포와 DPSCs의 간접적인 접촉에 의해 셀 마이그레이션

  1. 시드 3 × 104 DPSCs 0.4 μ m와 24-잘 플레이트 삽입에 기 공 하 고 37 ° c.에 하룻밤 습도 인큐베이터에서 품 어
  2. 씨 PC-3 셀에 24-잘 5 × 104 의 세포 조밀도에 플레이트 고 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 습도 인큐베이터에서 품 어.
  3. 살 균 200 μ 팁 PC-3 셀 스크래치, 신선한 매체와 매체를 변경 하 고 삽입 PC-3 셀에 DPSCs를 들고 장소.
  4. 거꾸로 현미경 세포를 관찰 하 고 셀 마이그레이션 분석을 다른 시간 간격 (0, 24 h)에서 사진을 찍을.

6. 공동 문화 분석 결과 및 Flow Cytometry 분석

  1. PC-3 셀 및 DPSCs PKH67 (녹색) 및 PKH26 (적색) 형광 셀 링커 염료, 각각26사용 하 여 레이블을 지정 합니다.
  2. Trypsinize PC-3와 DPSCs 세포, 각각. T-75 조직 배양 플라스 크에서 미디어를 제거 하 고 PBS의 2 개 mL로 씻어 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO2품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
  3. 5 분 x 300g에 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 및 셀 펠 릿 키트에서 제공 하는 희석제 C 버퍼에 염료 해결책에서 resuspend ( 재료의 표참조).
  4. 10 분 동안 염료 용액에 세포를 품 어와 FBS의 100 µ L을 추가 하 여 착 색 반응 종료. 5 분 x 300g에 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 공동 경작 하기 전에 완전 한 성장 매체를 가진 세포를 씻어.
  5. 셀 표시 판 (5 × 104/잘) 1:1 비율로 (DPSCs: PC3) 6-잘 접시에. 완전 한 DMEM에 공동 경작된 한 세포를 유지 합니다.
  6. 24 시간 또는 48 h 인큐베이션 기간 후 5 분 및 PBS로 세척에 대 한 300 x g에서 셀의 원심 분리에 의해 세포를 수집 합니다.
  7. 300 µ L 하단 흐름 cytometry 튜브 라운드 5 ml에서 (FACS) 버퍼를 정렬 하는 형광 활성화 셀의 셀 resuspend 샘플 분석 전에 오른쪽 셀 집계를 분산 소용돌이.
  8. 45 psi 칼 집 압력 100 µ m 노즐을 사용 합니다.
    참고: 매우 높은 유량 형광 검출의 감도 줄일 수 있습니다.
  9. 흠 없는 컨트롤 셀과 단일 색된 셀 사용 하 여 적절 한 앞으로 세포 유형 및 보상 듯이27사이드 분산형 레이저 전압 조정.
    참고: 사용 하 여 라이브 셀 게이팅 세포 파편, 죽은 세포, 또는 집계 제외 하.
  10. FL-1 (녹색) 및 플로리다-2 (레드) 채널을 정렬 하 여 % 긍정적인 녹색 DPSCs 및 빨간 PC-3 셀 결정 10000 이벤트 (100000 바람직합니다) 수집.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

그림 1 문화 조건 하에서 DPSCs의 일반적인 MSC 특성 묘사. DPSCs (그림 1B) 도금 후 구와 같은 세포 형태학을 발휘 한다. MSC 표면 항 원 (CD29, CD73, CD90, CD105, 및 CD166)은 매우 조 혈 마커 (CD34, CD45, 및 CD14) 동안 표시는 부정적인 (그림 1C). 형태학 및 분자 수준에서 변경 내용을 관련 osteo-chondro-, 그리고 adipo genic 차별화는 DPSCs 문화 차별화 칵테일 응용 (그림 1D)뒤에서 관찰 된다.

전립선 암 세포 증식 및 마이그레이...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

종양 환경 MSCs의 기여는 하이브리드 세포 생성을 통해 세포 융해, 줄기 세포와 암 세포28사이 entosis 또는 cytokine 및 chemokine 활동을 포함 한 여러 가지 상호 작용에 의해 통제 된다. 구조 조직, 세포 세포 상호 작용 및 분 비 종양 승진, 진행, 및 주위 조직 전이 암 셀 동작을 결정 합니다. 적절 한 비보 전 모델 시스템 상주 세포 인구의 상호 작용의 뒤에 기계 장치를 조사 하는 암 진행과 전이 대 한 셀룰러 통신을 이해 해야 합니다.

우리는 전립선 암과 치과 줄기 세포 상호 작용에 대 한 모델 시스템을 만드는 DPSCs를 사용. 성체 줄기 세포의이 유형의 장점은 조직 소스와 쉽게 격리 단계 접근입니다. 다른 한편으로, 잘 알려진 성인 줄기 세포 종류와 비교 하지 않고 DPSCs만을 사용 하 여이 프로토콜의 한계입니다. 현재 공동 문화 방법 paracrine 신호 수용 성 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 Yeditepe 대학에 의해 지원 되었다. 모든 데이터 및이 문서에서 사용 되는 그림34이전에 게시 했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMInvitrogen11885084세포 배양용
FBSInvitrogen16000044세포 배양용
PSALonza17-745E세포 배양용
TrypsinInvitrogen25200056세포 해리용
PBSInvitrogen10010023세척용
DexamethasoneSigmaD4902분화 매체의 구성
요소&베타;-글리세로인산시그마G9422골형성 분화 매체의 구성
아스코르브산시그마A4544골 및 연골 분화 매체의 구성
요소 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS &마이너스; G)Invitrogen41400045연골 생성 분화 매체
TGF-&betaSigmaSRP3171연골 분화 매체의 구성
인슐린SigmaI6634지방 생성 분화 매체의 구성
이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴 (IBMX)SigmaI7018지방 생성 분화 매체의 구성
IndomethacinSigmaI7378지방 생성 분화 매체의 구성
MTS 시약PromegaG3582세포 생존율 분석
TUNEL 분석Sigma11684795910Apoptotic 분석
24웰 플레이트 인서트Corning3396트랜스웰 이동 분석용
PKH67SigmaPKH67GL공동 배양 세포 염색용
PKH26SigmaPKH26GL공동 배양 세포 염색용
파라포름알데히드SigmaP6148세포 고정용
von Kossa KitBioOptica04-170801.A세포 염색(분화)
Alcian blueSigmaA2899세포 염색(분화)용
염 요소 의 구성 요소; 요소 요소 요소 요소

참고문헌

  1. Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  2. Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
  3. Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
  4. Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
  5. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
  6. Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
  7. Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140(2010).
  8. Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
  9. Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106(2013).
  10. Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
  11. Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139(2007).
  12. Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
  13. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  14. Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
  15. Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
  16. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  17. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839(2015).
  18. Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
  19. Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
  20. Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
  21. Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849(2012).
  22. Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
  23. Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105(2010).
  24. Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
  25. Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
  26. Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
  27. Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719(2007).
  28. Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28(2017).
  29. Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  30. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
  31. Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
  32. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  33. Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
  34. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문