Summary
我们提供了基于直接和间接共培养方法评估从牙髓和前列腺癌细胞相互作用中分离出的间充质干细胞的方案。条件介质和反井膜适用于分析间接副胺活性。一起播种不同染色细胞是直接细胞相互作用的合适模型。
Abstract
癌症作为一个多步骤的过程和复杂的疾病, 不仅受单个细胞增殖和生长的调节, 还受肿瘤环境和细胞相互作用的控制。癌症和干细胞相互作用的识别, 包括细胞外环境的变化、身体的相互作用和分泌的因素, 可能有助于发现新的治疗方案。我们结合已知的共培养技术, 建立了间充质干细胞 (mscs) 和癌细胞相互作用的模型系统。在目前的研究中, 牙髓干细胞 (dpscs) 和 pc-3 前列腺癌细胞相互作用的直接和间接共培养技术进行了研究。利用从 dpscc 和0.4μm 孔径反井膜中获得的条件介质 (cm) 研究了副井活性。对不同细胞类型的共培养进行了研究, 以研究细胞直接相互作用。结果表明, cm 能增加前列腺癌细胞培养中细胞增殖, 减少细胞凋亡。cm 和经井系统都提高了 pc-3 细胞的细胞迁移能力。用不同的膜染料染色的细胞被播种到同一培养容器中, dpscs 在这种直接共培养条件下参与了与 pc-3 细胞的自组织结构。总体而言, 结果表明, 共培养技术可用于癌症和 msc 相互作用作为一个模型系统。
Introduction
间充质干细胞 (mscs) 具有分化能力, 有助于骨髓、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等间充质组织的再生, 几乎从成人体内的所有组织中分离出 1,2. 除了在慢性炎症或损伤的情况下通过产生常驻细胞来提供组织稳态外, 它们还产生重要的细胞因子和生长因子, 以协调血管生成、免疫系统和组织重塑3。骨髓间充质干细胞与肿瘤组织的相互作用尚不清楚, 但积累的证据表明, 骨髓间充质干细胞可能促进肿瘤的发生、进展和转移4。
骨髓间充质干细胞对受伤或长期发炎区域的归巢能力使其成为干细胞治疗的宝贵候选。然而, 癌症组织, "永远不会愈合伤口", 也释放炎性细胞因子, 亲血管生成分子, 和重要的生长因子, 吸引骨髓间充质干细胞到癌变区 5.虽然有有限的报告显示骨髓间充质干细胞对癌症生长的抑制作用 6,7, 他们的癌症进展和转移促进的影响已被广泛报道8。骨髓间充质干细胞以不同的方式直接或间接地影响致癌, 包括抑制免疫细胞、分泌支持癌细胞增殖和迁移的生长因子细胞因子、增强血管生成活性和调节上皮间充质转变 (emt)9,10。肿瘤环境由多种细胞组成, 包括与癌症相关的成纤维细胞 (caf) 和肌成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和免疫细胞11。其中, caft 是肿瘤区最丰富的细胞类型, 分泌各种促进癌症生长和转移的趋化因子8。研究表明, 骨髓源性骨髓间充质干细胞可在肿瘤基质12中分化为 caf。
牙髓干细胞 (dpscs), 被描述为第一个牙科组织衍生的骨髓间充质干细胞由 gronthos等人.13在 2000年, 然后被广泛调查的其他 14,15, 表达多能标记, 如oct4, sox2, 和nanog16 , 并可以分化为各种细胞链17。基因和蛋白质表达分析证明, dpsc 产生的生长因子/细胞因子水平与其他骨髓间充质干细胞相当, 如血管内皮生长因子 (vegf)、血管生成素、成纤维细胞生长因子 2 (fgf2)、白细胞介素-4 (il-4)、il-6、il-10、和干细胞因子 (scf), 以及 fms 样酪氨酸激酶-3 配体 (flt-3l), 可能促进血管生成, 调节免疫细胞, 并支持癌细胞增殖和迁移18,19,20.虽然骨髓间充质干细胞与癌症环境的相互作用已在文献中得到了充分的记录, 但 dpscs 与癌细胞之间的关系尚未得到评估。在本研究中, 我们建立了高度转移性前列腺癌细胞系 pc-3 和 dpscs 的共培养和条件培养基治疗策略, 提出了牙科骨髓间充质干细胞机制在癌症进展和转移中的潜在作用。
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Protocol
经机构道德委员会批准后, 获得了患者的书面知情同意。
1. dpsc 隔离和培养
- 从17至20至20至15毫升的年轻成年人身上获得的智齿含有完整的 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) [低葡萄糖 dmem 培养基, 辅以10% 的胎牛血清 (fbs) 和1% 青霉素/两性霉素 (psa) 溶液], 切除后8小时内。在转移过程中保持组织材料的低温 (4°c), 以避免潜在的细胞死亡。
- 通过无菌拔模从牙齿中心小心地取出牙髓组织, 将纸浆组织放入冷完全 dmem 培养基中的10厘米组织培养盘中, 用手术刀将其切成小块 (2-3 毫米)。
注: 所有实验程序应在层状流动罩的无菌条件下进行。这种非酶法技术以前曾使用过 21、22、23. - 将小纸浆组织放置在经过6孔的组织培养中, 并添加200μl 的完整 dmem 培养基, 以覆盖每个小纸浆组织件。
- 在加湿空气中 (80% 湿度) 用5% 的 co2 培养组织培养井, 以提供组织附着.
注: 通过控制介质的蒸发, 此步骤可以延长到3-4小时。 - 将适当体积的完整 dmem 介质加入井中, 并在37°c 的加湿空气中孵育, 使细胞从组织中扩散到5% 的 co2 中.
注: 细胞在大约4天后变得可见, 并在8-9 后达到融合。 - 当细胞达到80% 的融合度时, 从6孔板中取出介质, 用2毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗, 并添加2毫升的胰蛋白酶。在37°c 加湿空气和 5% co 2 的孵化器中孵育 2分钟.然后加入2毫升的完整 dmem 培养基, 然后进行2分钟的孵育, 抑制胰蛋白酶。以 300 x g 离心细胞5分钟来颗粒细胞。
- 将细胞传送到完整的 dmem 介质中的烧瓶, 并存储以进行进一步的实验。将15毫升的完整 dmem 介质添加到 t-75 瓶中, 并将细胞从6井板的两口井转移到一个 t-75 烧瓶中, 在37°c 时在加湿空气和 5% co 2 中孵育.
2. dpsc 的特性
- 进行形态分析。
- 在完整的 dmem 培养基中, 组织培养中的种子细胞 (步骤 1.6) 涂覆烧瓶 (或6孔板), 以观察细胞形态。
- 用光学显微镜观察细胞, 并定义类似成纤维细胞的细胞形态。细胞应附着在培养皿上, 并具有类似纺锤状的细胞形态。
注: 或者, 细胞可以作为单细胞在井板中培养长达 14天, 以观察菌落形成能力, 这是成纤维细胞和骨髓间充质干细胞的一个特定特征。
- 执行曲面标记分析。
- 从步骤1.7 中对细胞进行胰化。从 t-75 组织培养瓶中取出培养基, 用2毫升的 pbs 清洗, 并添加2毫升的胰蛋白酶。在37°c 加湿空气和 5% co 2 的孵化器中孵育 2分钟.然后加入2毫升的完整 dmem 培养基, 然后进行2分钟的孵育, 抑制胰蛋白酶。以 300 x g 离心细胞5分钟来颗粒细胞。
- 将细胞在室温下用4% 的甲醛固定 20分钟, 然后用500μl 的 pbs 清洗 3次, 去除甲醛。
- 在100μl 的 pbs 中, 用抗 cd29、cd34、cd45、cd90、cd105、cd166 和 cd73 的抗体对固定细胞进行1小时的培养。
注: 所使用的抗体浓度为0.5μg/ml。cd34、cd14 和 cd45 被用作阴性标记, cd29、cd90、cd105、cd166 和 cd73 被用作骨髓间充质干细胞的阳性细胞表面标记。 - 用 pbs 清洗细胞 3次, 并使用相应的二级抗体, 如荧光素异硫氰酸酯 (fitc)、植物菊酯 (pe)等进行标记。在4°c 下, 用 1: 500 稀释的二级抗体在100μl 的 pbs 中培养细胞 30分钟, 并用 pbs 清洗3次。
- 保持样品黑暗中的流式细胞术分析, 并通过流式细胞术检测阳性和阴性染色。
注: 使用未染色的控制单元排列向前和侧面散射。通过排除死细胞、碎片和未染色的种群, 安排对呈阳性染色的种群进行门控。使用具有 45 psi 护套压力的100μm 喷嘴, 并收集 10, 000个事件, 通过安排通道来确定阳性的 dpscc。
- 执行 dpscs 的差异化。
- 在完整的 dmem 介质中将 1x10 4个细胞播种到24孔板上, 并在具有 5% co2 的加湿空气中在 37°c孵育 24小时.
- 以竞争 dmem 介质为基础介质, 制定差异化介质。通过将 100 nm 地塞米松、10 mm β-甘油磷酸盐和 0.2 mm 抗坏血酸混合制备成骨培养基。通过混合1x 胰岛素-转移素-硒 (its-g) 制备软骨素介质, 100 nm 地塞米松、100 ng/ml 转化生长因子β (tgf-β)、14μgml 抗坏血酸和 1 mg/ml 牛血清白蛋白 (bsa)。通过混合 100 nm 地塞米松、5μgml 胰岛素、0.5 mm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (ibmx) 和 60μm-消炎痛制备取代素介质。
注: 差异化介质可在4°c 下保持至少一周。 - 将生长介质转变为骨源性、软骨性或脂肪源性分化培养基, 并在两周内每周两次刷新培养基。
- 根据前面描述的协议 21, 通过冯·科萨和阿尔西恩蓝染色、酶活性 (碱性磷酸酶活性)、免疫细胞化学和定量聚合酶链反应 (qpcr) 进行分析, 确认分化。
- 在室温下用4% 的甲醛固定10分钟的细胞上进行冯·科萨和阿尔西恩蓝色污渍, 用 pbs 清洗固定细胞, 并根据制造商的建议用 vonkossa 试剂盒对其进行染色.
- 在 3% (v/v) 醋酸的100毫升中溶解1.00 克的 alcian 蓝染色溶液, 以进一步染色。用 pbs 清洗固定细胞, 用 alcian 蓝色溶液清洗30分钟。用光学显微镜观察染色样品。
3. 条件介质 (cm) 的制备
- 在 cm 收集之前24小时将步骤1.7 中的单元格介质替换为全新的完整 dmem。
注: 建议通过2-4。 - 当细胞达到80% 的融合时, 从培养的 dpscs 中收集条件培养基 (cm)。离心机以 300 x g 收集培养基 5分钟, 以去除废弃的组织材料和细胞碎片。
注: 或者, 使用0.2μm 注射器过滤器去除条件介质中的碎片。 - 收集上清液并储存在-20°c, 以便进行进一步的实验。
注: 将上清液保持在-80°c, 以便长期储存。
4. cm 治疗癌细胞
- 执行细胞活力分析。
- 种子 pc-3 细胞 (人前列腺癌细胞) 到96孔板上, 细胞密度为 5x10 3 细胞在完整的 dmem 中, 在37°c 和 5% co2 的加湿室中孵育 24小时.
- 用10、20、30、40和50% 的 cm (v/v) 与完整的 dmem 混合24小时治疗细胞。
- 通过使用 3-(4, 5-二-噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h-四锆 (mts)-检测, 如前所述24。
- 进行端生脱氧核苷酸转移酶 dutp 标记端标记 (tunel) 分析。
- 种子 pc-3 细胞在细胞密度为 2x105细胞的6井细胞培养板上, 在37°c 和 5% co2 的加湿室中孵育.
- 将 20% cm (v2) 与完整的 dmem 介质混合, 并应用于细胞24小时。
- 胰蛋白酶体细胞并悬浮在50微米的 tunel 反应混合物中 (标记溶液 + 酶溶液, 随试剂盒一起供应), 并在37°c 下在加湿和5% 二氧化碳气氛中孵育60分钟。
注: 对于胰蛋白酶, 从6井细胞培养板中取出介质, 用1毫升的 pbs 清洗, 并添加500μl 的胰蛋白酶。在37°c 加湿空气和 5% co 2 的孵化器中孵育 2分钟.加入1毫升的完整 dmem 培养基, 然后孵育 2分钟, 以抑制胰蛋白酶。以 300 x g 离心细胞5分钟来颗粒细胞。 - 用 pbs 冲洗, 并使用流式细胞术分析 pbs 中的细胞。
- 执行 qpcr 分析。
- 种子 pc-3 细胞在细胞密度为 2x105细胞井的6井细胞培养板上, 在37°c 和 5% co2 的加湿孵化器中孵育.
- 将 20% cm (v2) 与完整的 dmem 介质混合, 并应用于细胞24小时。
- 胰蛋白酶细胞和收集细胞颗粒用于 rna 分离和 cdna 合成。
注: 从6井细胞培养板上取出介质, 用1毫升的 pbs 清洗, 并添加500μl 的胰蛋白酶。在37°c 加湿空气和 5% co 2 的孵化器中孵育 2分钟.加入1毫升的完整 dmem 培养基, 然后孵育 2分钟, 以抑制胰蛋白酶。以 300 x g 离心细胞5分钟来颗粒细胞。 - 根据前面描述的协议25执行 qpcr 实验.
- 执行癌细胞的细胞迁移。
- 将 1x105个pc-3 细胞种在12孔板上, 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器中孵育过夜.
- 用无菌200μl 尖端刮伤细胞, 用含有各种浓度 cm 的新鲜培养基立即更换培养基 [例如, 10、20、30、40和50% 的 cm (v/v) 与完整的 dmem 混合]。
- 观察倒置显微镜下的划痕, 并在不同的时间间隔 (0 和 24小时) 拍照。
- 使用使用的公式使用图像 j 软件测量划痕闭合:
注: 使用图像 j 软件打开划痕图像。绘制一条与图像中已存在的刻度栏具有相同大小的线。单击 "分析"、"设置比例", 并以像素为单位观察距离, 作为绘制线的放大倍数。将刻度栏的大小写入已知的距离部分, 排列单位 (像素、厘米等), 然后单击 "确定"。再次转到分析部分, 然后单击测量值。这将首先给出比例栏的大小作为选定的单位。单击划痕的一个边缘并拖动, 直到到达划痕的另一端。请注意每个时间点 (0 小时和 24小时) 的值。将这些值插入上面的公式, 并计算临时闭包。
5. 癌细胞和 dpsc 间接接触的细胞迁移
- 种子 3x104 dpscc 到24孔与0.4μm 孔插入和孵育在一个加湿孵化器过夜在37°c。
- 将 pc-3 细胞种子到细胞密度为 5x10 4 的24孔板上, 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器中孵育.
- 用无菌200μl 尖端划伤 pc-3 细胞, 用新鲜介质更换培养基, 并将携带 dpscs 的插入物放置在 pc-3 细胞上。
- 在倒置显微镜下观察细胞, 并在不同的时间间隔 (0 和 24小时) 拍摄照片, 以分析细胞迁移。
6. 共培养检测和流式细胞术分析
- 用 pkh67 (绿色) 和 pkh26 (红色) 荧光细胞链接染料标记 pc-3 细胞和 dpsc,分别为 26。
- 分别对 pc-3 和 dpscs 细胞进行胰蛋白酶化。从 t-75 组织培养瓶中取出培养基, 用2毫升的 pbs 清洗, 并添加2毫升的胰蛋白酶。在37°c 加湿空气和 5% co 2 的孵化器中孵育 2分钟.加入2毫升完整的 dmem 培养基, 然后孵育 2分钟, 以抑制胰蛋白酶。
- 以 300 x g 离心细胞 5分钟, 丢弃上清液, 并在试剂盒提供的稀释剂-c 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒 (见材料表)。
- 在染料溶液中培养细胞 10分钟, 并通过添加100μl 的 fbs 终止染色反应。以 300 x g 离心细胞 5分钟, 丢弃上清液, 用完整的生长介质清洗细胞, 然后再共同培养。
- 板标记单元 (5x104/井) 到6孔板上, 比例为 1:1 (dpss:pc3)。在完整的 dmem 中保持共培养细胞。
- 通过在 300 x g 的细胞离心5分钟并使用 pbs 清洗, 在24小时或48小时潜伏期后收集细胞。
- 在5毫升圆形底流式细胞术管中的300μl 荧光活化细胞分选 (facs) 缓冲液中再利用细胞。涡流在样品分析前就分散细胞聚集。
- 使用具有 45 psi 护套压力的100μm 喷嘴。
注: 极高的流速可能会降低荧光检测的灵敏度。 - 如前面所述, 使用未染色的控制单元和单色电池来调整适当的向前和侧面散射激光电压, 以适应电池类型和补偿。
注: 对活单元使用门控以排除单元格碎片、死细胞或聚合。 - 通过安排 fl-1 (绿色) 和 fl-2 (红色) 通道, 收集 10, 000个事件 (100, 000个是最好的), 以确定呈阳性的绿色 dpscc 和红色 pc-3 细胞的百分比。
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Representative Results
图 1描述了在培养条件下 dpscs 的一般 msc 特征。dpsc 在电镀后发挥成纤维细胞样细胞形态 (图 1b)。msc 表面抗原 (cd29、cd73、cd90、cd105 和 cd166) 表达强烈, 而造血标志物 (cd34、cd45 和 cd14) 为阴性 (图 1c)。在 dpsc 培养中观察到与骨、软骨和脂肪基因分化有关的形态和分子水平的变化, 然后是分化鸡尾酒的应用(图 1d)。
为了确定 dpscs 分泌分子对前列腺癌细胞增殖和迁移的活性, 我们应用从培养的牙科干细胞中收集的 cm, 并分析癌细胞的增殖和迁移行为。在 mts 细胞活力分析的基础上, 选择 cm 治疗方法 (20% vw)。采用 tunel 检测和 qpcr 分析, 对干细胞 cm 处理的 pc-3 细胞进行了 tunel 检测, 以确定在对照和实验条件下的细胞死亡和凋亡调节。我们的结论是, cm 治疗增加细胞活力和减少细胞死亡在 pc-3 细胞培养。采用体外细胞迁移法 (划伤法) 评估 dpscs cm 是否影响 pc-3 型癌细胞迁移。与24小时对照组相比, 浓度为10% 和 20% cm (v2) 的治疗显著增加了划痕闭合 (图 2)。同样, 20% cm (v/v) 治疗诱导细胞外基质蛋白基因表达的提高, 如胶原蛋白 i, 纤维连接蛋白, 和层压蛋白, 在细胞迁移中发挥着重要作用。
我们采用两种不同的培养技术, 在体外条件下建立 pc-3 细胞和 dpscs 的直接和间接共培养。选择了跨井系统, 为 pc-3 癌细胞创造了间接相互作用的环境。pc-3 细胞被播种在井板底部, 携带 dpscs 的插入物被放置在顶部。由于我们的目标是产生直接相互作用, 因此采用了孔径为0.4 微米的反井膜, 以防止 dpscs 的物理细胞从上半部分通过膜进入下半部分。与对照细胞相比, 来自 dpscc 的分泌分子显著增加了 pc-3 细胞的划痕闭合。与 dpscs 共培养的 pc-3 细胞表现出51% 的划痕闭合, 而控制细胞在24小时后有 38%的闭合 (图 3a)。采用含有 dpscc 和 pc-3 细胞1:1 比例的直接共培养方法, 分析干细胞和癌细胞的自组织。在显微镜下, 用红色和绿色的膜染料对细胞进行染色, 以区分不同类型的细胞。在24小时潜伏期后, 用红色荧光染料染色的 pc-3 细胞被 dpscs 包围, 形成管状结构。采用荧光染色的流式细胞仪对荧光染料染色的共培养细胞进行分析, 并检测细胞比。dpscs 和 pc-3 细胞创造了一个组织良好的结构, 其中 pc-3 细胞在48小时后迅速增殖(图 3b)。虽然细胞的种子比例相等 (1:1) 用于直接共培养, 但在48小时孵育后, pc-3 细胞的剂量为 62.22, 表明 pc-3 细胞的增殖率较高。
图 1: 牙髓干细胞 (dpscs) 的表征.(a) 从牙齿中心获得的纸浆组织。(b) dpscs 的纤维细胞样细胞形态. 比例棒: 100μm。(c) dpsc 流式细胞仪分析 cd29、cd73、cd90、cd105 和 cd 166 为阳性表面标记, cd14、cd34 和 cd45 为阴性表面标记。nc: 负对照 (生长介质处理细胞)。(d) 通过冯·科萨染色、alcian blue 染色和脂滴 (标尺: 200 微米) 证实 dpscs 与间质细胞类型的分化。骨钙素、ii 型胶原蛋白 (col ii) 和脂肪酸结合蛋白 4 (fabp4) 免疫染色显示出 dpsc 的骨、软骨和脂肪形成分化。这一数字改编自 dogan等人.34.请点击此处查看此图的较大版本.
图 2: 从 dpscc 中收集条件介质 (cm), 用于细胞活力和划痕分析.应用 tinel 阳性细胞减少了 20% cm (v/v)。划痕闭合的定量测量表明, cm 增加了 pc-3 细胞的迁移。cm: 有条件的媒介;nc: 负对照 (生长介质处理细胞)。* p < 0.05。这一数字改编自 dogan等人.34.请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 跨井细胞迁移检测和共培养方法.(a) 跨井共培养系统中的 pc-3 细胞划痕闭合。(b) 染色 dpsc (绿色荧光) 和 pc-3 细胞 (红色荧光) 在24小时和48小时共培养 (1:1 播种率) 后的相互作用模式。检测到较高的 pc-3 细胞数相对于 dpscs. 刻度柱: 200μm。这一数字改编自 dogan等人.34.请点击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
骨髓间充质干细胞对肿瘤环境的贡献受到多种相互作用的调节, 包括干细胞与癌细胞之间的混合细胞融合、昆虫病或细胞因子和趋化因子活性.结构组织、细胞相互作用和分泌因素决定了癌细胞在肿瘤促进、进展和转移到周围组织方面的行为。需要适当的体外模型系统来研究住院细胞群体相互作用背后的机制, 以了解细胞通信促进癌症进展和转移。
我们使用 dpscs 来创建前列腺癌和牙干细胞相互作用的模型系统。这种类型的成人干细胞的优势是组织源的可获得性和容易隔离的步骤。另一方面, 只使用 dpscs 而不与著名的成人干细胞类型进行比较是这一协议的一个局限性。目前的共培养方法分为直接和间接技术, 其中包括可溶性分泌分子的旁分泌信号和同一环境中不同细胞群的直接培养 29,30, 31岁采用全特征 dpscs 的 cm 对培养中介导的癌细胞生长的旁分泌信号进行了评价。cm 应用是细胞相互作用研究的最简单方法, 可以观察培养系统中的可溶性介质活性。虽然 cm 不是一个完全合适的模型系统, 但 cm 作为共培养方法的应用在体外观察细胞细胞相互作用是非常有效的。dpscs 的 cm 增加了前列腺癌细胞的增殖和迁移, 表明由于 dpscs 分泌的因素, 获得了转移性表型。
细胞相互作用的另一个模型是建立物理屏障, 如在细胞群之间的跨井膜 30.跨井系统分为两种类型: 一种是允许细胞通过毛孔运动的系统, 另一种是允许分泌因素转移的系统, 同时也阻碍了细胞通过膜的接触。我们使用孔径为0.4μm 的反井来分析 pc-3 划痕的闭合, 显示 dpsc 组的癌细胞迁移率高于对照细胞。
虽然 cm 和基于跨井的系统有利于简单地分析特定细胞类型32的贡献, 但在同一环境中直接培养不同亚群是必要的, 同时采用间接共培养方法。通过 msc 与癌细胞的直接共培养, 可以控制种子率, 很容易分析不同种群的结构组织。我们分别使用了绿色和红色荧光膜染料染色的 dpscs 和 pc-3 细胞的1:1 比例。dpsc 包围了 pc-3 细胞, 并在培养井中形成了类似管状的结构。pc-3 细胞以小岛的形式形成星团, 周围环绕着由 dpscc 生成的通道状结构。
最近, brunetti等人表示, dpsc 在成骨分化过程中分泌 tnf 相关凋亡诱导配体 (trail), 并影响骨髓瘤癌细胞的活力, 这表明牙科干细胞可能与癌症相互作用单元格33。我们的研究是第一个报告, 评估相互作用的牙科衍生骨髓间充质干细胞和前列腺癌细胞作为一个前活体模型。我们在实验中使用了三种不同的直接间接方法。通过 cm 和反井检测或通过共同培养允许多重相互作用的差异染色细胞检测到癌细胞的增殖和高迁移率。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了叶迪特佩大学的支持。本文中使用的所有数据和数字都是以前公布的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
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