Summary
نقدم هنا، بروتوكول للتحقق من صحة المجراة في العلاج الخلية على أساس المائية، يتضح من مثال زرع جزيرة ليلى. ح-أومينتال جزيرة مصفوفة ملء غرس (صاروخ موجه) يسمح غرس مزيج الخلية-المائية بين طبقات أومينتال، قرب الأوعية الدموية، إلى أقصى حد ممكن انجرافتمينت في بيئة التمثيل الغذائي سليم.
Abstract
الطب التجديدي استناداً إلى خلية العلاج يمثل أملا جديداً لعلاج المرض. وتشمل العقبات الحالية السليم في فيفو التحقق من كفاءة العلاج. لنقلها إلى الجهة المستفيدة، الخلايا غالباً ما تحتاج إلى أن تكون جنبا إلى جنب مع المواد الحيوية، لا سيما الهلاميات المائية. مع ذلك، يتطلب التحقق فعالية هذه طعم البيئة الصحيحة والمائية الصحيح والموقع حق المستفيد. قد يكون الثرب مثل هذا موقع. استناداً إلى المثال زرع جزيرة ليلى، قمنا بتطوير التقنية (ملء المصفوفة جزيرة ليلى ح Omental) صاروخ موجه، الذي يتكون من حقن الفساد داخل الأنسجة، ما بين طبقات أومينتال، تحسين غرس جزيرة ليلى والبقاء على قيد الحياة. لتحقيق هذا الهدف، الجزر الصغيرة يجب أن تكون جزءا لا يتجزأ في المائية مع لزوجة التي تمكن من حقن استخدام إبرة أتروماتيك. يتم تحميل المحاقن مع مزيج من المائية والجزر الصغيرة. حقن عدة يتم تنفيذها داخل الأنسجة أومينتال في مختلف نقاط الدخول، وترسب الخليط جزيرة ليلى/المائية على طول خط. نحن اختبار جدوى هذا النهج المبتكرة استخدام الخرز ديكستران. الخرز موزعة بشكل جيد في جميع أنحاء الأنسجة أومينتال، بالقرب من الأوعية الدموية. لاختبار فعالية الاختلاس، ونحن زرع جزيرات في الفئران السكري وإجراء متابعة ايضية أكثر من شهرين. الجزر زرع أظهرت ارتفاع معدل إعادة الأوعية الدموية حول وداخل الجزر الصغيرة، وعكس مرض السكري. تقنية صاروخ موجه يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من العلاج بالخلايا أو المائية، للخلايا ذات النشاط الأيضي عالية.
Introduction
خلية العلاج موضوع ساخن، كما أنها تهدف إلى علاج الأمراض استناداً إلى الطب التجديدي. قد درسنا العلاجات خلية ساعدت المواد البيولوجية متزايدة في السنوات الأخيرة، خاصة وأن زرع الخلايا غالباً ما يتطلب ناقل لنقل الخلايا من طبق الثقافة إلى المستلم. السقالات مادة بيولوجية هي شركات يحتمل أن تكون قيمة الخلية التي تفي بأدوار عدة1. ينبغي حماية الخلايا من الضغوط الميكانيكية ناقل مختصة وتوفير ظروف النمو المواتية، مثل عوامل أساسية للنمو وإفراز النفايات الأيضية وتبادل المواد الغذائية والأكسجين2.
من بين أنواع مختلفة من المواد الحيوية المستخدمة في العلاج بالخلايا، الهلاميات المائية لها العديد من المزايا. وهم متوافق حيويا، والقابلة للتحلل، وسهلة للتعامل معها، وتيسير نشر الأوكسجين3. وعلاوة على ذلك، يسمح التكنولوجيا الحالية باستخدام الهلاميات المائية لمساعدة الخلايا البقاء على قيد الحياة وانجرافت مع، على سبيل المثال، مكملات مع عوامل النمو أو مصفوفة خارج الخلوية البروتينات4.
يمكن حقن حاملات المائية التي تحتوي على الخلايا الجذعية كعلاج، العظام مثلاً التجديد5 والجهاز العصبي الأمراض6. هناك حاجة إلى زرع خلايا أيضي نشطة. أثناء التحقق من الصحة في المختبر للنهج ممكناً، تظل أدوات وتقنيات للتحقق من صحة المجراة في صقل.
زرع الخلية والمائية يمكن بسهولة يتم عن طريق الحقن تحت الجلد عندما يتم إجراء اختبارات توافق مع الحياة. ومع ذلك، عند الخلايا المطعمة تعنيه إجراءاتها الأيضية لتنظيم العوامل النظمية، هذا التعريب تحت الجلد ليس الأمثل، أساسا من حيث التصريف الوريدي7. ولذلك، توجد أية أدوات الحالية بسرعة وأمان وكفاءة تقييم الآثار المفيدة للمائية. استناداً إلى المثال زرع جزيرة ليلى، الأمر الذي يتطلب أن يتم الإفراج عن هرمونات في مجرى الدم من الفساد استجابة لمستويات السكر في الدم، قمنا بتطوير طريقة جديدة لزرع خلايا/المائية الحية.
الخطوة الأولى هي تحديد موقع زرع يقبلون، التي يمكن أن تقبل المائية مع الخلايا. الثرب يوفر مساحة كبيرة لغرس، درجة عالية من البلاستيك، وفي الأوعية الدموية الكثيفة جنبا إلى جنب مع الإعداد داخل مثيرة للاهتمام لدراسة وجود النشاط الأيضي عالية8خلايا. أننا بحاجة إلى إنشاء تقنية جراحية السماح بنقل الخلايا والمائية في الثرب التالي. مستوحاة من lipofilling المستخدمة في الجراحة التجميلية9، قمنا بتطوير جزيرة مصفوفة ح Omental ملء النهج (صاروخ موجه). يتم حقن الجزر جزءا لا يتجزأ من المائية داخل الأنسجة أومينتال. التقنية تهدف أيضا إلى توفير انجرافتمينت كحد أقصى عن طريق استخدام إفادات متعددة من خليط الخلية والمائية الأنسجة أومينتال، وفيها عدد كبير من الأوعية الدموية ويحسن أيضا الأوكسجين الاختلاس.
في الدراسة الحالية، ويصف لنا تقنية بسيطة ومبتكرة لغرس جزيرة ليلى بين أوراق أومينتال، داخل الأنسجة الدهنية الأقرب إلى الأوعية الدموية. وهذا يتكون من جراحة الغازية الصغيرة، التي يمكن أن تنجز تحت تنظير البطن، مع حقن الجزر الصغيرة الواردة في المائية في الأنسجة الدهنية. هذا الأسلوب ينطبق بسهولة إلى كافة التركيبات المائية والخلية التي تحتاج إلى اختبار في في بيئة أيضي وظيفي.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية "المعاهد الوطنية للصحة"، مع رقم الترخيص: ال/60/67/02/13.
1-إعداد المتلقي
-
حمل كيميائيا السكري في الفئران المستفيدة.
- حقن 75 مغ/كغ بالستريبتوزوتوسين (STZ، في م 0.1 العقيمة سترات المخزن المؤقت، الأس الهيدروجيني 4) إينترابيريتونيلي إلى10من الفئران.
ملاحظة: الدراسات الزرع، استخدمت الأسبوع عمره 6 لويس سلالة الفئران، يزن 150-190 جراما. - التحقق من حالة مرض السكري بقياسات جلوكوز الدم يوميا خلال الأيام الأربعة الأولى. حقن الأنسولين طويل المفعول 6 يو يوميا تحت الجلد عند الجرذان يحمل جليسيميا على 2 غرام/لتر منع مضاعفات مرض السكري، وفقدان الوزن، وحتى زرع بيليه الأنسولين.
- تشمل الفئران في الفوج عندما تكون التدابير اثنين من الذيل الوريد جلوكوز الدم > 4-5 جرام/لتر ليومين متتاليين، ومستوى الببتيد C < 200 م. قياس glycemia استخدام السكر وج-بيبتيديميا قبل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA).
- زرع الكريات الأنسولين تحت الجلد (انظر 1-2).
ملاحظة: علاج الأنسولين المزمنة يسمح تنظيم glycemia أفضل وتجنب مضاعفات السكري (والتي تزيد من حدة الإجهاد التأكسدي في موقع الزرع)11. وعلاوة على ذلك، يحفظ العلاج الدولة السكري جنبا إلى جنب مع منحنى نمو طبيعي (بدون فقدان الوزن المعتاد لاحظت في حيوان السكري). يمكن أن ينتج هذا وسادة الدهون أومينتال أكبر، ومثالي للقيام بزرع الأعضاء.
- حقن 75 مغ/كغ بالستريبتوزوتوسين (STZ، في م 0.1 العقيمة سترات المخزن المؤقت، الأس الهيدروجيني 4) إينترابيريتونيلي إلى10من الفئران.
-
زرع الأنسولين الكريات
- تخدير الفئران باستخدام غاز التخدير (isoflurane 3% في 500 مل/دقيقة س2) والفئران في موقف المعرضة.
- التحقق من حالة التخدير بالتحقق من عدم وجود رد الفعل (مخلب معسر). تنظيف الرقبة باستخدام اليود البوفيدون، وحلق المنطقة باستخدام شفرة حلاقة. تطبيق اليود البوفيدون مرة أخرى والسماح لها الوقوف لمدة 3 دقائق.
- 1.5 مكان الأنسولين الكريات (3 وحدات (U)/200 غ فأر) في محلول اليود البوفيدون مخفف 1:5 لتعقيم الكريات. بيرس الجلد العنق باستخدام تروكار ز 16 وإدراج بيليه باستخدام دليل مفروشة وستيليت. استرداد دليل وستيليت وغرزه نقطة واحدة. استخدام البوفيدون اليود لتنظيف غرزة.
ملاحظة: لا توجد إدارة الألم بعد الجراحة كان ضروريا كما كان التدخل شبيهة بحقنه تحت الجلد (SC) واحدة. - واسمحوا الفئران التعافي من التخدير، وضمان الحصول على الغذاء لتجنب نقص السكر في الدم الفئران.
- قياس مدى كفاءة بيليه بقياس الانخفاض glycaemia بعد زرع.
- التحقق من كفاءة بيليه برصد مستوى جليسيميا كل أسبوع لمدة شهر واحد.
- تشمل الفئران في الفوج عندما يتم الاحتفاظ مقياسا لمستوى الببتيد في الدم ج الوريد الذيل تحت 200 م شهر واحد بعد زرع بيليه الأنسولين.
ملاحظة: فحص مستويات الببتيد C إلزامي لتقييم الحيوانات في الأساس قبل الزرع والتأكد من حالتها السكري. منخفضة ج-الببتيد التجدد دائماً يحدث أثناء المتابعة. ج-بيبتيديميا أدنى إرشادي لتجديد أدنى.
2-صاروخ موجه: "ملء جزيرة مصفوفة" داخل أومينتال
-
جزيرة ليلى-مصفوفة إعداد المخلوط.
- تعد جزيرة لزج الناقل في غطاء الاندفاق الصفحي. حل مسحوق الجينات في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1.5%. تعقيم الإعداد بالمرور من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. إعداد 400 ميليلتر كل مستلم.
ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع من المائية مع لزوجة مناسبة للحقن عن طريق إبرة ز 21. - عزل جزيرة ليلى من الفئران لويس صحية (200-250 غم) كما هو موضح سابقا12.
- عد عدد جزيرة ايميا مكافئات (IEQ) (واحد IEQ يعتبر معادلاً لجزيرة ليلى البنكرياس يبلغ قطرها 150 ميكرومتر)13.
- في غطاء الاندفاق الصفحي، تحضير مختبرين مكافئ 7660-جزيرة ليلى (إيك) في أنبوب 1.5 مل.
- أغسل مختبرين الجزر الصغيرة مع 500 ميليلتر من متوسطة كمرل (كونوت مختبرات البحوث الطبية) مجاناً من مصل البقر الجنين.
- بيليه الجزيرات بالطرد المركزي (2 دقيقة في 500 x ز و 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
- إضافة 150 ميليلتر من الجينات المائية الناقل على الجزر، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ووضع المزيج على الجليد.
- إعداد أتراوماتيك ز 21 إبرة وحقنه 1 مل دون حجم القتلى قبل تحميل 150 ميليلتر من الجينات فارغة في المحاقن.
- ملء المحاقن مع الخليط من الجزر الصغيرة والجينات (150 ميليلتر، الحجم الإجمالي 300 ميليلتر). الاحتفاظ حقنه بالثلج.
- تعد جزيرة لزج الناقل في غطاء الاندفاق الصفحي. حل مسحوق الجينات في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1.5%. تعقيم الإعداد بالمرور من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. إعداد 400 ميليلتر كل مستلم.
-
إجراء العمليات الجراحية
- تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام التعقيم البارد (2% ستيرانيوس لمدة 20 دقيقة).
- تخدير الفئران باستخدام التخدير isoflurane والفئران في موقف المعرضة.
- يحلق في منطقة الرقبة باستخدام شفرة حلاقة وتعقيم المنطقة باليود البوفيدون. واسمحوا اليود الوقوف لمدة 3 دقائق.
- جعل شق استخدام مشرط وإزالة الكريات الأنسولين 1.5 استخدام الملقط. إغلاق الجلد باستخدام واحد أو اثنين من مراكز غرزة واحدة. لا تقم بإزالة الفئران من التخدير.
ملاحظة: بعد شهر واحد، يمكن أن يكون بيليه قابلة للتفتيت كما يمكن أن يتم التفاف بعض أنسجة تليفية الكريات؛ استخدام مقص تشريح عليه بشكل صحيح. - وضع الفئران في موقف ضعيف. حلاقة وتعقيم منطقة البريتوني (مع اليود البوفيدون). واسمحوا اليود الوقوف لمدة 3 دقائق.
- إنشاء فتح البطن 1.5 سم فقط تحت القص باستخدام مشرط. وضع الشاش الرطب العقيمة حول منطقة قطعي.
- تحديد الثرب الذي هو لوحة الدهون المترجمة بجوار المعدة. استخدام الملقط للقبض الثرب بعناية وتنسحب بلطف مع التجويف الصفاقى وانتشار على الشاش.
ملاحظة: الأنسجة أومينتال يمتد من الطحال إلى العفج وتعلق في منتصفه للمعدة. الثرب العادية من الفئران السكري يتلقون العلاج بالانسولين حوالي 2 cm ² عندما تنتشر في الشاش. - هيدرات الأنسجة أومينتال جيدا باستخدام 2 مل من المحلول الملحي العقيمة قبل حرارة 37 درجة مئوية. استخدام الملقط منحنى الصغيرة لمعالجة الأنسجة واختراق الحافة أومينتال بالإبرة بين طبقات أومينتال. أدخل الإبرة تماما.
- بدء ضخ إعداد جزيرة ليلى ببطء وعناية تحريك الإبرة إلى الخلف لحقن في الجزر الصغيرة في عدة أماكن (كالخطوط). قبل سحب الإبرة، ضمان أن توقف المائية تخرج الإبرة لتجنب الخسائر في الجزر الصغيرة المتناثرة.
- تكرار هذا التلاعب حسب الحاجة لحقن محتويات المحاقن باستخدام نقاط دخول مختلفة لتوزيعها الجزر الصغيرة في جميع أنحاء الأنسجة أومينتال بالكامل.
ملاحظة: بالنسبة للفئران، عموما هناك حاجة حقن أربعة إلى خمسة. - تحقق من أن الجزر الصغيرة ليست مجمعة في المحاقن في نهاية الحقن.
ملاحظة: إذا كانت بعض الجزر الصغيرة لا تزال مرئية، فمن الممكن أن تسحب الإبرة من المحاقن، ملء المحاقن مباشرة مع 100 ميليلتر من المائية الفارغة، وإعادة الإبرة. يمكن أن يتم إجراء جولة ثانية من الحقن لطرد الجزر الصغيرة المتبقية. - استخدام المحلول الملحي المعقم مرة أخرى لهيدرات الأنسجة أومينتال وجدار فتح البطن. استخدام الملقط لاستبدال الثرب في تجويف البطن بعناية.
- حقن 2 مل من المحلول الملحي العقيمة المعالجون مسبقاً في تجويف البطن ترطيب الفئران.
- إغلاق الجدار العضلات خياطة خيط مستمر باستخدام. ثم غرزة الطبقة الجلدية مع نقطة غرزة واحدة (نقطة بنقطة).
- ميلوكسيكام (1.5 مغ/كغ) حقن تحت الجلد كمسكن لمدة 5 أيام مرة واحدة في يوم.
- وضع الفئران في قفص على وسادة تدفئة حتى التعافي من التخدير. كرر هذا الإجراء لجميع الفئران المستفيدة.
- قياس جلوكوز الدم بعد الزرع كل يوم. إذا كان جليسيميا > 2 غرام/لتر، 6 يو الأنسولين طويل المفعول حقن تحت الجلد مرة واحدة في يوم.
- تقييم الدالة الاختلاس من glycemia ورصد ج-بيبتيديميا على مدى أشهر 1 أو 2.
ملاحظة: في حالات زرع ناجحة، ينبغي تحقيق الاستقرار جليسيميا خلال 2-5 أيام بعد زرع الأعضاء، والفئران يمكن أن تكون أقلعت الأنسولين.
3-أومينتال الفساد اكسبلانتيشن
ملاحظة: وسيسمح هذا الإجراء تأكيد وظيفة جيدة الاختلاس. بعد استرداد طعم الوظيفية، يجب إرجاع الفئران إلى حالة السكري. يتم إجراء هذه الخطوة بعد أشهر 1 أو 2 من متابعة الأيضية.
- تخدير الفئران مع غازات التخدير ووضعه في موقف ضعيف.
- حلاقة منطقة البريتوني وتعقيمها باستخدام البوفيدون اليود لمدة 3 دقائق.
- إنشاء فتح البطن 1.5 سم فقط تحت القص باستخدام مشرط. وضع الشاش الرطب العقيمة جميع أنحاء منطقة قطعي.
- تحديد الثرب، التي تقع بجوار المعدة. استخدام الملقط لتنتشر بعناية في الشاش.
- استخدام مقص للمكوس في الثرب. تبدأ من الجزء الذي تتمسك على ذيل البنكرياس (بجانب الطحال). في حالة حدوث نزيف، استخدام شاش معقم جاف لوقف ذلك.
- مواصلة الختان على طول الجزء يعلق على المعدة واسترداد الثرب.
ملاحظة: في هذا الموقع، يمكن أن يسبب الشرايين المعدي (الشكل 1) كمية كبيرة من النزيف إذا قطعوا بطريق الخطأ. شقوق الشريان لا مفر منها لاسترداد الاختلاس، ولكن النزيف يمكن إدارتها باستخدام الملقط وشاش. إذا كان يحدث هو قطع عرضي، ضغط بشدة مع شاش جافة والإبقاء على الضغط لمدة 1 دقيقة على الأقل. وينبغي وقف النزيف. إذا لم يكن الأمر كذلك، استخدام القصاصات أو استخدام بيستوري كهربائية لكوي السفن.
رقم 1: توزيع الشريان أومينتال. الثرب اكسبلانتيشن الاختلاس، يمثل المجال الحيوي يتألف من الشرايين المعدي باللون الأزرق. خلال استئصال هذا الجزء من الأنسجة أومينتال، يجب أن يكون الاهتمام بدفعها إلى المقطع الشريان المعدي الأيسر. يمكن استخدام ضغط أو حرف مزدوج أو الكي للحد من النزيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- معرفة ما إذا كان أي النزيف مستمرا. إذا لم يكن كذلك، حقن 2 مل من المحلول الملحي المعالجون مسبقاً، وإغلاق الفئران، وعملية كما هو موضح سابقا.
الحيوانات اكسبلانتيد العودة إلى حالة السكري. ومن ثم حقن الأنسولين (يو 6/SC/يوم) إلزامية لضمان الرفاه للحيوانات. - Euthanize الفئران 10 إلى 12 يوما بعد اكسبلانتيشن باستخدام جرعة زائدة من بينتوباربيتال (182.2 مغ/كغ).
4-نسيجية تحليل: توضع وتلطيخ ويوزين
- إصلاح أومينتا تم استردادها باستخدام بارافورمالدهيد 4% (PFA) وتضمين في البارافين.
- قطع المقاطع 4 ميكرومتر في سمك وتطبيق الهيماتوكسيلين ويوزين، ووصمة عار لتقييم الخصائص المورفولوجية للزرع.
5-إحصائية تحليل
- تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي والتدابير المتكررة تحليل التباين (ANOVA) مع اختبار الفرق أهمية صادقة في توكي كاختبار مخصصة بعد. تمثل القيم ف ك: *ف < 0.05؛ ف < 0.01؛ ف < 0.001.
Representative Results
الأسلوب صاروخ موجه تصاريح تجنب زرع داخل الأوعية والحبس للجزر الصغيرة في جهاز. الحد أقصى لوقت من 8-10 دقيقة مطلوب لإجراء زرع جزيرة كاملة، بما في ذلك التخدير، الذي وضع جدول زمني مماثل لزرع الكبد الكلاسيكية.
تم زرع حبات ديكستران لدراسة الطرق الجزيرات وتوزع داخل الأنسجة أومينتال، باستخدام الأسلوب صاروخ موجه (الشكل 2). يوم واحد بعد زرع، ضحى بها الفئران، وتم استرجاع الأنسجة أومينتال للتحليل النسيجي. توضع وتلطيخ ثم كشف عن توزيع الخرز في جميع أنحاء الأنسجة (الشكل 2، أسفل اليمين) بصورة موحدة. في كثير من الأحيان الخرز كانت قريبة من الأوعية الدموية ومزروع جيدا في الأنسجة الدهنية. فورا بعد زرع، يحدث فعل التهابية حول الخرز، أسفر عن إعادة ترتيب الأنسجة تداخل في الجزر الصغيرة في الأنسجة.
رقم 2: وصف لصاروخ موجه تقنية وحبه التوزيع عن طريق الأنسجة أومينتال يوم واحد بعد زرع. (أ) رسم توضيحي لتقنية صاروخ موجه. بعد التعرض (من يسار) للجهاز، تم حقن المزيج المائية جزيرة (محله هنا الخرز ديكستران زرقاء اللون للتصور أفضل) بعناية في النسيج إبرة أتروماتيك (أ، وسط) باستخدام. حبات مزروع في الأنسجة هي مرئية (ألف، حق). (ب) توضع وتلطيخ ويوزين من الثرب اكسبلانتيد يوم 1 بعد حقن حبة. تم العثور على الخرز في الأنسجة بتوزيع موحدة. شريط مقياس = 100 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقق من صحة هذا الأسلوب، أجرينا دراسات اسوي باستخدام الفئران لويس (n = 8). وتم رصد الفئران السكري تلقي زرع جزيرة ليلى (ما يعادل 7660 جزيرة ليلى، إيك) كل كغم من وزن الجسم الفئران باستخدام صاروخ موجه جليسيميا وبيبتيديميا ج لمدة شهرين. وتسيطر Glycemia غرس بيليه الأنسولين (كما تشهد أول انخفاض في جليسيميا ولاحظ في الشكل 3 ألف). وظيفة الاختلاس تجلى glycemia حوالي 2 غرام/لتر وج-بيبتيديميا > 500 م. قبل الزرع، كانت الفئران السكري (glycaemia > 5 غم/لتر، وجيم-بيبتيديميا < 200 م). بعد زرع الأعضاء واسترجاع بيليه الأنسولين، صيانة جليسيميا والتطبيع لوحظ فقط 3 أيام بعد صاروخ موجه زرع وأبقى حتى استرجاع الاختلاس (<p 0.05 مقارنة بزرع مستويات ما قبل). بعد اكسبلانتيشن أومينتال، جليسيميا ارتفع مرة أخرى إلى مستوى زرع قبل، مما يدل على الأداء الوظيفي للجزر الصغيرة التي تم زرعها بصاروخ موجه (الشكل 3A). كان العكس تماما، مع المنخفضة إلى مستويات لا يمكن الكشف عنها قبل الاختلاس، تليها زيادة والحفاظ على هذا المستوى زيادة طوال فترة الدراسة من نمط ج-بيبتيديميا (ف < 0.05)، وبعد أن اكسبلانتيشن أومينتال، ينخفض إلى ما قبل زرع مستويات (الشكل 3B). وكشف تحليل الثرب اكسبلانتيد بعلم الأنسجة الجزر الصغيرة جداً إعادة vascularized، الأكثر احتمالاً نتيجة لقربها من الأوعية الدموية (الشكل 3).
الشكل 3: متابعة شهرين الأيضية للفئران تلقي تقييم صاروخ موجه والاختلاس. جليسيميا (أ) القياس والتقييم (ب) ج-الببتيد بعد صاروخ موجه باستخدام الجينات كحاملة جزيرة ليلى (Tx: الزرع واسترجاع بيليه الأنسولين؛ اكسبلانتيشن: اكسبلانتيشن الثرب). ترقيع الوظيفية، كما هو مبين بالحفاظ على نورموجليسيميا بعد استرجاع بيليه الأنسولين وزيادة ج-بيبتيديميا بعد زرع جزيرة ليلى. المناطق المظللة الرمادية تمثل القيم المسجلة الحد الأدنى والأقصى عند كل نقطة في الوقت. (ج) توضع وتلطيخ ويوزين قسم أومينتال بعد زرع جزيرة ليلى باستخدام الأسلوب صاروخ موجه. الجزر الصغيرة اندماجاً جيدا في الأنسجة شهرين بعد زرع دون أي أنسجة تليفية المحيطة بها. السفن التي نمت حول وداخل الجزر، كما هو موضح بالأسهم، وهكذا تماما استعادة وظيفة جزيرة ليلى. كما يبدو مورفولوجية الجزر الصغيرة يتم الحفاظ عليها جيدا. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (n = 8) (*p < 0.05؛ * * ف < 0.01؛ * * * ف < 0.001 تحدد باستخدام التدابير المتكررة تحليل التباين (ANOVA) مع اختبار الفرق أهمية صادقة في توكي كاختبار مخصصة بعد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ويمكن إبراز بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولاً، يجب أن يكون الشخص إجراء الجراحة، والتلاعب الأنسجة الحساسة مع الأنسجة الدهنية، كما أنها هشة. سحق أو إلحاق الضرر بها في الثرب تحتاج إلى تجنبها. الثرب، كنسيج دفاعية، هو إثراء في الضامة والكريات البيضاء الأخرى. هذه الخلايا المناعية يمكن تفعيلها من خلال التلاعب المفرط، ويمكن أن تؤثر سلبا الاختلاس. وثانيا، الابتزاز (خليط ايميا-hydrogel) تحميل الأهمية أيضا. الشخص الذي يقوم بالإجراء الذي يجب تجنب وحدات التخزين الميت ويجب تحميل كل من خليط المائية-جزيرة ليلى في جهاز الحقن. فورا بعد هذه الخطوة، هو نقطة حرجة أخرى حقن نفسه. يجب أن يتم الحقن ببطء، بعناية ودقة. يجب أن يتم مسح المحاقن بالمائية الفارغة تحميلها في البداية لاسترداد أي من الجزر الصغيرة المتبقية. وثالثاً، خياطة ويجب أن يتم بعناية وفي خطوتين. يجب خياطة الخطة العضلي أولاً، مع الحرص على عدم خياطة الثرب مع العضلات، وينبغي أن تكون خياطة الجلد بشكل منفصل. فيما يتعلق بإجراءات اكسبلانتيشن الفساد أومينتال، ينبغي إيلاء اهتمام خاص في هذه اللحظة عندما يتم قطعي الشرايين القريبة من المعدة (الشرايين المعدي). من المهم أن تولي اهتماما لأي نزيف التي تحدث ووقفها قبل خياطة الحيوان، كأي يؤدي النزيف المستمر إلى وفاة الحيوان في غضون عدة أيام.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تكون ضرورية فيما يتعلق بالوسيلة لحمل الجزر الصغيرة؛ اختيار المائية متروك المجرب، طالما المائية القابلة للحقن. يمكن أن يؤدي استخدام مواد مختلفة في متغير graft الدالة (مع أو بدون مكملات، على سبيل المثال). الأسلوب الموصوفة هنا أثبتت كفاءتها لمادة خاملة زرع يشترك مع نسبة إلى جزيرة ليلى لايك 7660/كغ.
الأسلوب الحالي قد تكون محدودة بحجم أومينتال والخصائص المائية. لاستخدام نموذج القوارض السكري، علاج الأنسولين إلزامي قبل غرس جزيرة ليلى لتوفير مجال تطعيم كافية. السكري القوارض تفقد الكثير من الوزن وكتلة الدهون سبب STZ-التي يسببها مرض السكري. نظراً لوزن الحيوانات المسجلين في هذه الدراسة الصغيرة، تطعيم في منطقة أصغر حتى من غير الممكن.
المحافظة على إدارة glycemia السليم (قبل زرع استخدام الكريات، وبعد ذلك استخدام الأنسولين طويل المفعول) إلزامي. وهنا اخترنا للحفاظ على بيليه الأنسولين حتى يوم زرع لعدة أسباب. أولاً، الحفاظ على التحكم نسبة السكر في الدم السليم إلى حد كبير يقلل من الأكسدة الناجمة عن مرض السكري في الأجهزة المتلقية، التي يمكن أن تكون ضارة لجزيرة ليلى الاختلاس11 ويتيح استمرار علاج الأنسولين المكثف والمستلم إعداد الملاحظة في العيادة12. ثانيا، كنا نرغب في تحديد العدد الأقصى لإجراءات التخدير للفئران. وفيما يتعلق بتنفيذ العلاج بالانسولين أثناء متابعة الأيضية استخدام الأنسولين طويل المفعول، تجنب مخطط يستخدم مضاعفات هائلة بسبب التسمم (والتي يمكن أن تدمر الطعوم) والمحافظة على قيمة جليسيميا "حقيقية".
لمراقبة كفاءة الاختلاس، glycemia ليست معلمة ذات صلة في الأيام القليلة الأولى إذا الفئران يتم تلقي علاج الأنسولين استخدام الكريات. وهذا السبب في التحقق من مستوى الببتيد C السابقة عدة مرات زرع إلزامي. وتشمل هذه الأوقات في بداية الدراسة، لتحديد الحيوانات بعد حقن STZ، وثم السابقة فقط لزرع الأعضاء، لضمان بقاء الفئران السكري وأن التجديد الحد الأدنى.
الخصائص المائية أيضا مهمة. سوف تسرب السوائل المائية من الأنسجة أومينتال ولن تكون عالية اللزوجة المائية القابلة للحقن. اللزوجة المائية وإينجيكتابيليتي لفحصها قبل الاستخدام، ولكن يبدو من الضروري أيضا اختبار المواد مباشرة بالتقييم من جزيرة ليلى أو آخر بقاء الخلايا في المختبر. هنا، كالجزر الصغيرة حساسة جداً لنقص واستخدام الناقل عالية اللزوجة يمكن أن تؤثر على نشر الأوكسجين.
من حيث أهمية الأسلوب الموصوفة هنا فيما يتعلق بالأساليب القائمة، مزايا تقنية زرع الأنسجة داخل هذا المدى في إمكانية تكرار نتائج. هو أيضا أتروماتيك للأنسجة، وموقعها خارج الأوعية الدموية، يتجنب مخاطر النزيف وتجلط الدم. أيضا، عند النظر في زرع جزيرة ليلى، هو رد فعل فوري التهابات الدم بوساطة المتجنبة14. وعلاوة على ذلك، يسمح صاروخ موجه زرع الجزيرات إلى جهاز غير حيوية، خلافا لزرع الأعضاء في الكبد، والتي تمثل مخاطر فيما يتعلق بوظيفة الكبد15.
وقد المائية تحقيق الأداء الأمثل، أن تتكيف الخلايا فإنه سيحمل. استخدام عوامل النمو أو بروتينات معينة يمكن أن يكون لها تأثير إيجابي على الخلايا المزروعة16،17.
في الختام، يمكن استخدام هذا الأسلوب المجراة في التحقق من صحة من المائية على أنواع مختلفة من الخلايا، لا سيما عند الحاجة إلى بيئة الأيض نشطة، أما بالنسبة للجزر الصغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب الجراحي ينطبق على تطبيقات متعددة، ويمكن أن تكون، في المستقبل، سرعة قابل للتحويل إلى البشر، كما أنه يمكن تنفيذها بسهولة باستخدام تنظير البطن.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من منطقة الألزاس، بيوفاليي الألزاس بول بيوارتماتريكس-كقدم؛ 53/14/C1. الكتاب ممتنون للفريق للعلاقات العامة بروانت-رودير من ستراسبورغ فلورنسا تجمع للمساعدة في تطوير هذه التقنية المبتكرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
| Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
| CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
| C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
| Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
| Ethilon 4/0 | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
| Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
| Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
| Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
| Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
| NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
| Needle 26 G | TERUMO | 050101B | |
| Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
| Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
| Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
| Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
| Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |
References
- Bakhshandeh, B., et al. Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials. Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A.
- Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).
- Bai, X., et al. Bioactive hydrogels for bone regeneration. Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).
- Allbright, K. O., et al. Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration. Muscle Nerve. , (2018).
- Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation. Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).
- Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum. Circ Res. 41, 380-390 (1977).
- Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F.
- Schaschkow, A., et al. Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier. Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).
- Schaschkow, A., et al. Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model. Journal of diabetes research. 2016, 8310516 (2016).
- Schaschkow, A., et al. Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome. Biomaterials. 52, 180-188 (2015).
- Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study. Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).
- Leitao, C. B., et al. Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival. Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).
- Narang, A. S., Mahato, R. I. Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation. Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).
- Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. Hydrogels as carriers for stem cell transplantation. IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).
