Summary
לאחר בדיקת על-ידי דם חמצן-רמת-תלויי-פונקציונלי דימות תהודה מגנטית (fMRI מודגש) זה האזור המקביל של קליפת שדה חבית המגע (נקרא S1BF) כראוי מופעל, הראשי מטרתו של מחקר זה היא לכמת לקטט תוכן תנודות המוח עכברוש מופעל על ידי פרוטון מקומי תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה (1H-גברת) ב ט 7
Abstract
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה מציעה את ההזדמנות כדי למדוד מטבוליט מוחי תוכן ויוו , noninvasively. בזכות פיתוחים טכנולוגיים בעשור האחרון, הגדלת עוצמת השדה המגנטי, עכשיו זה אפשרי להשיג רזולוציה טובה ספקטרה ויוו במוח חולדה. Neuroenergetics (קרי, חקר המוח חילוף החומרים), במיוחד, מטבולית אינטראקציות בין סוגי תאים שונים משכו עניין יותר ויותר בשנים האחרונות. בין אלה אינטראקציות מטבולית, קיומו של שירות הסעות לקטט בין הנוירונים האסטרוציטים עדיין לדיון זה. זה, לפיכך, עניין רב לביצוע ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית תפקודית פרוטון (1H-גברת) במודל של עכברים של המוח הפעלה ולפקח לקטט. עם זאת, הפסגה לקטט מתיל חופף השומנים תהודה פסגות, קשה לכמת. הפרוטוקול המתואר להלן מאפשרת חילוף החומרים, לקטט תנודות כדי להיות במעקב באזור המוח מופעל. הפעלה מוחית מתקבל על ידי גירוי משערה ומתבצעת 1H-גברת בקליפת חבית מופעל המתאימים, שבאזור מזוהה באמצעות הדמיית תהודה מגנטית תפקודית דם חמצן-רמת-תלויי-(מודגש fMRI). כל השלבים מתוארים באופן מלא: הבחירה של חומרי הרדמה, סלילי, רצפים, להשגת גירוי יעיל משערה ישירות במגנט ולאחר עיבוד הנתונים.
Introduction
המוח בעל מנגנונים פנימיים המאפשרים ויסות המצע העיקרי שלה (כלומר, גלוקוז), על התרומה שלו וסילוק שלה, בהתאם וריאציות של פעילות מוחית מקומית. אמנם המצע האנרגיה העיקרי למוח גלוקוז, ניסויים שבוצעו בשנים האחרונות הראו לקטט זה, אשר מופק על ידי האסטרוציטים, יכול להיות המצע אנרגיה יעיל לתאי העצב. זה מעלה את ההשערה של לקטט מעבורת בין האסטרוציטים ו נוירונים1. המכונה ANLS, הסעות לקטט אסטרוציט-נוירון2, התיאוריה לדיון זה עדיין מאוד אבל הוביל ההצעה הסוכרים, ולא הולך ישירות לתוך הנוירונים, רשאים להיכנס האסטרוציטים, איפה זה עובר מטבוליזם לתוך לקטט, מטבוליט זה , הועבר לאחר מכן, הנוירונים, אשר משתמשים בו כמו אנרגיה יעיל המצע. אם כזה שירות הסעות קיים ויוו, הייתי מספר השלכות חשובות, על ההבנה של טכניקות בסיסיות הדמיה תפקודית מוחית (פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה [מחמד]) והן עבור פענוח שינויים מטבוליים נצפתה בפתולוגיות במוח.
ללמוד חילוף החומרים במוח, במיוחד, זמינות מטבולית אינטראקציות בין הנוירונים האסטרוציטים, ארבע טכניקות הראשי (לא כולל מיקרו-/ nanosensors): autoradiography, PET, מיקרוסקופיה קונפוקלית פלורסנט שני הפוטונים, גברת. Autoradiography היה באחת השיטות הראשונה המוצעת ומספק תמונות של הצטברות רדיואקטיבי 14C-2-deoxyglucose פרוסות המוח, בזמן חיית המחמד התשואות ויוו תמונות של תפיסה אזורית רדיואקטיבי 18 אזוריים F-deoxyglucose. יש להם שני החיסרון של באמצעות מולקולות irradiative תוך הפקת תמונות ברזולוציה נמוכה-מרחבית. מיקרוסקופ שני הפוטונים מספק הסלולר ברזולוציה של הגששים פלורסנט, אך פיזור אור על ידי רקמת מגביל עומק הדמיה. שלוש טכניקות אלה שימשו בעבר ללמוד neuroenergetics בחולדות במהלך משערה גירוי3,4,5,6. אין ויוו גברת יש יתרון כפול של להיות לא פולשנית, nonradioactive, ניתן לסייר כל מבנה המוח. יתר על כן, גברת יכול להתבצע במהלך ההפעלה עצביים, טכניקה שנקראת גב' פונקציונלי (fMRS), אשר פותחה לאחרונה ב מכרסמים7. לפיכך, מוצע פרוטוקול כדי לפקח על חילוף החומרים במוח במהלך פעילות מוחית על ידי 1H-גברת ויוו , noninvasively. ההליך המתואר עכברים בריאים למבוגרים עם הפעלה מוחית מתקבל על ידי גירוי משערה אוויר-פאף מבוצע ישירות imager תהודה מגנטית (MR) 7 T, אבל עשוי להיות מותאם בבעלי חיים מהונדסים, כמו גם בכל מצב פתולוגי .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ניסויים בבעלי חיים של פקודת מועצת הקהילות באירופה של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). הפרוטוקול פגש את ההנחיות האתית של משרד החקלאות הצרפתי והיערות, אושרה על ידי ועדות האתיקה המקומית (Comité d 'éthique יוצקים L' expérimentation Animale בורדו n ° 50112090-A).
הערה: במהלך המדידות מר, רמה נאותה של הרדמה וניטור פיזיולוגיים (טמפרטורת הגוף, קצב נשימה) הן דרישות הכרחיות.
1. בעלי חיים
- השתמש חולדות Wistar זכר במשקל בין 350 ו- 450 g.
- לשמור אותם על 12:12 מחזור אור h: כהה, לספק מזון ומים ad libitum.
2. הרדמה
- להכין את הציוד הדרוש עבור הרדמה (איור 1 א', ב', ראה טבלה של חומרים): מזרק 5 מ ל המכיל medetomidine בתמיסה תמיסת מלח פיזיולוגית (240 µg/kg/h, עם קצב זלוף של µL 20/min), המכיל מזרק 0.5 מ ל atipamezole (μL 20, ב- 0.5 מ ל תמיסת מלח), משחה העין.
הערה: שומר את כל הציוד מתחת למכסה המנוע extractor, למעט המזרק מ ל המכיל medetomidine, אשר ממוקם בתוך משאבת מזרק הקרוב למגנט עבור הרדמה במהלך מר רכישות. - למקם את החולדה בבית הבליעה אינדוקציה, להתחיל את ההרדמה על-ידי אספקת 4% איזופלוריין, להתאים את קצב זרימת חמצן כדי 1.5 ליטר/דקה.
- להעריך את עומק ההרדמה על-ידי הערכת הנסיגה של כף הרגל רפלקסים.
- כאשר העכבר אינו מגיב לגירוי, קח את זה מהקופסה הרדמה, למקם אותו על הספסל עם האף שלה במסכת איזופלוריין ולתחזק הרדמה על-ידי אספקת 2.5% חמצן ב- 1.5 ליטר/דקה.
- בעדינות לעסות את הזנב ולמקם את חוסם העורקים (איור 1C).
הערה: ניתן לבצע את העיסוי במים חמים, עם טמפרטורת בין 38 ל- 42 מעלות C, כדי לקבל יותר vasodilation של הורידים. - הכנס את היקפי תוך ורידי קטטר (22 גרם), בעבר heparinized, את תקחי את הזנב שמאלה או ימינה. שימו לב כי החזר ורידי נצפית (טיפת דם הוא גלוי בחלק הדיסטלי של המחט) כאשר הצנתר הוא כראוי מוכנס (איור 1D).
- לפוצץ את כל בועות האוויר נוכח שטח מת קטטר האחסון באמצעות המזרק 2 מ"ל המכילה פתרון תמיסת מלח פיזיולוגית, הפארין.
- להחיל את המשחה העין ולהכין את המזרק המכיל atipamezole (17 µg/mL) כדי לעורר את החולדה בסוף הניסוי.
3. עכברוש השמתם מגנט לגירוי שפם
- במקום יש חיישן נשימה על המיטה מגנט ולאחר מכן להעביר את החולדה מהספסל אל המיטה מגנט. למקם אותו במצב שכיבה עם האף שלה במסכה איזופלוריין, בעזרת חיישן נשימה הממוקם בין הצלעות המיטה מגנט.
הערה: כל הציוד הנכנס לחדר MRI צריך להיות MRI-בטוח. - להקטין את איזופלוריין (מ- 4% עד 1.5% – 2%) במהלך עכברוש השמה ולעבור את ההרדמה medetomidine בסופו של הליך זה. ודא נכון נכון חינם, שיש לחתוך את הקצה הימני בחזית של העכברוש MRI המיטה מראש כדי לאפשר תנועה של נכון.
- להחזיק את החולדה בעמדה עם קלטת ונטר את הנשימה אשר חייב להיות בין 60 ו 80 נשימות לדקה.
- להפוך מפרש זאת מלכודות שפם בסדר את הקלטת נייר (איור 2). יישר הצינור לשקע גמיש של מערכת אוויר-עלים לאורך העכברוש MRI המיטה כך החלק יציאה הצינור הוא בניצב, על-1.5 ס מ המפרש. . לתקן את זה עם טייפ נייר
4. שפם גירוי
- לחבר את הצינור הגמיש כניסת ממקור אוויר דחוס (בר 1) פקד סולנואיד קלט שסתום, צינור עודפים כדי הפלט שסתום בקרת ברז חשמלי (איור 3). להבטיח ברז חשמלי שליטה מחוץ לחדר מגנט.
- חבר את ההתקן הפועמת של ברז חשמלי וכן המגנט באמצעות הלוגיקה טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL)-יציאה. את תצורתה כך התדר בצים = 8 הרץ, הפעם בצים = 20 s, ואת הזמן מנוחה = 10 s.
הערה: פרמטרים אלה, דמיינו על הגביש הנוזלי קטן להציג מסך (LCD), מתכוונן באמצעות שלושת פוטנציומטרים וספרטני ייעודי. המכשיר הפועמת אלקטרונית, אשר שולטת הפרדיגמה, להיות מורכב של רכיבים אלקטרוניים באיכות גבוהה כדי למנוע כל הסחף בפרמטרים זמן (עבור postprocessing הנכון).
5. מודגש fMRI רכישה
- המקום במוח עכברוש, כך זה בתנוחה זקופה, השתמש בפסי האוזן כדי לתחזק אותו. מקם את הגליל מערך אמצעי האחסון מעל ראשו של החולדה (איור 4A) ותקן אותה באמצעות הקלטת. בדוק המפרש עוברת בצורה נכונה (anteroposterior תנועה ללא סיבוב, אין חיכוך של המפרש) כאשר מערכת אוויר-פאף היא מופעלת על; לאחר מכן, כבה את זה.
- הכנס את המיטה והגליל במרכז של המגנט. בדוק המפרש עדיין זז כראוי לאחר המיטה בתוך המגנט כאשר מערכת אוויר-עלים ; לאחר מכן, כבה את זה. להחליף לחלוטין בין איזופלוריין medetomidine (קצב זלוף: µL 20/min).
- בדוק כי החולדה טוב ממוקם באמצעות רצף לוקליזציה (טה = 2.5 ms; TR = 100 ms; ממוצע = 1; חזרה = 1; פרוסה = 1 מ מ; תמונה בגודל = 256 x 256; שדה ראייה (FOV) = 50 x 50 מ מ; סריקה זמן = 12 s 800 ms). לגרור את הכרטיסיה רצף מאתר ההוראה שם ולחץ על המשך.
- גרור את הכרטיסיה רצף T2_Star_FID_EPI שם הוראה, מרכז FOV על האמצע של המוח, ולחץ על הכרטיסייה התאמה פלטפורמה כדי לפתוח את ההוראה סריקה הערוך. להקליט את מפת0 B והמשך פחית הסריקה.
הערה: עבור מפת0 B, השתמש בפרמטרים הבאים: לראשונה אקו = 1.65 ms; TR = 20 ms, ממוצע = 1; הפוך זווית = 30 מעלות; אקו ריווח = 3.805 ms; פרוסה = 58 מ"מ; תמונה בגודל = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 מ מ; סריקה זמן = 1 מ' 24 גברת s 920 עבור סריקה הגבהה, השתמש בפרמטרים הבאים: עירור סלקטיבי voxel = דופק גאוסיאנית קיטור; טה = 5 מילי-שניות; ערבוב זמן = 10 ms; משך רכישת = 204.8 ms; רוחב פס = 10,000 הרץ; זמן להתעכב = 50 μs). - להתחיל את הרצף T2 Star_FID_EPI (טה = 16.096 ms; TR = 500 ms; ממוצע = 1; חזרה = 600; פרוסה = 1 מ מ; ארבע פרוסות רצופים; תמונה בגודל = 128 x 128; FOV = 20 x 20 מ מ; רוחב פס = 333,333.3 הרץ; סריקה זמן = s 5 דקות 00).
הערה: בשל הנמל TTL, אות טריגר חיצוני יתחיל מערכת אוויר-עלים באותו זמן. הפרדיגמה = [הפעלה s 20 + 10 s מנוחה] x 10, משך זמן הכולל הסריקות 600-500 ms עבור כל סריקה. הפרוסות מרוכזים על האמצע של אזור שדה חבית. - רוכשים עוד רצף לוקליזציה (כמו השלב שמתואר אחד 5.3) להשוות עם הראשון ולבדוק אם החולדה. עברה במהלך רצף T2_Star_FID_EPI.
- להביא את המיטה למיקומו הראשוני, להסיר את הגליל מערך אמצעי האחסון, וחבר את הגליל משטח.
6. מודגש עיבוד
- פתח את הקובץ T2 Star_FID_EPI ולקרוא את התמונה T2 Star_FID_EPI תמונותתצוגה. פתח את החלון סטארט-אפ של בקר פונקציונלי, שנקרא FunController.
- בכרטיסייה זו עיבוד ', בחרו ' חלון הדמיה תפקודית ולהגדיר את פרוטוקול גירוי (משך וניטור על תקופות, התואם הפרדיגמה משומשים).
- בחר חלון פרוטוקול (dataset עם מסגרות 600), להוסיף את הערך של 40 הכרטיסיה על תקופת ו 20 היחידים את תקופת לחץ על הכרטיסיה ' היפוך ' ייחוס וגרור את המחוון גירוי הברית שמאלה כדי לבחור ערך 1.
- בחלון preprocessing, לחץ על המסנן חציון במישור עבור preprocessing חציון מסנן (2D, 3D) עבור postprocessing.
- לחץ על הכרטיסייה Execute וגרור את סמנים כדי להתאים את טבלת בדיקת המידע ' כיסוי '. דמיינו את האזור במוח מופעל (איור 4B).
7. פרוטון גברת רכישות
- לעמדה נכונה את הגליל משטח, לשנות את המיקום של ראש עכברוש. לסובב את הראש (כ 30° עם כיוון השעון) כך ניתן למקם את הגליל פני השטח (איור 5A) מעל קליפת חבית שמאלה בעת היותו אופקי, ממוקם במרכז מגנט כאשר בתוך המגנט.
- למקם את הגליל משטח, לתקן את זה על המוח עכברים באמצעות הקלטת (איור 5B), ולבדוק המפרש עוברת בצורה נכונה (anteroposterior תנועה ללא סיבוב, אין חיכוך של המפרש) כאשר מערכת אוויר-פאף היא מופעלת על; אז תכבה אותו ליד המתג הראשי
- בדוק המפרש הנעה כראוי לאחר המיטה בתוך המגנט מופעלת מערכת אוויר-פאף. לאחר מכן, כבה את זה.
- בדוק שהחולדה ממוקם כהלכה באמצעות רצף לוקליזציה. הגדר פרמטרים כדלקמן: טה = 2.5 ms; TR = 100 ms; ממוצע = 1; חזרה = 1; פרוסה = 1 מ מ; תמונה בגודל = 256 x 256; FOV = 50 x 50 מ מ; סריקה זמן = 12 s 800 ms.
- גרור את הכרטיסיה רצף מאתר לתוך חלון הוראה שם ולחץ על הכרטיסייה ' המשך ' כדי להפעיל את תוכנית הסריקה.
- כאשר ההתאמה המוח שלו נכונה, גרור את הכרטיסיה רצף T2_TurboRARE בחלון שם הוראה ולחץ על המשך לבצע את תוכנית הסריקה. אלה תמונות אנטומיות, יחד עם רכישת fMRI מודגש הקודם, יאפשר ההתאמה הנכונה של voxel ב S1BF גברת.
הערה: הפרמטרים T2_TurboRARE הם 14 פרוסות, 2 מ מ לכל פרוסה, FOV = 2.5 x 2.5 ס"מ, טה = 100 ms, TR = 5,000 ms, מטריקס = 128 x 128, רצף זמן = s 2 דקות 40. - גרור את הכרטיסיה רצף לייזר לתוך חלון הוראה שם , מקום את voxel (2 מ מ, באורך 2.5 מ מ, 3 מ מ עמוקה) במרכז של אזור S1BF.
- השתמש אטלס מוח של עכבר של שיפור fMRI מודגש כדי להתאים לשפה האזור על תמונות T2 (איור 6). לחץ על הכרטיסיה התאמה פלטפורמה כדי לפתוח את ההוראה סריקה הערוך. לחץ על הכרטיסייה לנענע ולשנות את עכבה (טעינה אלקטרוני) של הסליל קבל מעט לכוון אותו. לחץ על הכרטיסיה החל לאחר כוונון סיום כדי לסגור את עורך הוראה ולהחיל את השינויים שנערכו הוראה.
- להקליט את מפת0 B והמשך לסרוק shim ולבצע, ואז, פחית מקומיים.
הערה: עבור המפה0 B, השתמש בפרמטרים הבאים: לראשונה אקו = 1.65 ms; TR = 20 ms, ממוצע = 1; הפוך זווית = 30 מעלות; אקו ריווח = 3.805 ms; פרוסה = 58 מ"מ; תמונה בגודל = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 מ מ; סריקה זמן = 1 מ' 24 גברת s 920 עבור ה-shim סריקה, השתמש בפרמטרים הבאים: voxel עירור סלקטיבי אדים הדופק לפי עקומת גאוס; טה = 5 מילי-שניות; ערבוב זמן = 10 ms; משך רכישת = 204.8 ms; רוחב פס = 10,000 הרץ; זמן להתעכב = 50 μs. עבור ה-shim מקומי, השתמש בפרמטרים הבאים: מים דיכוי, אדי משך רכישת = 1,363.15 ms; נקודות = 4,096; רוחב הפס ב- Hz = 3,004.81 הרץ; רוחב הפס של ppm = 10 עמודים לדקה; זמן להתעכב = 166.40 μs; רזולוציה ספקטרלי = הרץ 0.37/נקודות. הפרמטרים לייזר הם: הד הזמן = 19.26 ms; TR = 2,500 ms; חישוב ממוצע = 128 או 32; סריקה זמן = 5 דקות 20 s או s 1 דקות 20; נקודות רכישה = 4,096. - לבצע 1H-גברת.
- להתחיל את 1H-גברת רכישה לראשונה במהלך תקופת מנוחה (4 x 32 סריקות לייזר + 128 לייזר סורק; ms 2,500 לכל סרוק).
- לרכוש עוד רצף לוקליזציה (כמו השלב שמתואר אחד 5.3) להשוות עם הראשון הוקלט ולוודא כי החולדה לא עברה במהלך רכישת לייזר.
- לבצע 1H-גברת במהלך ההפעלה משערה באמצעות הרצף לייזר (4 x 32 סריקות לייזר + 128 לייזר סורק; ms 2,500 לכל סרוק) עם מערכת אוויר-עלים על (פרדיגמה = 20 s של הפעלה ו 10 s של מנוחה).
- שוב פעם, לבצע רצף לוקליזציה כדי לבדוק אם החולדה עברה.
הערה: מספר סריקות ותקופות נח/הופעלו יכול להיות מותאם ולשנות, אך תמיד להבטיח החולדה לא נע על ידי בקביעות ביצוע רצף לוקליזציה.
- להביא את המיטה למיקומו הראשוני, להסיר את הגליל משטח ולהזיז את החולדה בחזרה לספסל. מזריקים atipamezole לתוך קיפול העור ב השבים של החולדה הפוך ההרדמה ומעוררות אותה.
8. פרוטון גברת עיבוד
- פתח את תוכנת LCModel ולחץ על הלשונית המתאימה כדי לבחור את סוג הנתונים הנכון (קובץ. דעיכה אינדוקציה חינם ), בחר את הקובץ המתאים. לחץ על הכרטיסיה אישור כאשר זה נעשה.
- למטב את הפרמטרים שליטה כימות צעד אחר צעד.
- במקטע כותרת , באופן ידני הזן כותרת ולהגדיר טווח עמודים לדקה נאותה (למשל, 0.2 ל 4.0 ppm) על-ידי הקלדת באופן ידני הערך הדרוש בשדות המתאימים.
- במקטע קובץ בסיס , בחר ולהוריד את הקובץ הדרוש כדי להתאים את התוכנית הבסיסית מקרומולקולה כראוי (זה יכול להתבצע באמצעות ספק התוכנה).
- להגדיר ולטעון את הפרמטרים פקד קלט. להכין שמור תהליך של כל סוגי הקבצים שימושית מראש (טבלה = טבלאות קומפקטית; נ. ב = פלט PostScript הכרחי; CSV = תבנית עבור גליונות אלקטרוניים; קואורדינטות = קואורדינטות עבור המגרשים). לחץ על הכרטיסיה RunLCModel להתחיל כימות LCModel.
- הגדר מטבוליטים שנבחר כדי להפיק סטטיסטיקה.
הערה: LCModel מספק מטבוליט כמת, הערכות שגיאות על-ידי ערך כינה קרמר-ראו התחתונה מאוגד (CRLB). ערך עם CRLB < 15 נחשב כמת האופטימלית. CRLB > 25 מציין ערך לא אמין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר כימות של המטבוליט תנודות במהלך ההפעלה מוחי, אשר מתקבל על ידי גירוי משערה נכון ישירות בהמגנט.
במחקר זה, הייתה המטרה הכוללת של fMRI מודגש כדי לבדוק כי הגירוי משערה היה יעיל, כדי להמחיש את האזור S1BF מופעל, כראוי לאתר את voxel 1H-fMRS. המתקן נבנה עבור הפעלה לעזאזל יעיל. ואכן, כאשר שפם נכון היו מגורה באמצעות מערכת אוויר תוצרת בית-פאף, אות מודגש חיובי זוהה בקליפת חבית שמאלה (איור 4B), המכונה גם את S1BF, עבור השדה חבית המגע (n = 8). שיפור חיובי אות זוהה קליפת חבית שמאלה בחולדות שמונה מתוך שמונה, ואילו רק רקע זוהה את ההמיספרות הנכון. כאשר מודגש fMRI בוצעה ללא גירוי שפם, אין שיפור האות נצפתה שמאלה או ימינה S1BF.
השוואה בין תמונות אנטומיות מר עכברוש המוח אטלס ערכות8, האזור במוח מופעל דמיינו ידי fMRI מודגש מאפשרת את voxel שימוקם באזור S1BF, אשר מופעל במהלך גירוי שפם. Voxel הזה ממוקם על שלוש שקופיות ברציפות (1 מ מ עבה) מאז קליפת חבית הוא באורך של 3 מ מ. כאשר השקופית המוח מחולק כמעט ארבעה רבעונים, voxel ממוקם העליון מצד שמאל רבע-כ 45° זווית (איור 6).
כאשר הפרדיגמה לגירוי משערה היה מופעל, עלייה לקטט תוכן נצפתה ב S1BF השמאלי (איור 6, ספקטרום אופייני ב עכבר אחד). כדאי להמחיש מטבולית תנודות בין מנוחה, מופעל תקופות, חיסור ספקטרלי בוצעה (איור 6). מן הספקטרום החיבור הזה, הגדלת לקטט תוכן עם הפעלה מוחית היה מדמיין ביתר קלות, בעוד העכבר הזה, האות N-acetylaspartate (לאמילי) מעט ירדו. לקטט עלייה במהלך גירויים עצביים נצפתה גם על deconvolution ספקטרלי (איור 7 אב'). בזמן הפסגה לקטט זוהה בקושי על הספקטרום ויוו במנוחה, LCModel הצליח לכמת את זה (איור 7 א) עם דיוק וערכים CRLB טוב. ואכן, מתוך 23 חולדות, רק. בתנאי היה ערך CRLB על כימות לקטט שווה ל- 24. אף אחד לא היה > 25. עבור כל שאר ספקטרה, הערכים נע בין 3 ו- 19.
הווריאציות לקטט בתוכן כל העכברושים 23 מוצגים באיור8. מתוך 23 חולדות, נצפתה ירידה ברמת חומצת החלב תוכן רק ב עכבר אחד. היה הבדל משמעותי סטטיסטית ב לקטט תוכן בין נח מופעל תקופות (0.132 ± ± 0.163 ו- 0.012 0.011, בהתאמה, ערכים קרובים PCr + Cr תוכן, מזווגים t-לבדוק, p = 0.0005 [פרמטרית, דו-זנבית] n = 23). לכן, נמדדה עלייה 7.8% 31.6% ± לקטט תוכן במהלך גירויים עצביים.
ירידה קלה לאמילי תוכן יכול להיות שנצפו ב- איור 6, אשר מייצג את ספקטרום אופייני ב חיה אחת. עם זאת, זו וריאציה לאמילי לא היה משמעותי (נמדדה ירידה של 1.2% ± 1.2%, n = 23).
איור 1: ציוד, שלבי הרדמה. (א) תמונה של הציוד להיות מוכנים לפני תחילת ההרדמה. (B) איזופלוריין קאמרית המשאבה, אינדוקציה. (ג) עורקים השמה. (ד) התמונה מראה שהצנתר הוכנס כראוי; הערה את טיפת דם במחט קטטר, אשר היא סימן חיובי במיקום הנכון בווריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: גירוי שפם. . בסדר. שפם לכודים מפרש עם קלטת נייר. המפרש מאפשר שפם בסדר להיות מגורה בו-זמנית עם מערכת אוויר-פאף, לכן, ממקסם את ההפעלה עצביים של קליפת חבית. השקע של מערכת אוויר-פאף (צינור שחור) צריך להיות ממוקם סביב 1.5 ס מ, מאונך המפרש. לבדוק מחוץ המגנט כדי לוודא את המפרש זז כראוי על-ידי הפעלת מערכת אוויר-פאף. המפרש עליך להעביר ב- 8 הרץ לכיוון anteroposterior (ללא סיבוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מערכת אוויר-פאף לגירוי שפם. צינור גמיש (א) A מתחבר באוויר דחוס כדי (ב') ברז חשמלי שליטה. צינור גמיש השני מביא אויר ממרסס מפוח מהפלט שסתום פקד סולנואיד המפרש. ברז חשמלי שליטה מחובר המכשיר בצים, אשר שולטת הפרדיגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: fMRI מודגש. (א) אמצעי מערך השמה סליל. ראש חולדה נמצא במצב אופקי, נחסם על ידי האוזן ברים. בדוק המפרש נע בחופשיות אינה חסומה על ידי הסליל או המיטה MRI. (B) מודגש טיפוסי אותות בקליפת מופעל חבית שמאלה (חץ אדום). אין אות זוהה האונה הימנית contralateral (חץ כחול). הסף מוגדר ב- 76.5% של המרבי של הערך בעוצמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: סליל השטח. (א) תמונה של הסליל השטח השתמשו במחקר זה. השמה סליל משטח (B). ראש חולדה לפעול מעט כך קליפת חבית שמאלה ולכן הסליל השטח ממוקמים במרכז המיטה MRI (הראש מופעל בזווית של 30 מעלות, פשרה טובה בין המיקום הנכון של קליפת חבית שמאלה בשביל לגלוש סליל ce ותנועות חינם של המפרש של ויסקרס נכון, אשר אין לחסום ליד המיטה MRI). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: 1H-גברת במנוחה (הספקטרום הכחול), במהלך ההפעלה משערה (ספקטרום אדום) מקומי טיפוסי. Voxel (ריבוע ירוק) ממוקם את S1BF השמאלי על התמונות T2_TurboRARE אנטומיים באמצעות עכבר המוח אטלס ערכות ושיפור אות בתמונות fMRI מודגש. חיסור ספקטרלי מותווים בשחור. N-acetylaspartate (לאמילי) פסגות ו לקטט נקובים ב- 1.32, 2.02 ppm, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: טיפוסי deconvolution ספקטרלי של גברת ספקטרה. (א) Deconvolution של קשת מנוחה 128-scan. (B) Deconvolution של 128-סריקה מופעל בספקטרום. שאריות, חיסור בין ספקטרום ניסיוני (נתונים גולמיים), את התאמת LCModel; מ מ = מקרומולקולה; Cr = קראטין + phosphocreatine; PCho + GPC = phosphocholine + glycerophosphocholine; לאמילי = N-acetylaspartate; לאק = לקטט; גאבא = γ-אמינו בוטירית; אך זה לא נגמר = גלוטמין; Glu = גלוטמט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: וריאציות של לקטט תוכן במהלך גירוי מוחי. נקודה כחולה: לקטט התוכן במצב מנוחה, נקבע על-ידי LCModel ועל יחסית על קראטין + phosphocreatine תוכן. נקודה אדומה: לקטט תוכן במהלך גירוי משערה, נקבע על-ידי LCModel ועל יחסית על קראטין + phosphocreatine תוכן. ההבדל בין מופעל ולנוח, p = 0.0005, מזווגים t-test (פרמטרית, דו-זנבי), n = 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קליפת חבית, הנקרא גם S1BF של קליפת המגע או חבית השדה, הוא אזור בתוך שכבת קורטיקלית הרביעי זה יכול להיות שנצפו באמצעות ציטוכרום c אוקסידאז מכתים9, הארגון שלו היא ידועה מאז זה מתואר בעיקר 10,11. Vibrissa אחד מחובר חבית אחת, שבו נוירונים בסביבות 19,000 מאורגנים גם עם עמודה12. מסלול שפם-כדי-חבית קליפת יש מספר יתרונות. קודם כל, זה יכול להיות מופעל בתוך המגנט באמצעות מערכת אוויר-פאף התואמים ל- MRI, אשר ניתן בקלות תוצרת בית (כדי להבטיח כי בחלק הגדול ביותר של אזור S1BF, אשר תואמת בקירוב לגודל של voxel שבו מבוצע גברת, כל שפם נדחקות מפרש המאפשר הגירוי של לכל היותר vibrissa). שנית, נכון משערה הפעלת מוביל חבית שמאלה קליפת הפעלה, והוא ממוקם באזור זה במוח קליפת המגע, אשר מאפשר השימוש של סליל משטח רגיש גבוהה. שלישית, שיטה זו של הפעלת קליפת המגע הוא לא פולשנית בהשוואה ל גירוי חשמלי כפת, שיש האחרון החיסרון של עירור מבנים אחרים של המוח, כולל האונה הימנית13. לכן, פרוטוקול המשמש כאן הוא ללמוד המתאים ביותר לביצוע של ויוו, לא פולשנית, האורך והרוחב של חילוף החומרים במוח תחת הפעלה מוחית.
הבחירה של הרדמה היא קריטית, כמו רבים של חומרי הרדמה לגרום לשינויים נוירו-וסקולריים צימוד, חילוף החומרים במוח, ו/או המוח פעילות14,15. לדוגמה, איזופלוריין, ההרדמה הנפוץ ביותר MRI, מובילה 3-ל sixfold עלייה המוח לקטט תוכן15,16 והוא, לכן, לא אמור לשמש במחקרים מטבולית במוח. Medetomidine הוא אגוניסט α2-adrenoreceptor, אשר גורם אמין הרגעה, שיכוך כאבים, הרפיית שרירים, anxiolysis17. אלה תופעות הפיכות במהירות באמצעות atipamezole, אנטגוניסט-α2. Medetomidine הוא המועמד הטוב ביותר לביצוע מחקרים פונקציונלי מכרסמים18 שכן יש השפעה נמוכה מאוד על האות מודגש ועל השינויים הנמוך בתוכן מטבוליט של המוח.
חשוב גם לעקוב אחר הפרדיגמה הפעלה משערה כראוי. מאז רכישות NMR האחרון מספר דקות, השימוש של תקופות רצופות הפעלה/מנוחה חיוני כדי להגביל את הקהיה של נוירונים באזור המוח מופעל. הפרמטרים של הפרדיגמה הזאת (20 s של הפעלת ואחריו תקופת מנוחה של 10 s) נבחרו כדי לקבל את האות fMRI מודגש הגבוהה ביותר בקליפת חבית המתאימים. הרבה חייבים להקפיד לכבד את חלונות הזמן אלה שכן הוא קריטי לקבוע את תקופת מופעל/מנוחה לטיפול מודגש, גם אם הוא נשלט על ידי הנמל TTL. כדי להשיג רמה גבוהה של חבית קליפת ההפעלה, המפרש את הקבוצות נכון יחד חשוב גם שכן הוא מאפשר את החלק הגדול ביותר של האזור S1BF להיות מגורה. הרבה חייבים להקפיד למקם את צינורית אוויר אאוטלט מול זו מפרש כך זה יכול להמשיך הלאה מטוס anteroposterior. התדירות צריך להיות מכויל בקפידה, שכן הוכח כי נוירונים בקליפת חבית מופעלים כאשר תדירות גירוי משערה היא בין 5 ל-15 הרץ19. באמצעות תדר נמוך יותר או גבוה יותר לא יוביל ההפעלה של אזור S1BF.
פרוטוקול השתמשו במחקר זה מאפשר להשוות ספקטרה רכשה המוח באותו אזור מנוחה ובעת גירוי מוחי ומשנה, לכן, כדי לנטר מטבולית הפעלה מקושר מוחי. חשוב לבצע רצף לוקליזציה בהתחלה ובסוף של פרוטוקול ספקטרוסקופיה NMR, כדי להבטיח כי החיה לא עברה כי ההבדלים בתוכן מטבולית נמדד בין המדינות מנוחתו, מופעל נובעים המוח גירוי ולא חפצים התנועה.
עלייה לקטט תוכן באמצעות פרוטוקול המתואר במסמך זה, נמדד בין נח ומופעל תקופות. לקטט עלייה באמצעות ויוו NMR ספקטרוסקופיה במהלך הפעלת המוח נצפתה לראשונה בבני ה-9020,מוקדמת21. עם זאת, רוב המדידות בוצעו בני אדם יותר מאשר מכרסמים, שבו יחס אות לרעש הוא נמוך בהרבה. בחולדה, שמחוץ NMR כימות של לקטט במהלך הפעלת המוח עכברוש בוצע על ידי. Mazuel et al. 22, אשר נצפתה עלייה המוח לקטט תוכן עם הפעלת עצביים. התוצאות המובאות כאן מראים לקטט זה היה גדל במהלך ההפעלה שפם. עם זאת, מאז גברת מקומי אינו מאפשר רזולוציה הסלולר, זה עדיין לא ידוע של לקטט תא הסלולר אשר מגיע (הנוירונים או האסטרוציטים). ללכת רחוק בהבנה של הבורסות מטבולית במוח, כגון עדיין לדיון ANLSH (אסטרוציט-נוירון לקטט הסעות השערה), פרוטוקול זה יש להחיל לבעלי מהונדסים עבור רכיבי מפתח ב מהמעבורת, כגון מסועי monocarboxylate.
במחקר המתואר כאן, אין הבדל משמעותי סטטיסטית בתוכן לאמילי נצפתה. ירידה לאמילי תוכן במהלך גירוי חזותי שנמצאו בעבר בני23,24,25, אך אינו מאושר על ידי מנג'ה, Tkac26. במחקר הנוכחי, הבחנו עלייה לאמילי תוכן במהלך הפעלת המוח ב- 50% של החולדות, ירידה לחצי השני. לכן, יש להימנע לאמילי כהפניה פנימי על כימות במהלך לא גברת פונקציונליים אחרים וריאציה בתוכן מטבוליט זוהה.
שניהם לקטט, לאמילי וריאציות במהלך ההפעלה עצביים הובילו המחלוקות23,26,27,28,29. כדי לקדם את ההבנה שלנו של תנודות מטבולית אלה קשורה פעילות מוחית, יהיה מעניין ליישם פרוטוקול זה לבעלי חיים מהונדס. זה לספק מידע נוסף אודות תהליך המשמש כבסיס. באופן כללי, מקומי 1H-גברת במהלך משימה, או גברת פונקציונלי29, הוא המתעוררים הטכניקה בחולדות, רלוונטיים במחקר של שינויים דינמיים אזוריים מטבוליטים, במוח רגיל או פתולוגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענק שובל LabEx, ההתייחסות ANR-10-LABX-57, הצרפתי-שוויצרי ANR-FNS להעניק הפניה ANR-15-CE37-0012. המחברים מודים Aurélien Trotier על התמיכה הטכנית שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL syringe with needle | Becton, Dickinson and Company, USA | 2020-10 | 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm |
| 1H spectroscopy surface coil | Bruker, Ettlingen, Germany | T116344 | |
| 7T Bruker Biospec system | Bruker, Ettlingen, Germany | 70/20 USR | |
| Arduino Uno based pulsing device | custom made | ||
| Atipamezole | Vétoquinol, S.A., France | V8335602 | Antisedan, 4.28 mg |
| Breathing mask | custom made | ||
| Eye ointment | TVM laboratoire, France | 40365 | Ocry gel 10 g |
| Induction chamber | custom made | 30x17x15 cm | |
| Inlet flexible pipe | Gardena, Germany | 1348-20 | 4.6-mm diameter, 3m long |
| Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3 | Surgivet, Harvard Apparatus | WWV90TT | from OH 43017, U.S.A |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Vertflurane, Virbac, France | QN01AB06 | 1000 mg/mL |
| KD Scientific syringe pump | KD sientific, Holliston, USA | Legato 110 | |
| LCModel software | LCModel Inc., Ontario, Canada | 6.2 | |
| Medetomidine hydrochloride | Vétoquinol, S.A., France | QN05CM91 | Domitor, 1 mg/mL |
| Micropore roll of adhesive plaster | 3M micropore, Minnesota, United States | MI912 | |
| Micropore roll of adhesive plaster | 3M micropore, Minnesota, United States | MI925 | |
| Monitoring system of physiologic parameter | SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA | Model 1025 | |
| NaCl | Fresenius Kabi, Germany | B05XA03 | 0.9 % 250 mL |
| Outlet flexible pipe | Gardena, Germany | 1348-20 | 4.6-mm diameter, 4m long |
| Paravision software | Bruker, Ettlingen, Germany | 6.0.1 | |
| Peripheral intravenous catheter | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SP500930S | 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min |
| Rat head coil | Bruker, Ettlingen, Germany | ||
| Sodic heparin, injectable solution | Choai, Sanofi, Paris, France | B01AB01 | 5000 IU/mL |
| Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting | Burkert, Germany | 3099939 | Model type 6013 |
| Terumo 2 ml syringe | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SY243 | with 21 g x 5/8" needle |
| Terumo 5 mL syringe | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | 05SE1 | |
| Wistar RJ-Han rats | Janvier Laboratories, France |
References
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
- Pellerin, L., Magistretti, P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10625-10629 (1994).
- Cholet, N., et al. Local injection of antisense oligonucleotides targeted to the glial glutamate transporter GLAST decreases the metabolic response to somatosensory activation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 404-412 (2001).
- Voutsinos-Porche, B., et al. Glial Glutamate Transporters Mediate a Functional Metabolic Crosstalk between Neurons and Astrocytes in the Mouse Developing Cortex. Neuron. 37, 275-286 (2003).
- Zimmer, E. R., et al. [18F]FDG PET signal is driven by astroglial glutamate transport. Nature Neuroscience. 20 (3), 393-395 (2017).
- Haiss, F., et al. Improved in vivo two-photon imaging after blood replacement by perfluorocarbon. The Journal of Physiology. , (2009).
- Mullins, P. G. Towards a theory of functional magnetic resonance spectroscopy (fMRS): A meta-analysis and discussion of using MRS to measure changes in neurotransmitters in real time. Scandinvian Journal of Psychology. 59, 91-103 (2018).
- Rat Brain Atlas. , Available from: http://Labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/ (2018).
- Wong-Riley, M. T., Welt, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77, 2333-2337 (1980).
- Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56, 339-355 (2007).
- Cox, S. B., Woolsey, T. A., Rovainen, C. M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13, 899-913 (1993).
- Feldmeyer, D. Excitatory neuronal connectivity in the barrel cortex. Frontiers in Neuroanatomy. 6, 24 (2012).
- Boussida, S., Traore, A. S., Durif, F. Mapping of the brain hemodynamic responses to sensorimotor stimulation in a rodent model: A BOLD fMRI study. PLoS One. 12, e0176512 (2017).
- Heinke, W., Koelsch, S. The effects of anesthetics on brain activity and cognitive function. Current Opinion in Anesthesiology. 18, 625-631 (2005).
- Horn, T., Klein, J. Lactate levels in the brain are elevated upon exposure to volatile anesthetics: a microdialysis study. Neurochemistry International. 57, 940-947 (2010).
- Boretius, S., et al. Halogenated volatile anesthetics alter brain metabolism as revealed by proton magnetic resonance spectroscopy of mice in vivo. Neuroimage. 69, 244-255 (2013).
- Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Canadian Veterinary Journal. 44, 885-897 (2003).
- Weber, R., et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage. 29, 1303-1310 (2006).
- Hartmann, M. J., Johnson, N. J., Towal, R. B., Assad, C. Mechanical characteristics of rat vibrissae: resonant frequencies and damping in isolated whiskers and in the awake behaving animal. The Journal of Neuroscience. 23, 6510-6519 (2003).
- Prichard, J., et al. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during physiologic stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 5829-5831 (1991).
- Sappey-Marinier, D., et al. Effect of photic stimulation on human visual cortex lactate and phosphates using 1H and 31P magnetic resonance spectroscopy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 12, 584-592 (1992).
- Mazuel, L., et al. A neuronal MCT2 knockdown in the rat somatosensory cortex reduces both the NMR lactate signal and the BOLD response during whisker stimulation. PLoS One. 12, e0174990 (2017).
- Castellano, G., et al. NAA and NAAG variation in neuronal activation during visual stimulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 45, 1031-1036 (2012).
- Sarchielli, P., et al. Functional 1H-MRS findings in migraine patients with and without aura assessed interictally. Neuroimage. 24, 1025-1031 (2005).
- Baslow, M. H., Hrabe, J., Guilfoyle, D. N. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 32, 235-245 (2007).
- Mangia, S., Tkac, I. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 245-248 (2008).
- Baslow, M. H., Hrabal, R., Guilfoyle, D. N. Response of the authors to the Letter by Silvia Mangia and Ivan Tkac. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 247-248 (2008).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 347-350 (2018).
- Bak, L. K., Walls, A. B. CrossTalk opposing view: lack of evidence supporting an astrocyte-to-neuron lactate shuttle coupling neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 351-353 (2018).
