Pretargeted radio-immunothérapie basée sur la réaction de Diels-Alder demande Inverse d’électrons
Summary
Ce protocole décrit la synthèse et la caractérisation d’un trans– cyclooctène (TCO)-modification des anticorps et un radioligand de Lu marqué tetrazine (Tz) 177pour pretargeted radio-immunothérapie (Amel). En outre, il décrit en détail l’utilisation de ces deux concepts pour in vivo de biodistribution et études de thérapie longitudinale dans un modèle murin de cancer colorectal.
Abstract
Alors que radio-immunothérapie (RIT) est une approche prometteuse pour le traitement du cancer, la demi-vie longue pharmacocinétique des anticorps radiomarqués peut entraîner des doses élevées de rayonnement aux tissus sains. Peut-être sans surprise, plusieurs stratégies différentes ont été développés pour contourner cette limitation troublante. L’un des plus prometteurs de ces approches est pretargeted radio-immunothérapie (Amel). TRIOUX repose sur découplage le radionucléide de l’immunoglobuline, y injecter séparément et ensuite leur permettant de combiner in vivo dans le tissu cible. Cette approche exploite les propriétés exceptionnelles de ciblage tumoral des anticorps tout en longeant leurs inconvénients pharmacocinétiques, ainsi réduisant les doses de rayonnement aux tissus non ciblés et facilitant l’utilisation des radionucléides ayant une demi-vie qui sont considéré comme trop court pour utilisation en radioimmunoconjugates traditionnel. Au cours des cinq dernières années, notre laboratoire et autres ont mis au point une approche en vivo pretargeting basée sur la réaction de Diels-Alder (DADEI) inverse la demande électronique entre trans– cyclooctène (TCO) et tetrazine (Tz). Cette stratégie a été appliquée avec succès à pretargeted par émission de positrons (TEP) et d’émission monophotonique une tomodensitométrie (SPECT) d’imagerie avec une variété de systèmes d’anticorps-antigène. Dans une paire de publications récentes, nous avons démontré l’efficacité de base DADEI PRIT dans des modèles murins d’adénocarcinome ductal pancréatique et carcinome colorectal. Dans ce protocole, nous décrivons des protocoles pour TRIOUX utilisant un radioligand de Lu-DOTA-étiqueté tetrazine 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) et une variante modifiée de TCO du cancer colorectal ciblant les anticorps huA33 (huA33-TCO). Plus précisément, nous allons décrire la construction de huA33-TCO, la synthèse radiolabeling de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz et la performance in vivo la biodistribution des études longitudinales de la thérapie dans des modèles murins de carcinome colorectal.
Introduction
Radio-immunothérapie (RIT) — l’utilisation d’anticorps pour la prestation de radionucléides thérapeutiques aux tumeurs — est depuis longtemps une approche alléchante au traitement du cancer1,2. En effet, cette promesse a été soulignée par l’United States Food and Drug Administration approbation de deux radioimmunoconjugates pour le traitement du lymphome Non hodgkinien : 90Y-ibritumomab tiuxétan et 131tositumomab-j’ai3 , 4. pourtant, dès ses débuts, les perspectives cliniques de RIT ont été entravés par une complication critique : débits de dose de rayonnement élevée aux tissus sains5,6. En général, radioimmunoconjugates de RIT sont étiquetés avec des radionucléides à vie longue (p. ex., 131j’ai [t½ = 8,0 jours] et 90Y [t½ = 2,7 jours]) ayant une demi-vie physique qui conjugue bien avec les demi-vie longue pharmacocinétiques des immunoglobulines. C’est essentiel, car il garantit que la radioactivité suffisante reste une fois que l’anticorps a atteint sa biodistribution optimale après plusieurs jours de circulation. Toutefois, cette combinaison des temps de séjour prolongé dans le sang et la demi-vie longue physique entraîne inévitablement l’irradiation des tissus sains, ce qui réduit les rapports thérapeutiques et limitant l’efficacité de la thérapie7. Plusieurs stratégies ont été explorées pour contourner ce problème, y compris l’utilisation de fragments d’anticorps tronqué comme Fab, Fab’, f2, minibodies et nanocorps8,9,10. Un des plus prometteurs et fascinant, mais indéniablement complexe des approches alternatives est en vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting est une approche d’imagerie nucléaire et thérapie qui cherche à exploiter l’affinité exquise et la sélectivité des anticorps en longeant leurs inconvénients pharmacocinétiques11,12,13. À cette fin, l’anticorps radiomarqués utilisé en radio-immunothérapie traditionnel est déconstruit en deux composantes : une petite molécule radioligands et un immunoconjugué pouvant lier aussi bien un antigène tumoral et au radioligand susmentionné. L’immunoconjugué est injecté tout d’abord et donné une « longueur d’avance », souvent de plusieurs jours, au cours de laquelle il s’accumule dans le tissu cible et efface dans le sang. Par la suite, la petite molécule radioligand est administré et combine avec l’immunoconjugué à la tumeur ou efface rapidement de l’organisme. En substance, en vivo pretargeting invoque effectuant la radiochimie dans le corps lui-même. En réduisant la circulation de la radioactivité, cette approche a simultanément réduit les doses de rayonnement aux tissus sains et facilite l’utilisation des radionucléides (p. ex., 68Ga, t½ = 68 min211; Comme, t½ = 7,2 h) ayant une demi-vie qui est généralement considérées comme incompatible avec les vecteurs de base d’anticorps.
À partir de la fin des années 1980, une poignée de différentes approches in vivo pretargeting ont été développées, y compris des stratégies fondées sur des anticorps bispécifiques, l’interaction streptavidine / biotine et l’hybridation des complémentaires oligonucléotides14,15,16,17,18. Encore chacun a été freiné à des degrés divers par des complications, le plus célèbre est l’immunogénicité puissante des anticorps streptavidine-modified19,20. Au cours des cinq dernières années, notre groupe et autres ont développé une approche en vivo pretargeting basé sur le rapide et bioorthogonal électron inversée demande Diels-Alder ligature entre trans– cyclooctène (TCO) et tetrazine (Tz) 2122,de,23,24. Les plus réussis de ces stratégies ont employé un anticorps modifiés TCO et un radioligand Tz-roulement, comme le TCO est généralement plus stable en vivo que ses Tz partenaire (Figure 1)25,26. Comme dans d’autres méthodologies pretargeting, l’immunoconjugué mAb-TCO est administré d’abord et le temps pour effacer de la circulation et s’accumuler dans les tissus tumoraux. Par la suite, la petite molécule Tz radioligand est injecté, après quoi il clique avec l’immunoconjugué dans le tissu cible ou efface rapidement de l’organisme. Cette in vivo pretargeting stratégie a prouvé très efficace pour PET et SPECT imaging avec plusieurs systèmes différents anticorps/antigène, constamment produisant des images avec un contraste élevé et permettant l’utilisation de courte durées radionucléides tels que 18 F (t½ = 109 min) et 64Cu (t1/2 = h 12,7)21,22,24. Plus récemment, l’efficacité de click-basé pretargeted radio-immunothérapie (Amel) a été démontrée dans des modèles murins d’adénocarcinome ductal pancréatique (ACPE) et carcinome colorectal27,28. À cette fin, le radionucléide thérapeutique 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 jours) a été employé en conjonction avec deux types d’anticorps : 5 b 1, qui cible l’antigène glucidique 19,9 (CA19.9) ubiquitaire exprimée en ACPE , et huA33, qui s’adresse l’A33, une glycoprotéine transmembranaire exprimée en > 95 % des cancers colorectaux. Dans les deux cas, cette approche à 177Lu-Justine ont donné des concentrations d’activité élevé dans le tissu tumoral, créé un effet thérapeutique de la dose-dépendante et réduit simultanément les concentrations d’activité dans les tissus sains par rapport aux traditionnels directement marqués radioimmunoconjugates.
Dans cet article, nous décrivons les protocoles pour TRIOUX utilisant un radioligand de Lu-DOTA-étiqueté tetrazine 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) et une variante modifiée de TCO de l’anticorps huA33 (huA33-TCO). Plus précisément, les auteurs décrivent la construction de huA33-TCO (Figure 2), la synthèse radiolabeling de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz (Figure 3 et Figure 4) et la performance de in vivo la biodistribution et études longitudinales de la thérapie dans des modèles murins du cancer colorectal. En outre, dans les résultats représentatifs et de la discussion, nous présentons un ensemble de données d’échantillons, stratégies possibles d’adresse pour l’optimisation de cette approche et considérer cette stratégie dans le contexte plus large d’en vivo pretargeting et PRIT. Enfin, il est important de noter que tandis que nous avons choisi de mettre l’accent sur pretargeting en utilisant huA33-TCO et [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz dans le présent protocole, cette stratégie est très modulaire et peut être adapté pour répondre à un large éventail d’anticorps et radionucléides.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’un des points forts de cette approche en vivo pretargeting — en particulier en ce qui concerne les stratégies fondées sur des anticorps bispécifiques et radiomarqué haptènes — est sa modularité : trans– cyclooctène fractions peuvent être ajoutées à n’importe quel anticorps, et tetrazine radioligands peut être radioactif avec une extraordinaire variété de radionucléides sans nuire à leur capacité à réagir avec leurs partenaires de clic. Pourtant, l’adaptation de cette appro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Jacob Houghton pour les conversations utiles. Les auteurs tiens également à remercier le NIH pour leur généreuse contribution (R00CA178205 et U01CA221046).
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
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